高效毛細管電泳法測定大鼠血漿中頭孢地尼濃度及其藥動學(xué)研究

劉曉鳳，譚梅英，詹利之(1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院藥學(xué)部，廣州 510095;.廣東省第二中醫(yī)院/廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院藥學(xué)部，廣州 510095;.廣州中醫(yī)藥大學(xué)熱帶醫(yī)學(xué)研究所，廣州 510405)

高效毛細管電泳法測定大鼠血漿中頭孢地尼濃度及其藥動學(xué)研究

劉曉鳳1＊，譚梅英2，詹利之3(1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院藥學(xué)部，廣州 510095;2.廣東省第二中醫(yī)院/廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院藥學(xué)部，廣州 510095;3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)熱帶醫(yī)學(xué)研究所，廣州 510405)

目的:測定大鼠血漿中頭孢地尼濃度，并進行藥動學(xué)考察。方法:采用高效毛細管電泳法(HPCE)。使用熔融硅膠毛細管柱(75μm，總長為30 cm，有效長度為21.5 cm)，緩沖液為20mmol/L檸檬酸，進樣電壓為10 kV持續(xù)10 s，分離電壓為-20 kV，檢測波長為214 nm。取6只大鼠ig頭孢地尼溶液(20mg/kg)，分別于給藥前及給藥后0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、6、12、24 h經(jīng)尾緣靜脈取血0.2m L進行測定。采用BAPP 2.0軟件計算藥動學(xué)參數(shù)。結(jié)果:頭孢地尼質(zhì)量濃度在0.2～50μg/m L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.999 7)，定量下限為0.2μg/m L;日內(nèi)(n=6)、日間(n=3)精密度試驗的RSD均不大于12.2%;穩(wěn)定性試驗的RSD≤9.10% (n=6);方法回收率為95.4%～114.3%(RSD=9.0%，n=6);基質(zhì)效應(yīng)為63.5%～70.2%(RSD=10.39%，n=6)。頭孢地尼在大鼠體內(nèi)的t1/2為(0.54±0.01)h，MRT為(1.90±0.14)h，cmax為(32.92±0.81)μg/m L，tmax為(1.50±0.02)h，AUC0-24h為(46.65±0.44) μg·h/m L，AUC0-∞為(46.83±0.44)μg·h/m L。結(jié)論:該方法快速、準(zhǔn)確、簡便，可用于大鼠血漿中頭孢地尼濃度的測定及其藥動學(xué)考察。

頭孢地尼;高效毛細管電泳法;大鼠;藥動學(xué)

作為第三代口服頭孢菌素類抗菌藥物，頭孢地尼主要用于治療對其敏感的葡萄球菌屬、鏈球菌屬、肺炎球菌、消化鏈球菌、丙酸桿菌、淋病奈瑟氏菌、卡他莫拉菌、大腸埃希菌、克雷伯菌屬、奇異變形桿菌、普魯威登斯菌屬、流感嗜血桿菌等菌株所引起的感染[1-3]。其具有抗菌譜廣、抗菌作用強、臨床療效高、毒性低、過敏反應(yīng)少、方便使用等特點[4]。

目前，通常采用高效液相色譜(HPLC)法進行頭孢地尼的質(zhì)量控制和藥動學(xué)研究。但這些方法普遍存在樣品和溶劑消耗大、分析時間長、色譜柱相對昂貴且易被蛋白和干擾物質(zhì)堵塞的更換成本高等缺陷[5-7]。Li J等[7]采用柱切換HPLC法測定比格犬體內(nèi)頭孢地尼的血藥濃度，其中大部分雜質(zhì)被排除，且整體分析時間較短，但該方法使用的儀器設(shè)備需進行改裝，存在儀器設(shè)備較為昂貴、穩(wěn)定性較差等缺點。

高效毛細管電泳技術(shù)(HPCE)是在高壓電場作用下，帶電組分隨電場方向遷移的一種分離分析方法[8-10]。由于這種分離在狹小空間內(nèi)進行(內(nèi)徑為25～200μm、長度為30～70 cm的毛細管)，加之緩沖液的液流受電場推動而呈平面形，故具有較高的柱效。此外，待測物在該模式下，由于帶電量的不同可導(dǎo)致遷移速率的差異，進而實現(xiàn)分離，且受分子量與極性影響相對較小。因此，在本研究中，筆者采用HPCE法，測定大鼠血漿中頭孢地尼的濃度，并測定其藥動學(xué)參數(shù)，以期為其進一步應(yīng)用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Beckman P/ACEMDQ毛細管電泳儀，包括光電二極管陣列檢測器(190～600 nm)、P/ACE系統(tǒng)和MDQ工作站軟件(美國Beckman Coulter公司);YN-075365熔融硅膠毛細管(中國河北瑞灃色譜器件有限公司，375 mm×100mm，75μm)。

1.2 藥品與試劑

頭孢地尼膠囊(廣州白云山愛華制藥股份有限公司，批號:204350，規(guī)格:每粒0.1 g);頭孢地尼(批號: 1097614，純度:98%)、頭孢哌酮(內(nèi)標(biāo)，批號:C0684800，純度:98%)對照品均購自德國Sigma公司;甲醇、檸檬酸、氫氧化鈉等均為色譜純。

1.3 動物

SPF級SD大鼠6只，♀，體質(zhì)量220～240 g，購自廣東省實驗動物中心[許可證號:SYXK(粵)2015-0059]。

2 方法與結(jié)果

2.1 頭孢地尼和內(nèi)標(biāo)對照品貯備液的制備

精密稱取頭孢地尼和頭孢哌酮(內(nèi)標(biāo))對照品各10 mg，分別置于10m L量瓶中，加甲醇溶解、定容，即得頭孢地尼和頭孢哌酮質(zhì)量濃度均為1mg/m L的貯備液。

2.2 血漿樣品處理

精密吸取給藥后大鼠血漿100μL，置1.5m L離心管中，加入1mg/m L頭孢哌酮貯備液10μL，靜置5m in后加300μL乙腈，離心(離心半徑為12.15 cm，13 000 r/m in，下同)10m in。吸取上清液300μL，氮氣吹干，加甲醇100μL復(fù)溶，即得。

2.3 HPCE條件

分析柱:熔融硅膠毛細管(375mm×100mm);緩沖液:20mmol/L檸檬酸(含50mmol/L十二烷基硫酸鈉，pH為2.8);檢測波長:214 nm;分離電壓:-20 kV，進樣電壓:10 kV，持續(xù)10 s。分析前，用打火機燒去毛細管柱有效長度處的聚亞酰胺涂層以制備檢測窗。毛細管裝入儀器前，先連接蠕動泵，以0.1mmol/L的鹽酸溶液沖洗30min以去除管壁內(nèi)的雜質(zhì);沖水至pH為7.0后，以0.1mmol/L氫氧化鈉溶液沖洗1 h進行活化;再用水沖至流出液體顯中性(pH=7.0)，最后以緩沖液沖洗5 min。之后在儀器上使用緩沖液沖洗30min進行平衡，使用-20 kV電壓平衡直到電流穩(wěn)定。在此條件下，取空白血漿、給藥1.5 h后血漿+內(nèi)標(biāo)、空白血漿+內(nèi)標(biāo)依法處理，進樣測定。結(jié)果，理論板數(shù)以頭孢地尼計不低于3 000，分離度＞1.5，色譜圖見圖1。

圖1 高效毛細管電泳圖Fig 1 HPCE chromatograms

2.4 方法學(xué)考察

根據(jù)2015年版《中國藥典》(四部)通則9012“生物樣品定量分析方法驗證指導(dǎo)原則”相關(guān)規(guī)定進行方法學(xué)考察。結(jié)果，頭孢替尼質(zhì)量濃度在0.2～50μg/m L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.999 7);日內(nèi)(n=6)、日間(n=3)精密度試驗的RSD均不大于12.2%;方法回收率為95.4%～114.3%(RSD≤13%，n=6);穩(wěn)定性試驗(血漿于-20℃下冷凍8 h取出解凍，循環(huán)3次;25℃放置8 h;處理后置于自動進樣器中8 h)的RSD分別為5.36%、9.10%、8.82%(n=6);基質(zhì)效應(yīng)為63.5%～70.2%(RSD= 10.39%，n=6)。此外，采用HPCE法時，還需考察pH、緩沖液濃度和電壓等影響分離分析的參數(shù)發(fā)生輕微變化時對結(jié)果的影響(耐用性試驗)。本研究分別考察pH為4.1、4.5、4.9，緩沖液濃度為18、20、22mmol/L，分離電壓分別為18、20、22 kV情況下頭孢替尼的質(zhì)量濃度，結(jié)果，耐用性試驗的RSD≤4.60%(n=3)，待測物色譜峰與周圍干擾分離度符合要求(≥1.5)。

2.5 分組、造模與給藥

取6只SD大鼠，禁食12 h后ig頭孢地尼溶液(將頭孢地尼膠囊內(nèi)容物溶于生理鹽水中)，20mg/kg，給藥劑量根據(jù)預(yù)實驗確定，按人體的等效劑量換算。分別于給藥前及給藥后0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、6、12、24 h經(jīng)尾緣靜脈取血0.2m L，加肝素后離心10m in，取上清液，-20℃保存。

2.6 藥動學(xué)測定

采用BAPP 2.0軟件對大鼠體內(nèi)藥-時曲線進行非房室模型擬合，并根據(jù)所得數(shù)據(jù)自動計算出相關(guān)藥動學(xué)參數(shù)，結(jié)果見圖2、表1。

圖2 頭孢地尼在大鼠體內(nèi)的藥-時曲線Fig 2 Concentration-timecurveof cefdinir in rats in vivo

表1 頭孢地尼在大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)參數(shù)(±s，n=6)Tab 1 Pharm acokinetics param eters of cefdinir in rats in viv(o±s，n=6)

表1 頭孢地尼在大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)參數(shù)(±s，n=6)Tab 1 Pharm acokinetics param eters of cefdinir in rats in viv(o±s，n=6)

參數(shù)t1/2，h MRT，h cmax，μg/mL tmax，h AUC0-24h，μg·h/mL AUC0-∞，μg·h/mL頭孢地尼0.54±0.01 1.99±0.14 32.92±0.81 1.50±0.02 46.65±0.44 46.83±0.44

3 討論

3.1 HPCE條件優(yōu)化

綜合文獻報道和頭孢地尼的理化性質(zhì)及化學(xué)結(jié)構(gòu)[10-13]，筆者選取了分離電壓、pH和緩沖鹽濃度為指標(biāo)對頭孢地尼和內(nèi)標(biāo)與血漿蛋白等干擾性成分電色譜峰的分離度進行了考察。結(jié)果顯示，pH對分離度的影響最大，當(dāng)pH為2.6時，待測組分與干擾性成分的分離度最佳。其原因可能與頭孢地尼的化學(xué)結(jié)構(gòu)有關(guān):頭孢地尼的解離常數(shù)p K a1=1.9(羧基)，p K a2=3.3(2-氨噻哇環(huán)上的氨基)，p K a3=9.9(肟基)。由于熔融硅膠毛細管柱的酸堿承受范圍在pH 2.0～8.0之間，當(dāng)緩沖液pH低于3.3時，頭孢地尼分子可以得到充分解離，同時毛細管內(nèi)壁仍可保持穩(wěn)定。經(jīng)反復(fù)試驗，最終確定緩沖液最佳pH為2.6。分離電壓對HPCE分析也有較為顯著的影響，當(dāng)電壓較大時，各組分遷移速率較高，但所產(chǎn)生的焦耳熱也較大。綜合考慮柱效、穩(wěn)定性和整體分離效率，最后選取-20 kV為最優(yōu)分離電壓。緩沖鹽濃度的影響則主要體現(xiàn)在改變緩沖液pH和離子強度方面，除前述的pH影響外，該參數(shù)的變化也可以通過改變電滲流的方向?qū)Ψ蛛x產(chǎn)生影響。經(jīng)反復(fù)試驗，最終確定最優(yōu)緩沖鹽濃度為20mmol/L。

3.2 血漿樣品前處理方法優(yōu)化

根據(jù)文獻[10-13]報道，本研究對不同提取方法、提取溶劑和溶劑-血漿體積比進行了優(yōu)化。提取方法分別選取液-液萃取(LLE)和蛋白沉淀(PP)法，前者選用甲基叔丁基醚和乙酸乙酯為提取溶劑，溶劑-血漿比選擇4∶1和6∶1;后者采用甲醇、乙腈和6%高氯酸溶液為蛋白沉淀劑，溶劑-血漿比則選用3∶1和4∶1。筆者在預(yù)試驗中以提取回收率和最低定量限為指標(biāo)，分別考察上述條件下各方法提取目標(biāo)成分、排除基質(zhì)干擾的能力。結(jié)果顯示，采用蛋白沉淀法，以3∶1比例乙腈為沉淀劑時，頭孢地尼的提取回收率最高。在最低定量限方面，LLE法所制備樣品均不符合規(guī)定(信噪比＜10);PP法制備的樣品除6%高氯酸為沉淀劑外，均符合規(guī)定。綜上所述，最優(yōu)血漿樣品前處理方法最終確定為:采用溶劑-血漿比為3∶1的乙腈沉淀蛋白。

3.3 藥動學(xué)結(jié)果分析

頭孢地尼在動物和人體內(nèi)的藥動學(xué)研究已有文獻報道[5，14-16]。由于本研究采用大鼠作為實驗動物，其藥動學(xué)特征與文獻報道中所用的比格犬和人類志愿者有較大差異。在進行換算后，結(jié)果顯示t1/2、MRT、cmax、tmax和AUC0-24h等指標(biāo)均與文獻報道基本吻合，證明本研究可信度較高。

綜上，本研究采用HPCE法對大鼠血樣中的頭孢地尼進行了測定，同時進行了藥動學(xué)測定，所用方法快速、靈敏、高效，定量限較低，樣品和溶劑消耗極小，符合體內(nèi)藥物分析大通量、高靈敏、干擾成分眾多等特點，可作為HPLC法的有效補充。此外，由于HPCE采用電場為驅(qū)動力，待測物在微小空間內(nèi)進行遷移、分離和測定，相較傳統(tǒng)的液相色譜、質(zhì)譜等方法，更為節(jié)約、經(jīng)濟和環(huán)保。

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(編輯:劉明偉)

Determ ination of Cefdinir Concentration in Rat Plasma by High Perform ance Capillary Electrophoresis and Its Pharmacokinetics Research

LIU Xiaofeng1，TAN Meiying2，ZHAN Lizhi3(1.Dept.of Pharmacy，Cancer Hospital Affiliated to Guangzhou Medical University，Guangzhou 510095，China;2.Dept.of Pharmacy，Guangdong Second TCM Hospital/Guangdong Province Engineering Technology Research Institute of TCM，Guangzhou 510095，China;3.Institute of Tropical Medicine，Guangzhou University of TCM，Guangzhou 510405，China)

OBJECTIVE:To determine the concentration of cefdinir in rat plasma，and investigate its pharmacokinetics.METHODS:High performance capillary electrophoresis(HPCE)was adopted by using fused-silica capillary(75μm，total length of 30 cm，effective length of 21.5 cm)，buffer solution of 20mmol/L citric acid，injection voltage of 10 kV for 10 s，separation voltage of-20 kV，and detection wavelength of 214 nm.6 rats were intragastrically

cefdinir solution(20 mg/kg).0.2 m L blood sample was taken from the tail vein before and 0.25，0.5，1，1.5，2，3，4，6，12，24 h after adm inistration.BAPP 2.0 software was used to calculate the pharmacokinetics parameters.RESULTS:The linear range of cedinir ranged 0.2-50μg/m L(r=0.999 7)，lower limit of quantification was 0.2μg/m L.The intra-day(n=6)and inter-day RSDs of(n=3)precision testwere no more than 12.2%;RSD of stability test was no more than 9.10%(n=6);method recovery rate was 95.4%-114.3%(RSD=9.0%，n=6); matrix effectwas 63.5%-70.2%(RSD=10.39%，n=6).The t1/2of cefdinir in rats in vivo was(0.54±0.01)h，MRT was(1.90± 0.14)h，cmaxwas(32.92±0.81)μg/m L，tmaxwas(1.50±0.02)h，AUC0-24hwas(46.65±0.44)μg·h/m L and AUC0-∞was(46.83± 0.44)μg·h/m L.CONCLUSIONS:Themethod is rapid，accurate and simple，and can be used for the determination of cefdinir concentration in rat plasma and its pharmacokinetics research.

Cefdinir;High performance capillary electrophoresis;Rats;Pharmacokinetics

R917

A

1001-0408(2017)19-2658-04

2017-01-03

2017-05-03)

＊副主任藥師。研究方向:藥物分析。電話:020-66673666-2001。E-mail:liuxiaofengzlyy@126.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.19.19