去甲斑蝥素納米膠束的制備及抑瘤作用研究

王 琳，陸丹玉，方 晨(.蘇州衛生職業技術學院藥學院，江蘇蘇州 25009;2.蘇州大學醫學部藥學院，江蘇蘇州 252;.香港浸會大學中醫藥學院，中國香港)

去甲斑蝥素納米膠束的制備及抑瘤作用研究

王 琳1，2＊，陸丹玉1，方 晨3(1.蘇州衛生職業技術學院藥學院，江蘇蘇州 215009;2.蘇州大學醫學部藥學院，江蘇蘇州 215213;3.香港浸會大學中醫藥學院，中國香港)

目的:制備去甲斑蝥素納米膠束，并研究其抑瘤作用。方法:采用三嵌段共聚物二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-馬來酰亞胺在水中自組裝形成去甲斑蝥素納米膠束。觀察所制納米膠束形態，考察其載藥率、包封率、粒徑和Zeta電位。通過MTT法考察陰性對照組(磷酸鹽緩沖液)、載體組(空白納米膠束)、陽性對照組(去甲斑蝥素原料藥，5～320μg/m L)和去甲斑蝥素納米膠束組(以去甲斑蝥素計，5～320μg/m L)人肺癌A549細胞在作用不同時間(24、48、72 h)后的細胞生存率。將荷瘤裸鼠隨機分為空白對照組、去甲斑蝥素注射液組(1mg/kg)和去甲斑蝥素納米膠束低、高劑量組(0.5、1mg/kg)，每組6只，每天尾iv相應藥物1次，連續8周;每周測量腫瘤的大小，給藥結束后第2天檢測瘤質量。結果:去甲斑蝥素納米膠束呈圓球狀，載藥率為(2.82±0.05)%，包封率為(83.67±1.78)%，粒徑為(138.6±45.8)nm，Zeta電位為-(12.75±0.34)mV(n=6);載體組A549細胞生存率無明顯變化，陽性對照組和去甲斑蝥素納米膠束組A549細胞生存率明顯降低，與濃度和時間呈正相關，且去甲斑蝥素納米膠束組細胞生存率降低程度較陽性對照組更明顯(P＜0.01)。與空白對照組比較，3個給藥組裸鼠的瘤質量均減小(P＜0.05)，其中去甲斑蝥素納米膠束高劑量組減小程度較去甲斑蝥素注射液組更明顯(P＜0.05)。結論:成功制得去甲斑蝥素納米膠束，其對A549細胞具有較好的體內外抑瘤作用。

二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-馬來酰亞胺;去甲斑蝥素;納米膠束;抑瘤作用

去甲斑螯素(Norcantharidin)是將斑螯屬昆蟲南方大斑螯和黃黑小斑螯的蟲體所含的抗癌有效成分斑螯素(Cantharidin)1，2位去甲基而得的，是我國首先研制開發的具有一定潛力的抗腫瘤藥物[1-2]。但由于其毒性很大，在人工胃液及人工腸液中以去甲斑螯酸的形式存在[3-4]，水溶性增加，導致其口服生物利用度低，影響了其對腫瘤細胞的抑制和殺傷作用，限制了其臨床應用。本研究擬采用三嵌段共聚物二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-馬來酰亞胺(DSPE-PEG-MAL)制備在水中自組裝形成PEG在外、其他成分及藥物在內的去甲斑螯素納米膠束，并研究其抑瘤作用。

1 材料

1.1 儀器

Acquity超高效液相色譜儀(UPLC)，包括PDA Detector光電二極管陣列檢測器(美國Waters公司);激光散射粒徑測定儀(美國Beckman Coulter有限公司); 5417R冷凍臺式離心機(德國Eppendorf公司);倒置顯微鏡(德國Leica公司);IVIS Lum ina XR活體動物體內成像系統(美國Caliper生命科學公司);HT7700透射電鏡(日本Hitachi公司);連續光譜酶標儀(美國Bio-Rad公司)。

1.2 藥品與試劑

去甲斑螯素原料藥(南京澤朗醫藥科技有限公司，批號:20141206，純度:＞98%);去甲斑螯素對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號:100414-201501，純度: 100%);DSPE-PEG2000-MAL(美國Avanti公司，批號: 228234);大豆卵磷脂(美國AvantiPolar Lipids公司，批號:186969);膽固醇(美國Sigma公司，批號:C8667-25G，純度:94%);交聯葡聚糖G50(美國Pharmacia公司進口分裝，上海化學試劑廠，粒徑:100～300μm);胎牛血清、DMEM培養基、胰蛋白酶(美國Gibco公司);MTT (德國Merck公司，批號:475989);正辛醇、甲醇、無水乙醇等均為分析純，乙腈為色譜純。

1.3 細胞與動物

人肺癌細胞株A549和A549熒光酶素細胞株A 549-luc均購自上海睿星生物技術有限公司。BALA/C裸鼠36只，SPF級，♂，4～6周齡，體質量在19 g左右，購自香港中文大學實驗動物中心，動物編號為2015-0241。

2 方法

2.1 去甲斑蝥素納米膠束的制備

將一定比例的去甲斑螯素和DSPE-PEG2000-MAL，用一定量的乙醇超聲溶解后，以1滴/10 s的速度逐滴加入至磁力攪拌的蒸餾水中，揮發30m in，倒入透析袋中，封口，在1 000m L的蒸餾水中透析24 h，每4 h換1次水。最后將制得的聚合物納米膠束溶液4 000 r/min(離心半徑13.5 cm，下同)離心30min，取上清，即得去甲斑螯素納米膠束。其中，離心的目的是為了除去沉降在離心管底部的未包載的聚合物。同法制得不加去甲斑螯素的空白納米膠束。

2.2 去甲斑蝥素的含量測定

2.2.1 色譜條件色譜柱:BEH Shield RP-18(50mm× 2.1mm，1.7μm);流動相:0.02mol/L磷酸二氫鉀溶液(用磷酸調節pH至3.0)-甲醇(75∶35);檢測波長:213 nm;流速:0.6m L/m in;柱溫:35℃;進樣量:5μL。

2.2.2 方法學考察 精密稱取去甲斑螯素對照品適量，加磷酸鹽緩沖液(PBS)溶解制成一定濃度的對照品溶液，取對照品溶液和陰性對照溶液(PBS)進樣分析。另取經交聯葡聚糖G50分離后的去甲斑螯素納米膠束溶液和空白納米膠束溶液，加消解液超聲消解，定容，12 000 r/m in離心5m in，取上清液進樣分析，記錄色譜。另按方法學相關要求操作，考察去甲斑螯素的回歸方程、線性范圍、回收率、穩定性、精密度。

2.3 納米膠束的質量評價

2.3.1 載藥量與包封率 取去甲斑螯素納米膠束溶液適量，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定其中去甲斑螯素的含量，根據2015年版《中國藥典》(四部)中的相關規定[5]，計算載藥量和包封率。載藥量(%)=納米膠束中去甲斑螯素質量/納米膠束的質量×100%;包封率(%)=納米膠束中去甲斑螯素質量/去甲斑螯素的投藥量× 100%。

2.3.2 粒徑、Zeta電位與形態 取100μL的去甲斑螯素納米膠束溶液，用PBS稀釋至2m L，混勻，采用激光散射粒徑測定儀分析其粒徑和Zeta電位。采用磷鎢酸鈉溶液對納米膠束進行染色，透射電鏡下觀察其形態。

2.3.3 體外釋放度 取1份去甲斑螯素原料藥和3份相同質量的去甲斑螯素納米膠束，分別用蒸餾水定容至5 m L，置于透析袋中密封。將原料藥溶液置于裝有10m L含1%十二烷基硫酸鈉(SDS)的PBS(pH為7.4)的離心管中，將膠束溶液分別置于裝有10m L PBS(pH分別為6.5、7.0、7.4)的離心管中，(37±0.5)℃下以100 r/m in恒溫振蕩。分別于0、0.5、l、2、4、6、8、12、24、36、48、60、72 h取樣，每次將10m L釋放液全部倒出，同時補充10m L新鮮釋放介質。釋放液按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定去甲斑螯素含量，計算累積釋放度(Q)，以取樣時間(t)為橫坐標、Q為縱坐標繪制標準曲線。

2.4 體外抗腫瘤活性實驗

2.4.1 細胞培養 采用含10%胎牛血清的DMEM培養基，于37℃、5%CO2培養箱中培養A549細胞，待細胞生長達90%融合狀態時以0.25%胰蛋白酶消化，根據試驗需要接種于96孔板上。

2.4.2 細胞生存率測定 將A549細胞復蘇傳代，待生長狀態良好時，用胰酶消化，用含10%胎牛血清的DMEM培養液調整細胞密度為5×104m L-1，以每孔100 μL接種于96孔板中，在37℃、5%CO2培養箱中培養24 h后開始加藥。試驗分為4組，分別為(1)陰性對照組:只加PBS，不加藥物;(2)載體組:加空白納米膠束溶液; (3)陽性對照組:加質量濃度分別為5、10、20、40、80、160、320μg/m L的去甲斑螯素原料藥溶液(原料藥先溶解在二甲基亞砜中，再用PBS稀釋至所需質量濃度); (4)去甲斑螯素納米膠束組:加去甲斑螯素質量濃度分別為5、10、20、40、80、160、320μg/m L的去甲斑螯素納米膠束溶液(納米膠束用PBS稀釋至所需質量濃度)，每個質量濃度設3個復孔。加藥后繼續培養24、48、72 h，每孔再加入5mg/m L的MTT 20μL，培養4 h，取出，棄上清，加入二甲基亞砜150μL，振蕩15m in均勻溶解，在570 nm波長處測定OD值，計算細胞生存率。細胞生存率(%)=加藥組OD值/陰性對照組OD值×100%。分別對影響細胞生存率的藥物質量濃度作析因分析和單向方差分析，對藥物作用時間作重復測量的方差分析。

2.5 體內抗腫瘤活性實驗

2.5.1 荷瘤裸鼠模型建立 將A549-luc細胞復蘇，用含10%胎牛血清的DMEM培養液于37℃、5%CO2的培養箱中培養。待細胞生長至80%瓶底面積時，用0.25%胰蛋白酶消化，收集細胞于離心管內，1 000 r/m in離心5 min，棄上清，用PBS沖洗3次，用不含血清的DMEM培養液重懸細胞后調整細胞密度為5×106m L-1。將細胞懸液用注射器接種于裸鼠腋下，每只0.2m L。每次注射前將細胞搖勻，以保證腫瘤成瘤比較均勻;接種完成后用手指輕壓注射點，防止細胞外滲。所有細胞保證在2 h內接種完畢，所有操作均在無菌操作臺內進行。7 d后，所有裸鼠均成為荷瘤裸鼠。

2.5.2 體內抑瘤實驗 將荷瘤裸鼠隨機分成空白對照組(生理鹽水)、去甲斑螯素注射液組(1mg/kg)和去甲斑螯素納米膠束低、高劑量組(0.5、1mg/kg)，每組6只。給藥劑量是根據筆者前期的急性毒性實驗結果(裸鼠對于去甲斑螯素的最大耐受量為1mg/kg)設置的。接種成功后的第2天開始每天尾iv相應藥物1次，連續8周。從給藥的第1天起，每天觀察裸鼠的飲食、精神狀態，測量腫瘤長徑(a)和短徑(b)，按公式V=ab2/2估算腫瘤的近似體積(V，cm3)，繪制腫瘤生長曲線。給藥結束后的第2天，將荷瘤裸鼠處死，剝瘤，稱質量，計算抑瘤率，抑瘤率(%)=(對照組瘤質量-給藥組瘤質量)/對照組瘤質量×100%。采用SPSS 19.0軟件對數據結果進行單因素方差分析。P＜0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 去甲斑蝥素的含量測定方法學考察結果

系統適用性結果顯示，去甲斑螯素的保留時間在6.2m in左右，陰性對照溶液及空白納米膠束溶液對其測定均無干擾。去甲斑螯素峰面積(y)對質量濃度(x)的回歸方程為y=61.534x+169.99(r2=0.999 9，n=6)，線性范圍為25.41～813.12μg/m L;加樣回收率為(99.58± 1.95)%(n=6);10 h內穩定性試驗中含量的RSD為1.11%(n=6);去甲斑螯素低、中、高濃度的精密度試驗中峰面積的RSD分別為2.07%、1.31%、0.83%(n=6)，色譜圖見圖1。

3.2 納米膠束質量評價

去甲斑螯素納米膠束呈圓球狀、邊緣整齊、表面光滑，載藥量為(2.82±0.05)%，包封率為(83.67±1.78)%，粒徑為(138.6±45.8)nm，Zeta電位為-(12.75±0.34) mV(n=6)，透射電鏡圖見圖2。

3.3 體外釋放度

去甲斑螯素原料藥具有突釋效應，在2 h內Q已達80%，6 h內Q已達95%;去甲斑螯素納米膠束在不同pH釋放介質中均隨著時間延長緩慢持續釋放，釋放曲線呈拋物線形。pH為6.5、7.0時去甲斑螯素納米膠束呈現出比pH為7.4時更快的釋放速度。72 h時，去甲斑螯素納米膠束在pH 6.5、7.0、7.4釋放介質中的Q分別為(83.5±3.5)%、(80.0±1.6)%、(72.0±1.5)%(n=6)。累積釋放曲線見圖3。

圖1 超高效液相色譜圖Fig 1 UPLC chromatogram s

圖2 去甲斑蝥素納米膠束的透射電鏡圖(×12 000)Fig 2 Transm ission electron m icroscopy figure of NCTD nano-m icelle(×12 000)

圖3 累積釋放曲線Fig 3 Cum ulative release curves

3.4 體外抗腫瘤活性

結果顯示，載體組A549細胞生存率無明顯變化，陽性對照組和去甲斑螯素納米膠束組A549細胞生存率明顯降低，且與藥物濃度和作用時間呈正相關。其中，去甲斑螯素納米膠束組細胞生存率降低程度強于陽性對照組(P＜0.01)。各組A549細胞的細胞生存率測定結果見圖4。

圖4 各組A549細胞在不同作用時間后細胞生存率的測定結果(n=3)Fig 4 Determ ination results of the survival rates of A549 cells after acting for different tim e in each group(n=3)

3.5 體內抗腫瘤活性

實驗期間裸鼠一般情況良好，未見死亡。處死后解剖各器官均未見瘤轉移。各組荷瘤裸鼠移植瘤生長曲線見圖5，切除后各組裸鼠的腫瘤形狀見圖6。

圖5 各組荷瘤裸鼠移植瘤生長曲線Fig 5 Grow th curves of transplanted tumor of tumor nudem ice in each group

圖6 各組荷瘤裸鼠移植瘤的圖片Fig 6 Pictures of transp lanted tum or of tum or nude m ice in each group

由圖5所示，在給藥的前3周，空白對照組和所有給藥組裸鼠的腫瘤大小沒有顯著變化。從給藥第3周開始到第8周，空白對照組荷瘤裸鼠的瘤體積呈持續快速增長的趨勢;到第8周，空白對照組荷瘤裸鼠的呼吸非常困難。與空白對照組比較，去甲斑螯素注射液組和去甲斑螯素納米膠束低、高劑量組荷瘤裸鼠的瘤體積均減小(P＜0.05)，其中去甲斑螯素納米膠束高劑量組抑瘤率明顯高于去甲斑螯素注射液組(P＜0.05)。各組荷瘤裸鼠的體質量、瘤質量和抑瘤率的測定結果見表1。

表1 各組荷瘤裸鼠的體質量、瘤質量和抑瘤率的測定結果(±s，n=6)Tab 1 Determ ination results of body mass，tumor quality，tumor inhibition rate of tumor nude m ice in each grou(p±s，n=6)

表1 各組荷瘤裸鼠的體質量、瘤質量和抑瘤率的測定結果(±s，n=6)Tab 1 Determ ination results of body mass，tumor quality，tumor inhibition rate of tumor nude m ice in each grou(p±s，n=6)

注:與空白對照組比較，＊P＜0.05;與去甲斑螯素注射液組比較，#P＜0.05Note:vs.blank control group，＊P＜0.05;vs.NCTD injection group，#P＜0.05

組別空白對照組去甲斑螯素注射液組去甲斑螯素納米膠束低劑量組去甲斑螯素納米膠束高劑量組54.78 45.22 64.35#給藥前體質量，g 18.3±0.8 18.6±1.0 19.1±0.6 19.2±0.4處死時體質量，g 30.2±1.4 28.9±2.1 28.1±1.6 26.6±1.5瘤質量，g 1.15±0.14 0.52±0.12＊0.63±0.14＊0.41±0.21＊#抑瘤率，%

4 討論

去甲斑螯素的傳統劑型為片劑，盡管片劑在制備工藝上容易操作、成本低，但是不能解決去甲斑螯素生物利用度低、毒性強的缺點。國內研究學者為了解決去甲斑螯素存在的不足，將其制成了殼聚糖納米粒、脂質體等新劑型，但是目前國內將去甲斑螯素制成聚合物膠束的研究并不多。將去甲斑螯素制成納米膠束不僅可以具備納米制劑的靶向性，同時還能增加藥物的溶解性。載體材料DSPE-PEG-MAL的應用也是一個創新，其無毒性、無免疫原性、無抗原性以及可降解性和生物相容性的優點使其在生物醫學材料界備受青睞[6-8]。

本課題初步完成了去甲斑螯素納米膠束的制備、質量評價、體外抗腫瘤及體內抗腫瘤研究，表明其具有較好的體內外抑瘤作用。但是由于研究水平、實驗條件及實驗時間的限制，許多工作仍需要進一步完善。今后還將開展其藥動學研究，考察去甲斑螯素納米膠束在動物體內的組織分布，進一步驗證其對腫瘤組織的靶向性。

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Preparation of Norcantharidin Nano-m icelle and Study on Its Antitumor Effect

WANG Lin1，2，LU Danyu1，FANG Chen3(1.School of Pharmacy，Suzhou Vocational Health College，Jiangsu Suzhou 215009，China;2.School of Pharmacy，Medical College of Soochow University，Jiangsu Suzhou 215213，China;3.School of Chinese Medicine，HongKong Baptist University，HongKong，China)

OBJECTIVE:To prepare the norcantharidin(NCTD)nano-micelle and study its antitumor effect.METHODS: NCTD nano-micelle was self-formed in water using Triblock copolymers distearyl phosphatidylethanolamine-polyethylene glycol-maleimide;its shape was observed，the drug-loading rate，entrapment efficiency，particle size，Zeta potential were investigated.MTT was used to investigate the cell survival rate of human lung cancer A549 cells in negative control group(Phosphate buffer solution)，carrier group(blank nano-m icelle)，positive control group(NCTD APIs，5-320μg/m L)and NCTD nano-m icelle group (NCTD，5-320μg/m L)after acting different time(24，48，72 h).Tumor nude mice were random ly divided into blank control group，NCTD injection group(1 mg/kg)，NCTD low-dose，high-dose groups(0.5，1mg/kg)，6 in each group.Allmice were intravenously injected relevantmedicines in tail，once a day，for 8 weeks.Tumor size wasmeasured every week，and tumor quality was detected after the second day of finishing adm inistration.RESULTS:NCTD nano-m icelle was round，drug-loading rate was (2.82±0.05)%，entrapment efficiency was(83.67±1.78)%，particle size was(138.6±45.8)nm，Zeta potential was-(12.75± 0.34)mV(n=6).Cell survival rate of A549 cells in carrier group had no obvious changes，and was obviously decreased in positive control group and NCTD nano-micelle group，which was positively correlated w ith concentration and time.And the decrease degree of cell survival rate in NCTD nano-m icelle group was stronger than positive control group(P＜0.01).Compared w ith blank control group，the tumor quality of m ice in 3 adm inistration groups was reduced(P＜0.05)，the reduction degree in NCTD nano-micelle high-dose group was stronger than NCTD nano-micelle injection group(P＜0.05).CONCLUSIONS:NCTD nano-m icelle is successfully prepared，which has good in vitro and in vitro anti-tumor effect on A549 cells.

Distearyl phosphatidylethanolamine-polyethylene glycol-maleimide;Norcantharidin;Nano-micelle;Antitumor effect

R943;R361+.3

A

1001-0408(2017)19-2680-05

2016-10-27

2016-12-17)

(編輯:鄒麗娟)

江蘇省衛生廳科技項目(No.JZ201402)

＊副教授，博士研究生。研究方向:藥物新制劑。電話:0512-62693011。E-mail:wanglinlinda@126.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.19.25