miR-30a-5p對肺癌細胞增殖與遷移的影響及其機制*

邱會，胡敏，鐘敏鈺

（1.湖北省武漢市第一醫院 腫瘤科，湖北 武漢 430022；2.華中科技大學同濟醫學院附屬武漢中心醫院 血管外科，湖北 武漢 430000）

基礎研究·論著

miR-30a-5p對肺癌細胞增殖與遷移的影響及其機制*

邱會1，胡敏2，鐘敏鈺1

（1.湖北省武漢市第一醫院 腫瘤科，湖北 武漢 430022；2.華中科技大學同濟醫學院附屬武漢中心醫院 血管外科，湖北 武漢 430000）

目的研究miR-30a-5p對非小細胞肺癌（NSCLC）增殖和遷移的影響，并探討其調控機制。方法NSCLC A549細胞系分成兩組，miR-30a-5p組和對照組，分別轉染miR-30a-5p mimics和microRNA scramble，MTT實驗及細胞劃痕實驗分別測定兩組細胞增殖和遷移能力，實時聚合酶鏈反應（real time-PCR）和蛋白免疫印跡法（Western blot）分別測定兩組泛素蛋白連接酶（UBE3C）mRNA和蛋白質表達水平。結果培養48 h后，miR-30a-5p組相對活細胞百分比低于對照組（[203.7±16.8）%vs（330.4±20.7）%（P=0.000）]；培養72 h后，miR-30a-5p組相對活細胞百分比（258±30.2）%，對照組相對活細胞百分比（403.4±28.4）%，miR-30a-5p組相對活細胞百分比低于對照組（P=0.001）。細胞劃痕實驗示：miR-30a-5p組劃痕愈合率為（23.2±2.7）%，對照組劃痕愈合率為（89.2±4.8）%，miR-30a-5p組劃痕愈合率低于對照組（P=0.000）。real time-PCR顯示，miR-30a-5p組 UBE3C mRNA表達水平為（0.15±0.02），對照組UBE3C mRNA表達水平為（1.03±0.09），miR-30a-5p組UBE3C mRNA表達水平低于對照組（P=0.000）；Western blot顯示，miR-30a-5p組UBE3C蛋白表達水平為（1.57±0.26），對照組UBE3C蛋白表達水平為（5.32±0.42），miR-30a-5p組UBE3C蛋白表達水平低于對照組（P=0.000）。結論miR-30a-5p抑制NSCLC增殖和遷移，其機制與下調UBE3C表達有關。

miR-30a-5p；非小細胞肺癌；增殖；遷移

Abstract:ObjectiveTo investigate the role of miR-30a-5p on the regulation of the proliferation and migration of NSCLC,and its regulatory mechanism.MethodsA549 cells were divided into two groups,miR-30a-5p group(transfected with miR-30a-5p mimics)and control group(transfected with microRNA scrambles).The proliferation and migration ability was measured by MTT assay and wound healing experiment,respectively.The expression level of UBE3C mRNA and protein was measured by RT-PCR and Western blot.ResultsThe relative percentage of living cells in miR-30a-5p group was significantly lower than control group after culturing for 48 h,(203.7±16.8)%vs(330.4±20.7)%,P=0.000.There was(258±30.2)%of relative percentage of living cells in miR-30a-5p group,which was significantly lower than(403.4±28.4)%in the control group(P=0.001).The wound healing rate was (23.2±2.7%)in miR-30a-5p group,which was significantly lower than(89.2±4.8)%in the control group (P=0.000).RT-PCR indicated that the expression level of UBE3C mRNAwas(0.15±0.02)in miR-30a-5p group,which was significantly lower than(1.03±0.09)in the control group(P=0.000).The expression level of UBE3C protein was(1.57±0.26)in miR-30a-5p group,which was significantly lower than(5.32± 0.42)in control group(P=0.000).ConclusionsMiR-30a-5p inhibits cell proliferation and migration of non-small cell lung cancer cell by suppressing UBE3C gene expression.

Keywords:miR-30a-5p;non-small cell lung cancer;proliferation;migration

非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是肺癌的主要類型，惡性程度高[1-2]。目前，雖然得益于手術、放化療的進度，NSCLC治療效果有所進步，但其5年生存率仍不到15%[2]，腫瘤惡性增殖和遷移仍是影響預后的重要原因[3]。深入探討NSCLC增殖和遷移的機制對設計新的治療藥物具有重要的意義。miR-30a-5p是miR-30家族的成員之一，長度在 22 bp，在肝細胞癌[4]、神經膠質瘤[5]、乳腺癌[6]及結腸癌[7]中被報道調節增殖、凋亡、侵襲和遷移。但是miR-30a-5p在NSCLC發生、發展中的作用尚未見報道。選取2014年3月-2016年1月研究miR-30a-5p對NSCLC增殖和遷移的影響，并探討其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

DMEM培養基、胎牛血清及胰蛋白酶（購自美國Gibco公司），A549細胞（購自美國ATCC公司），Trizol（購自美國Invitrogen公司），實驗所需一抗（購自美國Santa Cruz公司），辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗（購自英國 Abcam公司），microRNA scrambles、miR-30a-5p mimics均由上海吉瑪公司定制合成，轉染試劑LiposomeTM2000（購自美國Invitrogen公司）。

1.2 細胞培養及轉染

將A549細胞加入DMEM培養基，于37℃、5%二氧化碳CO2培養箱中培養，48 h后傳代。將細胞分為miR-30a-5p組和對照組（Scrambles組），采用LipofectamineTM2000分別轉染miR-30a-5p mimics和microRNA scrambles，轉染后繼續培養24 h。

1.3 細胞增殖能力觀察

采用噻唑藍（MTT）法實驗，A549細胞以每孔1×105個細胞接種于12孔板中，培養過夜后行相應的轉染實驗。在培養中培養48和72 h后添加5 mg/ml的MTT溶液40 μl，孵育4 h后每孔加入200μl二甲基亞砜（DMSO），搖床上充分震蕩。490 nm波長測定吸光度值。相對活細胞百分比=（實驗組數值/對照組數值）×100%，實驗重復3次，取平均值，相對活細胞百分比越高，表示增殖能力越強。

1.4 細胞遷移能力觀察

采用細胞劃痕實驗。將兩組細胞培養于6孔板，待細胞融合后，用滅菌槍頭沿直線用力劃直線。劃痕后即刻和48 h在顯微鏡下觀察細胞劃痕修復情況，使用Wim Scratch在線圖像分析系統測定細胞劃痕面積，計算劃痕愈合率。劃痕愈合率=（劃痕后即刻的劃痕面積-劃痕后48 h的劃痕面積）/劃痕后即刻的劃痕面積×100%。實驗重復3次，取平均值。劃痕愈合率越高，表示細胞遷移能力越強。

1.5 RNA提取和實時聚合酶鏈反應

為測量泛素蛋白連接酶（Uniquitin-protein ligase，UBE3C）的mRNA水平，按照Trizol reagent（美國Invitrogen公司）說明書提取總RNA，將所得的RNA使用Im Pron-Ⅱ逆轉錄系統（美國Roche公司）逆轉錄。使用SYBR Green PCR master mix試劑（美國Roche公司）在ABI 7500實時PCR儀（美國ABI公司）中進行實時聚合酶鏈反應（real-time polymerase chain reaction，real time-PCR）。選取的引物如下：UBE3C（正向引物：5'-GTGCCCGGCTGCTTCCGC GGC-3'；反向引物：5'-CCTCCTTCCTGCTCGCGCCG CC-3'）。β-actin基因作為內參（正向引物：5'-TGCA CCCAGCACAATGAA-3'；反向引物，3'-CTAAGTCAT AGTCCGCCTAGAAGCA-5'）。

1.6 UBE3C蛋白表達測定

采用蛋白免疫印跡法（Western blot）。收集兩組細胞，加入裂解液提取細胞總蛋白，以每孔30 μg總蛋白上樣，濃縮膠80 V電泳40 min，分離膠100 V電泳2 h。常規濕法轉膜，5%脫脂奶粉封閉2 h；分別加入UBE3C抗體和GAPDH過夜，抗體稀釋度均為1∶200。加入二抗山羊抗鼠1∶1 000孵育2 h。ECL化學發光，凝膠成像系統顯影。用Quantity One 1-D分析軟件（美國Bio-Rad公司）對蛋白印跡條帶進行定量。以目的蛋白測定值與GAPDH的比值作為目標蛋白的相對表達量。

1.7 統計學方法

數據分析采用Graphpad 6.0統計作圖軟件，計量資料用均數±標準差（±s）表示，計量數據用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組轉染對細胞增殖的影響

培養48 h后，miR-30a-5p組相對活細胞百分比低于對照組[（203.7±16.8）%vs（330.4±20.7）%，t=-8.231，P=0.000]；培養 72 h 后，miR-30a-5p 組相對活細胞百分比（258±30.2）%，對照組相對活細胞百分比（403.4±28.4）%，miR-30a-5p組相對活細胞百分比低于對照組（t=-6.074，P=0.001）。見圖1。

2.2 兩組轉染對A549細胞遷移的影響

細胞劃痕實驗示，miR-30a-5p組劃痕愈合率為（23.2±2.7）%，對照組劃痕愈合率為（89.2±4.8）%，miR-30a-5p組劃痕愈合率低于對照組（t=-20.757,P=0.000）。見圖2。

2.3 miR-30a-5p對UBE3C基因表達的影響

real time-PCR示，miR-30a-5p組UBE3C mRNA表達水平為（0.15±0.02），對照組UBE3C mRNA表達水平為（1.03±0.09），miR-30a-5p組 UBE3C mRNA表達水平低于對照組（t=-16.532，P=0.000）；Western blot示，miR-30a-5p組UBE3C蛋白表達水平為（1.57±0.26），對照組UBE3C蛋白表達水平為（5.32±0.42），miR-30a-5p組 UBE3C 蛋白表達水平低于對照組（t=-13.149，P=0.000）。見圖3。

圖1 MTT法檢測兩組相對活細胞百分比

圖2 兩組劃痕后即刻和48 h在顯微鏡下觀察的細胞劃痕修復情況

圖3 兩組UBE3C mRNA和蛋白表達水平

3 討論

肺癌是個備受關注的全球性健康問題，在西方國家，發病率在逐漸下降，然而在中國，發病率卻在持續增長，并且在國內是常見的腫瘤致死性疾病，據國家腫瘤癌癥登記中心（national central cancer registry，NCCR）統計，在城市肺癌發病率為52.52/100 000人；在農村，發病率為39.54/100 000人，在所有腫瘤中排第1位。肺癌致死率在所有腫瘤中也排第1位，2010年肺癌死亡率為37/100 000人[8]。NSCLC是肺癌的主要病理類型，惡性程度高，在診斷時往往已經晚期，已經失去手術機會。明確NSCLC的發病機制對提高NSCLC的診治效果具有重要的意義。

miRNA是一種小的非編碼單鏈RNA，長度約19～22 bp，其可通過在逆轉錄水平與靶標基因的mRNA的3’非翻譯序列相結合，介導靶標mRNA的降解，從而抑制靶標基因的表達[5-6]。miRNA在NSCLC的多種作用已被報道，王富民等人[9]發現，miR-183在無復發者血漿中含量高于復發者，且miR-183是NSCLC患者總生存率的獨立影響因素。羅湘玉等人[10]報道，NSCLC組織中miR-222陽性表達率高于正常肺組織，并可能與NSCLC的發生、發展相關。miR-30a-5p是miR-30家族的成員之一，長度為22 bp，JIA等人[5]發現，miR-30a-5p在膠質瘤細胞及組織中呈高表達，且用反義核苷酸下調miR-30a-5p表達可抑制膠質瘤細胞增殖和侵襲，誘導凋亡，提示miR-30a-5p在膠質瘤中起促癌的作用。與之相反，HE等人[4]報道，miR-30a-5p通過靶向AEG-1基因在肝細胞癌細胞系中可抑制細胞增殖，并激活caspase-3/7進而誘導凋亡。代航等人[11]發現，miR-30a-5p可抑制肝癌細胞株SMCC-7721增殖，促進凋亡，抑制其遷移和侵襲能力。通過調控ERK/Ets-1信號通路，miR-30a-5p抑制三陰性乳腺癌增殖、遷移和侵襲[6]。在結腸癌中，miR-30a-5p通過靶向無齒同源蛋白抑制結腸癌生長表明miR-30a-5p在不同的腫瘤中起著相反的作用[7]。

本研究探討miR-30-5p對非小細胞肺癌A549細胞的增殖與遷移的影響。結果顯示，miR-30a-5p組相對活細胞百分比低于對照組，miR-30a-5p組劃痕愈合率低于對照組，表明miR-30a-5p在NSCLC中抑制增殖和遷移，起著抑癌的作用，與肝細胞癌[4]、三陰乳腺癌[6]及結腸癌[7]的結果一致，而與膠質瘤[5]的結果相反，可能是由于miR-30a-5p在不同的腫瘤中所起的作用不一致有關。進一步探討機制發現，miR-30a-5p組UBE3C mRNA和蛋白表達水平低于對照組，UBE3C對多種腫瘤的生長均存在正調控作用，例如，UBE3C促進黑色素瘤細胞的增殖與遷移[12]，UBE3C促進腎細胞癌的遷移[13]，UBE3C促進肝癌腫瘤的生長等[14]，故miR-30a-5p抑癌作用可能與下調UBE3C表達，進而發揮抑制增殖和遷移有關。

綜上所述，本研究發現miR-30-5p對非小細胞肺癌具有抑制增殖和遷移的作用，其機制可能與下調UBE3C表達有關，這為NSCLC的增殖及遷移提供新機制，有可能做為新的治療靶點。

[1]SIEGEL R L,MILLER K D,JEMAL A.Cancer statistics,2016[J].CA:A Cancer Journal for Clinicians,2016,66(1):7.

[2]FERLAY J,SOERJOMATARAM I,DIKSHIT R,et al.Cancer incidence and mortality worldwide:sources,methods and major patterns in GLOBOCAN 2012[J].International Journal of Cancer,2015,136(5):E359-E386.

[3]STEEG P S.Metastasis suppressors alter the signal transduction of cancer cells[J].Nature Reviews Cancer,2003,3(1):55-63.

[4]HE R,YANG L,LIN X,et al.MiR-30a-5p suppresses cell growth and enhances apoptosis of hepatocellular carcinoma cells via targeting AEG-1[J].International Journal of Clinical&Experimental Pathology,2015,8(12):15632.

[5]JIA Z,WANG K,WANG G,et al.MiR-30a-5p antisense oligonucleotide suppresses glioma cell growth by targeting SEPT7[J].PloS One,2013,8(1):e55008.

[6]LI W,LIU C,ZHAO C,et al.Downregulation of β3 integrin by miR-30a-5p modulates cell adhesion and invasion by interrupting Erk/Ets 1 network in triple-negative breast cancer[J].International Journal of Oncology,2016,48(3):1155-1164.

[7]BARANISKIN A,BIRKENKAMP-DEMTRODER K,MAGHNOUJ A,et al.MiR-30a-5p suppresses tumor growth in colon carcinoma by targeting DTL[J].Carcinogenesis,2012,33(4):732-739.

[8]ZHOU C.Lung cancer molecular epidemiology in China:recent trends[J].Translational Lung Cancer Research,2014,3(5):270-279.

[9]王富民,張寰,曲金力,等.非小細胞肺癌患者血漿miR-10b,miR-122,miR-16和miR-183水平及其與總生存期的關系[J].山東醫藥,2016,56(8):17-19.

[10]羅湘玉,羅衛民,張軍,等.非小細胞肺癌組織中miR-222,TIMP3的表達變化及意義[J].山東醫藥,2015,55(27):51-53.

[11]代航,康冰,左的于,等.MicroRNA-30a-5p對肝癌細胞株 SMMC-7721增殖凋亡及侵襲轉移的影響[J].中華肝臟病雜志,2014,22(12):915-920.

[12]TANG L,YI X M,CHEN J,et al.Ubiquitin ligase UBE3C promotes melanoma progression byincreasingepithelial-mesenchymal transition in melanoma cells[J].Oncotarget,2016,7(13):15738-15746.

[13]WEN J L,WEN X F,LI R B,et al.UBE3C promotes growth and metastasis of renal cell carcinoma via activating wnt/βcatenin pathway[J].PloS One,2015,10(2):e0115622.

[14]JIANG J H,LIU Y F,KE A W,et al.Clinical significance of the ubiquitin ligase UBE3C in hepatocellular carcinoma revealed by exome sequencing[J].Hepatology,2014,59(6):2216-2227.

miR-30a-5p inhibits proliferation and migration of non-small cell lung cancer cell and its mechanism*

Hui Qiu1,Min Hu2,Min-yu Zhong1
(1.Department of Oncology,The First Hospital of Wuhan City,Wuhan,Hubei 430022,China;2.Department of Vascular Surgery,Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,the Central Hospital of Wuhan,Wuhan,Hubei 430000,China)

R734.2

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.15.001

1005-8982（2017）15-0001-04

2016-09-08

武漢市衛計委臨床醫學科研項目（No：WZ13Z03）

鐘敏鈺，E-mail：zhongminyu@126.com