整合素β1-黏附斑激酶在心肌纖維化中的作用及機制*

林傳欽，翟秀麗，鄧托

（1.海南省農墾三亞醫院 急診科，海南 三亞 572000；2.海南省三亞市三林醫院 防治科，海南 三亞 572025）

整合素β1-黏附斑激酶在心肌纖維化中的作用及機制*

林傳欽1，翟秀麗2，鄧托1

（1.海南省農墾三亞醫院 急診科，海南 三亞 572000；2.海南省三亞市三林醫院 防治科，海南 三亞 572025）

目的初步探討整合素β1-黏附斑激酶（integrin β1-FAK）在心肌細胞纖維化中的作用與機制。方法將培養的心肌細胞隨機分為對照組、血清脂肪酶（LPS）處理組、integrin β1抑制組、黏附斑激酶（FAK）抑制組及integrinβ1阻斷+FAK抑制組。免疫熒光雙標法檢測原代心肌細胞純度，逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）與實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-RCR）檢測基質金屬蛋白酶9（MMP-9）、轉化生長因子β1（TGF-β1）、Ⅰ型膠原（Col1A1）、Ⅲ型膠原（Col3A1）和整合素β1（integrin β1）mRNA水平的變化，Western blot檢測FAK的表達。結果①與對照組比較，LPS能夠刺激心肌細胞上調MMP-9、TGF-β1、Col1A1、Col3A1及integrin β1表達；②與LPS組比較，integrin β1阻斷可以抑制LPS誘導的TGF-β1、MMP-9、Col1A1及Col3A1信使核糖核酸（mRNA）的上調（P<0.05），并阻斷LPS誘導的磷酸化FAK的激活（P<0.05）；③FAK蛋白抑制劑PF-573228可抑制LPS誘導的TGF-β1和MMP-9 mRNA上調水平，同時加入integrin β1封閉性抗體顯示相似的效果。結論Integrin β1阻斷能抑制FAK的磷酸化，下調TGF-β1、MMP-9、Col1A1及Col3A1的表達，從而改善在持續炎癥刺激條件下心肌細胞的纖維化反應進程，為未來臨床治療拓展新思路。

心肌纖維化；整合素；黏附斑激酶；血清脂肪酶

Abstract:ObjectiveTo study the effects and mechanisms of integrin β1-FAK on myocardial fibrosis.MethodsCells were randomly divided into five groups:the blank control group,the LPS-stimulated group,integrin β1blocking group,FAK blocking group,blocking integrin β1and FAK group.Double-immunostaining was used to test the purity of myocardial cells.RT-PCR and q-PCR were used to detect the gene expression of MMP-9,TGF-β,Col1A1,Col3A1 and integrin β1.Western blot method was used to detect the expression of FAK protein.ResultsCompared with those in the control group,the LPS-treated cells exhibited a significant increase of MMP-9,TGF-β,Col1A1,Col3A1 and integrin β1,while blocking the integrin β1prevented the increase in LPS-induced up-regulation of MMP-9,TGF-β,Col1A1,Col3A1 and integrin β1and inhibited the FAK phosphorylation.Furthermore,when the cells were treated with the FAK agonist,the expression of MMP-9 and TGF-β decreased,and it had similar effect with blocking integrin β1.ConclusionsOurstudy suggeststhatinhibition ofintegrin β1suppresses the FAK phosphorylation,and decreasesexpressons of MMP-9,TGF-β,Col1A1,Col3A1,which contributes to alleviate the development of myocardial fibrosis under the condition of continuous inflammation stimulation and provides new ideas for the future clinical treatment stimulated H9c2 cardiomyocytes.

Keywords:myocardial fibrosis;integrin;focal adhesion kinase;lipase

心肌纖維化（myocardial fibrosis，MF）是以膠原過度沉積以及細胞外基質增多為特征的慢性病理過程，其發展在一定程度上影響著心肌梗死、高血壓病、肥厚性心肌病及心力衰竭等多種心血管疾病的預后及轉歸[1-2]。盡管目前已有許多研究試圖去揭示心肌纖維化的形成機制及所涉及的相關信號通路，例如心肌張力/壓力的改變，轉化生長因子β1（transforming growth factor-beta 1，TGF-β1）信號通路的激活等[3-5]，但是總體而言，心肌纖維化的機制仍未完全明了，尚需進一步研究闡明。目前已有研究表明，心肌纖維化涉及到細胞外基質（extracellular matrixc，ECM）的產生[6]。而整合素（Integrin）作為介導細胞外環境與細胞相互作用的重要信號轉導分子，其與細胞周圍ECM蛋白質的結合對細胞黏附、功能傳遞、增殖及分化等具有重要的調控作用[7-9]。然而，目前關于integrin β1受體是否是介導心肌纖維化，整合素β1（beta-1 integrins，integrin β1）激活后又是通過何種信號通路來調控心肌纖維化等并不清楚。基于以上問題，本研究擬探討integrin β1在心肌纖維化中的作用與相關機制。

1 材料與方法

1.1 材料

杜氏磷酸鹽緩沖液（Dulbecco's phosphate buffered saline，D-PBS）、胎牛血清、DMEM/F12 細胞培養液及L-谷氨酰胺（購自美國Hyclone公司），兔抗磷酸化黏附斑激酶抗體（anti-phospho-focal adhesion kinase，Anti-P-FAK）、Anti-FAK、心肌肌鈣蛋白 T（cardiac troponin T，cTnT）、α-Sarcomeric Alexa Fluor 488及水溶性熒光染料（cyanine dye 3，Cy3）（購自美國Abcam公司），Anti-GAPDH兔抗和辣根過氧化物酶標記（horse radish peroxidase，HRP）的羊抗兔二抗（購自美國的Cell Signaling Technology公司），DMEM、胎牛血清及胰酶消化液（Trypsin-EDTA）（購自美國Gibco公司），聚氰基丙烯酸正丁酯（Butyleyanoacrylate，BCA）蛋白定量檢測試劑盒（購自陜西省西安飛揚生物科技有限公司），RIPA裂解液（radio immunoprecipitation assay，RIPA）（購自上海碧云天生物技術有限公司，逆轉錄聚合酶鏈反應（re verse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）試劑盒（購自美國Thermo Scientific公司），抗體（購自美國Abcam公司），其他試劑為國產分析純，熒光倒置顯微鏡（購自日本奧林巴斯株式會社），酶聯免疫檢測儀、Power PacTM電泳儀、Trans-blot電轉儀、凝膠成像系統Chemi Doc XRS（購自美國Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 原代心肌細胞分離 取新生48 h內的（ICR）小鼠，斷頸處死，75%乙醇浸泡5 min取出。在超凈工作臺中將鼠腹面向上放置，用眼科剪剪開小鼠胸腔，充分暴露心臟。將獲取的心臟放入含有冰的DPBS液中，剪去心房，反復洗滌，至心室內無血漬。然后將心室肌剪碎（<1 mm3）并轉移到離心管中，800 r/min離心5 min，棄去磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）后，加入 5 ml 0.5%膠原酶Ⅱ的消化液，37℃水浴并振蕩消化10 min；吸取上層混懸液，加入等量的心肌培養基終止反應；剩余沉淀物再加膠原酶Ⅱ消化液消化3～5次，直至組織塊完全消化。200目雙重不銹鋼細胞濾網過濾，收集濾液，800 r/min離心5 min；棄上清液，加入心肌培養基培養，用滴管反復、緩慢吹打，使細胞重浮，調整細胞密度，接種到培養皿中，置37℃、5%二氧化碳CO2飽和濕度培養箱中培養換液。

1.2.2 免疫細胞化學鑒定原代心肌細胞 將滅菌的蓋玻片放入6孔培養板中，以3×104個/孔密度接種細胞，培養48 h后用PBS洗滌細胞，之后加入4%多聚甲醛固定10 min，用PBS漂洗3次，1%Trixon-100通透細胞10 min，PBS漂洗3次，5%牛血清白蛋白（albumin from bovine serum，BSA）室溫封閉30min，加入一抗（cTnT和 α-Sarcomeric actinin），放置 4℃孵育過夜。PBS洗滌3次×5 min，加入二抗488和Cy3，37℃孵育1 h。PBS洗滌3次，DAPI（1∶1 000）孵育15 min，PBS洗滌3次，封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.2.3 實驗分組 所有組細胞采用含0.5%血清的DMEM/F12高糖培養基同化24 h后，進行分組。①對照組（control）：不作任何處理；②LPS 組：使用1μg/ml LPS處理心肌細胞24 h；③integrin β1阻斷組：使用10μg/ml integrin β1封閉性抗體[HMβ1-1（美國BD pharmingen公司）]預處理細胞2 h后，再加入1 μg/ml LPS處理24h；④FAK抑制組：使用1μmol PF-573228預處理細胞2 h，與LPS處理組同一時間加入相同濃度LPS處理細胞24h；⑤integrin β1阻斷+FAK抑制組：使用10μg/ml integrin β1封閉性抗體和1μmol的FAK抑制劑PF-573228預處理細胞2 h后，再加入1μg/ml LPS處理24 h。

1.2.4 RT-PCR各處理組細胞 用Trizol裂解細胞后提取總核糖核酸（ribonucleic acid，RNA），終樣品測定OD260/280確定RNA濃度，進行RT-PCR。RT-PCR反應以總體積20 μl，RNA樣品500 ng的體系，參照試劑盒[oligo（dT）18 primer and a Revet AidTMFirst Strand互補脫氧核糖核酸（complementary deoxyribonucleic acid，cDNA）Synthesis Kit]反應條件進行逆轉錄，合成cDNA。聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）檢測基因（TGF-β1：正向 5'-CCGCAACAACGCAATCTATG-3'，反向 5'-GC CCTGTATTCCGTCTCCTT-3'；MMP-9：正向 5'-TCTG CCTGCACCACTAAAGG，反向5'-CAGGCTGTACCCT TGGTCTG-3'；Col1A1：正向 5'-CAAGGTCCTTCTGGA TCAAGTG-3'，反向 5'-CCTTTATGCCTCTGTCACCTT G-3'；Col3A1：正向 5'-GACCAAAAGGTGATGCTGGA CAG-3'，反向5'-CAAGACCTCGTGCTCCAGTTAG；integrin β1：正向 5'-TCTCACCAAAGTAGAAAGCAG GGA-3'，反向 5'-ACGATAGCTTCATTGTTGCCATTC-3'；GAPDH：正向 5'-TGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3'，反向5'-TTGCTGTTGAAGTCGCAGGAG-3'）的表達。

1.2.5 實時螢光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）測定各處理組細胞，用Trizol裂解細胞后提取總RNA，以總體積20 μl，RNA樣品500 ng的體系，參照試劑盒（oligo（dT） 18 primer and a Revet AidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit）反應條件進行qRT-PCR反應，合成cDNA。然后參照試劑盒（Thermo Scientific Maxima SYBR Green qPCR Master Mixes）進行qRT-PCR測定相關基因的表達情況。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作為對照，通過 2-△△Ct算法進行分析。

1.2.6 Western blot檢測 提取心肌細胞總蛋白，測定蛋白含量。每孔道加入50 μg蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PACE）并將蛋白質轉移到聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上。然后于50 g/L脫脂奶粉TBST（tris buffered saline with tween）緩沖液下室溫封閉2 h，分別加入1∶1 000兔抗p-FAK和FAK，4℃振搖孵育過夜。TBS洗膜 10 min×3次，加入二抗（1∶6 000），室溫下振搖90 min并洗膜。然后加入ECL試劑發光，采用Image-Pro Plus 6.0軟件進行數據分析。

1.3 統計學方法

數據分析采用SPSS 13.0軟件統計，計量資料以均數±標準差（±s）表示，采用方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 原代心肌細胞的鑒定

原代心肌細胞接種24 h后在顯微鏡下呈梭形或不規則扁平狀，并逐漸鋪展伸出偽足，相互交織成網，形成自發收縮細胞單層或細胞簇。對其進行心肌標志蛋白cTnT，α-actinin免疫熒光染色，結果顯示幾乎所有細胞cTnT染色呈陽性，且cTnT陽性細胞同時表達α-actinin蛋白（紅色），證實分離所得原代心肌細胞純度可達≥90%。見圖1。

2.2 LPS誘導小鼠心肌細胞中基質金屬蛋白酶9、TGF-β1mRNA的表達

圖1 免疫熒光檢測心肌細胞標志物cTnT和α-actinin

在沒有LPS的誘導下，心肌細胞會有基礎性的基質金屬蛋白酶 9（matrix metallopeptidase 9，MMP-9）和 TGF-β1表達，而在加入 0.1、0.5、1.0 和2.0μg/ml的LPS作用 24h，各組 MMP-9、TGF-β1表達比較，經方差分析，差異有統計學意義（MMP-9：F=54.784，P=0.000；TGF-β1：F=33.540，P=0.000）。隨著LPS濃度的提升，MMP-9和TGF-β1表達均成梯度增加，并于LPS濃度1.0 μg/ml時均達到一個較高峰值（與 0 μg/ml LPS 比較，0.1 μg/ml LPS：tMMP-9=3.980，PMMP-9=0.016；tTGF-β1=4.214，PTGF-β1=0.014；0.5μg/ml LPS：tMMP-9=10.400，PMMP-9=0.000；tTGF-β1=4.923，PTGF-β1=0.008；1.0μg/ml LPS：tMMP-9=14.080，PMMP-9=0.000；tTGF-β1=16.625，PTGF-β1=0.000；2.0μg/mlLPS：tMMP-9=9.368，PMMP-9=0.001；tTGF-β1=12.612，PTGF-β1=0.000）。見圖2。

2.3 LPS誘導小鼠心肌細胞中Ⅰ型、Ⅲ型膠原和integrin β1受體的表達

RT-PCR和qRT-PCR結果顯示，LPS 1.0 μg/ml作用24 h后，各組mRNA表達比較，經方差分析，差異有統計學意義（Col1A1：F=89.769，P=0.001；Col3A1：F=411.429，P=0.000；integrin β1：F=43.891，P=0.003）。LPS 組 Col1A1、Col3A1、integrin β1mRNA表達水平均高于對照組，差異有統計學意義（與對照 組 比 較 ，tCol1A1=9.475，PCol1A1=0.001；tCol3A1=20.284，PCol3A1=0.000；tintegrinβ1=6.625，Pintegrinβ1=0.003）。見圖3。

2.4 阻斷integrin β1抑制LPS誘導的H9c2心肌 細 胞 中 TGF-β1、MMP-9、Col1A1、Col3A1 和integrin β1mRNA的表達

筆者采用10μg/ml的integrin β1封閉性抗體處理細胞2 h，之后用1μg/ml的LPS孵育細胞24 h，各組mRNA表達經方差分析，差異有統計學意義（MMP-9：F=89.214，P=0.000；TGF-β1：F=81.536，P=0.000；Col1A1：F=272.390，P=0.000；Col3A1：F=113.352，P=0.000；integrin β1：F=69.780，P=0.000）。結果顯示：加入integrin β1阻斷劑預處理后，integrinβ1阻斷劑可以抑制LPS誘導的TGF-β1和MMP-9 mRNA上調水平（LPS組與對照組比較：tMMP-9=11.711，PMMP-9=0.000；tTGF-β1=12.105，PTGF-β1=0.000；tCol1A1=21.559，PCol1A1=0.000；tCol3A1=14.473，PCol3A1=0.000；tintegrinβ1=11.525，Pintegrinβ1=0.000；LPS 組與 integrin β1阻斷后比較：tMMP-9=11.0461，PMMP-9=0.000；tTGF-β1=9.576，PTGF-β1=0.000；tCol1A1=18.525，PCol1A1=0.000；tCol3A1=10.831，PCol3A1=0.000；tintegrinβ1=8.010，Pintegrinβ1=0.000）。見圖4。

2.5 阻斷integrin β1抑制LPS誘導的H9c2心肌細胞中FAK蛋白的磷酸化情況

圖2 PCR檢測不同濃度LPS時MMP-9和TGF-β1的表達情況

圖3 RCR檢測Ⅰ型、Ⅲ型膠原和integrin β1受體的表達

各組mRNA表達及FAK蛋白活化水平，經方差分析，差異有統計學意義（FAK：F=21.050，P=0.000；MMP-9：F=34.633，P=0.000；TGF-β1：F=87.251，P=0.000）。結果顯示，LPS可以使磷酸化FAK蛋白表達上調，而阻斷integrin β1抑制LPS誘導的憐酸化FAK蛋白的上調（見圖5A）。分別加入integrin β1封閉性抗體和FAK蛋白抑制劑PF-573228可以抑制LPS誘導的TGF-β1和MMP-9 mRNA上調水平，但同時加入integrin β1封閉性抗體和FAK蛋白抑制劑PF-573228，與單獨integrin β1抑制和FAK抑制相比并未顯示出進一步的抑制（LPS）組與對照組比較：tFAK=8.503，PFAK=0.000；tMMP-9=10.366，PMMP-9=0.000；tTGF-β1=15.548，PTGF-β1=0.000；LPS 組與 integrin β1抑制比較：tFAK=5.715，PFAK=0.000；tMMP-9=8.1111，PMMP-9=0.000；tTGF-β1=11.494，PTGF-β1=0.000；LPS 與 FAK 抑制比較：tFAK=6.238，PFAK=0.000；tMMP-9=8.645，PMMP-9=0.000；tTGF-β1=14.080，PTGF-β1=0.000）。見圖5。

圖4 RCR 檢測 integrin β1阻斷后 TGF-β1、MMP-9、Col1A1、Col3A1 及 integrin β1的表達

圖5 integrin β1FAK通過FAK調節纖維化因子MMP-9和 TGF-β1的表達

3 討論

心肌纖維化是高血壓、心肌梗死及心力衰竭等多心血管疾病發展到一定階段的共同病理改變，是心肌重構的主要表現之一[1]。細胞內膠原合成代謝與降解代謝失衡，Col1A1與Col3A1合成比率升高，基質金屬蛋白酶的表達和活性降低，最終導致膠原合成增加、降解降低，從而產生心肌的纖維化，心臟舒張與收縮功能下降，致使心力衰竭、心律失常等的發生[10]。

Integrin是由約220 kD的糖基化蛋白組成的異二聚體，包括α、β兩種亞基[11]。其表達于細胞表面，介導細胞外環境與細胞相互作用的重要信號轉導分子，對于細胞黏附、細胞功能傳遞、細胞增殖及分化等具有重要的調控作用[12]。Integrin β1作為主要的Ⅰ型和Ⅲ膠原受體，目前受到廣泛關注。在本實驗中，原代心肌細胞在LPS刺激誘導24 h，心肌纖維化標志基因（TGF-β1和MMP-9）表達上調，心肌纖維化程度增加，并伴隨著細胞Col1A1、Col3A1及integrin β1表達的增加，而聯合給予integrin β1封閉性抗體處理后，integrin β1表達減少，同時細胞Col1A1、Col3A1 表達下調，TGF-β1和 MMP-9 表達減弱，提示integrin β1信號可能成為治療心肌纖維化的一種潛在靶點。

Integrin不具有酶活性，必須通過激活下游分子來向細胞內傳遞信號[13]。FAK作為Integrin的主要下游作用分子，在Integrin介導細胞遷移中起著必不可少的作用[14]。整合素與ECM蛋白質接觸可導致FAK的酪氨酸磷酸化，從而激活FAK[15]。本實驗結果顯示，原代心肌細胞在LPS刺激誘導24 h，p-FAK的表達上調，分別加入integrin β1封閉性抗體和FAK蛋白抑制劑PF-573228均可以抑制LPS誘導的TGF-β1和MMP-9 mRNA的上調水平，但同時加入integrin β1封閉性抗體和FAK蛋白抑制劑PF-573228，與單獨加入integrin β1阻斷組比較，并未有進一步抑制，表明integrin β1主要通過激活FAK參與心肌細胞纖維化的發生與發展。

綜上所述，阻斷integrin β1能抑制FAK的磷酸化，進而減少Col1A1與Col3A1合成，下調相關纖維化因子TGF-β1和MMP-9的表達，從而改善在炎癥刺激條件下心肌細胞的纖維化進程，為未來臨床治療拓展新思路。

[1]KONG P,CHRISTIA P,FRANGOGIANNIS N G.The pathogenesis of cardiac fibrosis[J].Cellular and Molecular Life Sciences,2014,71(4):549-574.

[2]李淑梅,鐘世順,吳平生.氯沙坦對自發性高血壓大鼠心臟局部醛固酮的合成及其心肌纖維化的影響[J].中國現代醫學雜志,2006,16(4):539-542.

[3]ZHANG M,PAN X,ZOU Q,et al.Notch3 Ameliorates cardiac fibrosis after myocardial infarction by inhibiting the TGF-beta1/Smad3 pathway[J].Cardiovasc Toxicol,2016,16(4):316-324.

[4]ZHANG J,CHENG Y,GU J,et al.Fenofibrate increases cardiac autophagy via FGF21/SIRT1 and prevents fibrosis and inflammation in the hearts of type 1 diabetic mice[J].Clinical Science,2016,130(8):625-641.

[5]ZHANG F,DANG Y,LI Y,et al.Cardiac contractility modulation attenuate myocardial fibrosis by inhibiting TGF-beta 1/Smad3 signaling pathway in a rabbit model of chronic heart failure[J].Cell Physiol Biochem,2016,39(1):294-302.

[6]MACKENNA D,SUMMEROUR S R,VILLARREAL F J.Role of mechanical factors in modulating cardiac fibroblast function and extracellular matrix synthesis[J].Cardiovascular Research,2000,46(2):257-263.

[7]WANG H,ZHU Y,ZHAO M,et al.miRNA-29c suppresses lung cancer cell adhesion to extracellular matrix and metastasis by targeting integrin beta 1 and matrix metalloproteinase 2(MMP2)[J].PLoS One,2013,8(8):e70192.

[8]ROY D C,HOCKING D C.Recombinantfibronectinmatrix mimetics specify integrin adhesion and extracellular matrix assembly[J].Tissue Engineering Part A,2013,9(3/4):558-570.

[9]RIOPEL M M,LI J,LIU S,et al.β1 integrin-extracellular matrix interactions are essential for maintaining exocrine pancreas architecture and function[J].Lab Invest,2013,93(1):31-40.

[10]劉兵,謝增柱.慢性低氧致大鼠右心室心肌纖維化作用及其機制的研究[J].中國現代醫學雜志,2015,15(13):1941-1944.

[11]CAMPER L,HOLMVALL K,W魧NGNERUD C,et al.Distribution of the collagen-binding integrin alpha10beta1 during mouse development[J].Cell&Tissue Research,2001,306(1):107-116.

[12]HEINO J.The collagen receptor integrins have distinct ligand recognition and signaling functions[J].Matrix Biology,2000,19(4):319-323

[13]MIRANTI C K,BRUGGE J S.Sensing the environment:a historical perspective on integrin signal transduction[J].Nature Cell Biology,2002,4(4):83-90.

[14]SCHLAEPFER D D,HUNTER T.Integrin signalling and tyrosine phosphorylation:just the FAKs[J].Trends in Cell Biology,1998,8(4):151-157.

[15]ZHAO X K,CHENG Y,CHENG M L,et al.Focal adhesion kinase regulates fibroblast migration via integrin beta-1 and plays a central role in fibrosis[J].Scientific Reports,2016,14(6):19276.

Role and mechanism of integrin β1-FAK on myocardial fibrosis*

Chuan-qin Lin1,Xiu-Li Zhai2,Tuo Deng1
(1.Department of Emergency,Hainan Province NongKen Sanya Hospital,Sanya,Hainan 572000,China;2.Department of Prevention and Health Care,Sanya Sanlin Hospital,Sanya,Hainan 572025,China)

R284.1

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.15.002

1005-8982（2017）15-0005-06

2016-12-08

三亞市醫療科技創新項目（No：YW1214）