腎組織內皮素受體A、B在老年糖尿病腎病發展中的作用研究

何華妮

（海南省瓊海市人民醫院 腎內科，海南 瓊海 571400）

腎組織內皮素受體A、B在老年糖尿病腎病發展中的作用研究

何華妮

（海南省瓊海市人民醫院 腎內科，海南 瓊海 571400）

目的探討腎組織中內皮素受體A、B（ETAR、ETBR）表達變化在老年糖尿病腎病發展中的作用。方法選取2015年1月-2016年6月該院收治的糖尿病腎病老年患者34例，根據糖尿病腎病病理分型分為：糖尿病腎?、窦墸―1組10例），Ⅱ級（D2組12例），Ⅲ級（D3組12例）；選取同期在該院行腎腫瘤切除術后遠離腎腫瘤的正常組織為對照組（10例）。免疫組織化學檢測ETAR、ETBR的表達量；免疫熒光雙染法定位ETAR、ETBR在腎組織的分布部位。收集生化檢測指標，計算腎小球硬化率，進行相關性分析。結果D3組尿蛋白水平高于D2和D1組，差異有統計學意義（P<0.05）；D3組腎小球濾過率（GFR）和白蛋白（Alb）與D1組比較差異有統計學意義（P<0.05）；D3組和D2組腎小球硬化率均高于D1組，差異有統計學意義（P<0.05）。糖尿病腎病各組ETAR、ETBR表達量均高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）；對照組ETAR表達量少于ETBR，隨著病情加重糖尿病腎病患者腎組織中ETAR表達量逐漸增加，組間比較差異有統計學意義（P<0.05）；D2組ETBR表達量最高，與D1組和D3組比較差異無統計學意義（P>0.05）；ETAR/ETBR在各組比較差異有統計學意義（P<0.05）。ETAR在腎小管近端和遠端均存在表達，ETBR主要表達于腎小管近端。糖尿病腎病患者腎組織中ETAR表達量與病程、尿蛋白水平、腎小球硬化率（ROG）呈正相關；ETBR表達量與病程呈負相關；ETAR/ETBR比值與病程、尿蛋白水平及ROG呈正相關，與Alb、GFR呈負相關。結論老年糖尿病患者腎組織中ETAR、ETBR表達量增加，ETAR/ETBR值倒置與病情發展呈正相關。

糖尿病腎??；腎組織；內皮素受體；老年人

Abstract:ObjectiveTo investigate the endothelin receptor A,B (ETAR,ETBR)expression in renal tissue of the development in elder diabetic nephropathy.MethodsFrom January 2015 to June 2016,34 elderly patients with diabetic nephropathy in our hospital were divided into 3 groups according to pathological type:10 cases of group D1(12 cases),grade D2 group(12 cases),grade D3 group.Patients underwent renal tumor resection from renal tumors in our hospital as the control group (10 cases).The expressions of ETAR and ETBR were detected by immunohistochemistry.The location of ETAR and ETBR in renal tissue was detected by immunofluorescence double staining method.Biochemical detection indexes were collected to calculate the rate of glomerular sclerosis,and the correlation was analyzed.ResultsThe urine protein level of D3 group was significantly higher than that of D2 and D1 group,the difference was statistically significant (P<0.05).Glomerular filtration rate(GFR)and albumin(Alb)had significant difference between group D3 and D1(P<0.05).D3 group and D2 group glomerular sclerosis rate were significantly higher than that in D1 group,thedifference had statistical difference (P<0.05).The expression of ETAR and ETBR in diabetic nephropathy group were significantly higher than the control group,the difference was statistically significant(P<0.05).The expression of ETAR was less than ETBR in the control group,with the aggravation of increased expression of ETAR in renal tissue of diabetic nephropathy patients,the differences between groups were statistically significant(P<0.05).The expression of ETBR in D2 group was the highest,and no statistically significant differences between D1 group and D3 group (P>0.05).ETAR/ETBR in each group had statistically significant difference(P<0.05).ETAR was expressed in proximal and distal renal proximal tubule.ETBR was mainly expressed in proximal tubule.The expression of ETAR in renal tissue of patients with diabetic nephropathy and duration,urinary protein level and ROG were positively correlated.The expression of ETBR was negatively related to the amount and duration.ETAR/ETBR ratio and the course of disease,urinary protein level,ROG were positively correlated,negatively correlated with Alb,GFR.ConclusionsThe expression of ETAR and ETBR in the renal tissues of the elderly patients with diabetes mellitus are significantly increased,and the inversion of ETAR/ETBR value is positively correlated with the development of the disease.

Keywords:diabetic nephropathy;renal tissue;endothelin receptor;elder

糖尿病腎病多發于老年人群，是導致糖尿病患者死亡的主要并發癥之一[1]。研究發現，糖尿病腎病患者血漿和尿液中內皮素1（endothelin-1，ET-1）含量增加并參與了病情的發展，ET-1主要通過內皮素受體 A（endothelin type a receptor，ETAR）、內皮素受體 B（endothelin type b receptor，ETBR）2種受體亞型發揮作用[2-3]。相關研究[4]顯示，正常人腎臟ETAR與ETBR的比值為1∶2，但糖尿病腎病患者腎組織ETAR和ETBR的變化仍處在動物實驗層面，且結論存在爭議[5-7]。本研究通過觀察不同糖尿病腎病時期老年患者腎組織中ETAR和ETBR表達變化，探討其與老年糖尿病發展的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年1月-2016年6月本院收治的糖尿病腎病老年患者34例。腎活檢前均告知患者必要性和危險性，簽署知情同意書；排除合并繼發性腎臟病變、心力衰竭及嚴重感染的患者。其中，男性25例，女性 11例；年齡 60～79歲，平均（64.91±9.35）歲。根據美國腎病學會2010年頒布的糖尿病腎病病理分型標準，分為糖尿病腎?、窦墸―1組10例），Ⅱ級（D2組12例），Ⅲ級（D3組12例）。選取同期在本院行腎腫瘤切除術后距腎腫瘤>3 cm的組織，蘇木精 - 伊紅染色法（hematoxylin-eosin staining，HE）染色后顯微鏡下觀察為形態正常的腎組織為對照組（10例）。其中，男性7例，女性3例；年齡60～76歲，平均（66.08±11.70）歲。糖尿病腎病患者與對照組患者之間性別構成、年齡比較差異無統計學意義（P>0.05）。

1.2 方法

1.2.1 腎病理檢查 入選患者進行腎組織光學顯微鏡、免疫熒光及電子顯微鏡檢查，其中，光學顯微鏡檢查包括：HE染色；PAS染色法（periodic acid-schiff stain，PAS）；正六胺銀染色法 （aeriodic acid-silver methe-namine，PASM-Masson） 染色；Masson 三色染色。計算腎小球硬化率（Glomerular sclerosis rate，ROG）。經本科與超聲科協作進行腎活檢組織穿刺，將標本初步處理后送上級醫院或廣州金域醫學檢驗中心進一步檢查及處理。

1.2.2 免疫組織化學檢測 取腎組織石蠟包塊，二甲苯脫蠟，酒精梯度脫水，3%過氧化氫37℃孵育15min，磷酸鹽緩沖液沖洗3次；修復抗原，羊血清工作液封閉20 min，分別滴加ETAR、ETBR多克隆抗體（上海研謹生物科技有限公司，1∶1 000稀釋），4℃冷藏過夜，磷酸鹽緩沖液沖洗3次，滴加生物素標記的二抗，37℃孵育60 min，磷酸鹽緩沖液洗凈；滴加辣根過氧化物酶（horse radish peroxidase，HRP）標記的鏈霉素卵白素工作液，37℃孵育60 min，二氨基聯苯胺（Diaminobenzidine，DAB）染色，蒸餾水洗凈后蘇木素復染，脫水、透明、干燥及封片，高倍光鏡視野下觀察胞質為棕黃色的為陽性，進行半定量分析；采用Image pro plus 6.0軟件測定ETAR、ETBR表達量。

1.2.3 免疫熒光雙染法 腎組織制作2 μm冷凍切片，采用直接免疫熒光法和間接免疫熒光法，共聚焦顯微鏡下觀察染色結果。近端和遠端腎小管的蛋白標志物分別為LTL、THP（上海玉博生物科技有限公司），集合管蛋白標志物為DBA（上海浩然生物技術有限公司），按試劑盒說明書進行操作。

1.3 統計學方法

數據分析采用SPSS 14.0統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，用方差分析，兩兩比較用t檢驗；回歸分析用Pearson法，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 生化檢測結果和腎小球硬化率

經單因素方差分析，各組尿蛋白、腎小球濾過率（glomerular filtration rate，GFR）、白蛋白（Albumin，Alb）、腎小球硬化率（Glomerular sclerosis rate，ROG）間差異有統計學意義（P<0.05），各組尿蛋白水平差異有統計學意義；進一步兩兩比較顯示，D3組尿蛋白高于D2和D1組，差異有統計學意義（P<0.05）；D3組GFR、Alb均低于D2和D1組，差異有統計學意義（P<0.05）；D3組和D2組ROG高于D1組，差異有統計學意義（P<0.05）。糖尿病腎病各組間糖化血紅蛋白（HbA1C）、血清肌酐（serum creatinine，Scr）水平比較差異無統計學意義P>0.05）。見表1。

2.2 免疫組織化學檢測結果

經單因素方差分析，各組ETAR、ETBR表達量比較差異有統計學意義（P<0.05），各組ETAR、ETBR表達量有差異；進一步兩兩比較顯示，糖尿病腎病各組ETAR、ETBR表達量高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）；對照組ETAR表達量少于ETBR，隨著病情加重糖尿病腎病患者腎組織中ETAR表達量逐漸增加，組間比較差異有統計學意義（P<0.05）；D2組ETBR表達量最高，與D1組和D3組比較差異無統計學意義（P>0.05）；ETAR/ETBR在各組比較差異有統計學意義（P<0.05）。見表2和圖1。

表1 各組患者生化檢測結果和腎小球硬化率比較 （±s）

表1 各組患者生化檢測結果和腎小球硬化率比較 （±s）

注：1）與 D1 組比較，P<0.05；2）與 D2 組比較，P<0.05

組別ROG/%對照組 0.04±0.02 4.21±0.52 115.62±3.78 39.96±6.15 59.71±10.05 0.50±0.11 D1 組 1.57±0.35 7.52±1.67 104.05±7.43 39.02±5.36 86.63±4.93 2.11±1.95 D2 組 2.51±0.83 7.28±1.31 88.19±22.59 33.38±8.09 83.85±6.79 13.80±5.161）D3 組 5.17±2.661）2） 7.60±1.69 68.27±26.131）2） 31.89±9.771） 93.05±6.19 18.63± 15.541）F值 4.068 0.826 8.339 6.350 0.995 10.985P值 0.035 0.195 0.005 0.018 0.082 0.001尿蛋白/（g/d）HbA1C/%GFR Alb/（g/L）Scr/（μmol/L）

2.3 糖尿病腎病患者免疫熒光雙染色結果

以LTL為近端腎小管標志物，4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）為藍色熒光染料，Merge為藍色與綠色染料混合染色結果（見圖2）。ETAR在腎小管近端和遠端存在表達，ETBR主要表達于腎小管近端。

2.4 相關性分析

單因素相關性分析顯示，糖尿病腎病患者腎組織中ETAR表達量與病程、尿蛋白水平及ROG呈正相關；ETBR表達量與病程呈負相關；ETAR/ETBR比值與病程和尿蛋白水平、ROG呈正相關，與Alb、GFR呈負相關。見表3。

表2 各組腎小管ETAR和ETBR表達量 （±s）

表2 各組腎小管ETAR和ETBR表達量 （±s）

組別ETAR/ETBR對照組 1.24±0.09 2.89±0.10 0.36±0.15 D1 組 5.56±0.34 6.61±1.86 0.94±0.21 D2 組 8.63±1.39 7.05±1.91 1.37±0.11 D3 組 12.65±1.84 6.02±1.18 2.20±0.25F值 11.931 0.539 9.138P值 0.001 0.261 0.003 ETAR ETBR

圖1 各組腎小管ETAR和ETBR染色結果 （免疫組織化學×400）

圖2 糖尿病腎病患者腎小管ETAR和ETBR雙染色結果 （免疫熒光×400）

表3 ETAR、ETBR影響因素相關性分析

3 討論

ET-1與ETAR結合后可誘導炎癥反應、血管收縮及細胞增殖[8-10]，與ETBR結合后可介導內皮素濃度相關的NO釋放[11]，促進循環中ET-1清除和水鈉排泄，起到舒張血管、利尿降壓的作用[12-13]。本研究顯示，人正常腎組織中多表達于腎小管，腎小球中無表達；糖尿病腎病腎組織中ETAR、ETBR在腎小管表達水平提升，腎小球中也有表達。免疫熒光雙染法顯示，腎組織中皮質內部集合管、近曲小管和遠端小管中多分布ETAR；近端小管中多分布ETBR。本研究中收集人腎組織時多為腎皮質部分，只有少量髓質，因此無法得到人腎臟髓質和集合系統的分布情況。

本研究顯示，人正常腎組織中ETAR表達量低于ETBR，糖尿病腎病早期腎組織中ETAR和ETBR表達水平均提升，隨著病情進展ETAR表達水平高于ETBR，在糖尿病腎病Ⅲ級時ETAR與ETBR的比值達到2∶1。說明ET系統在糖尿病腎病發展中發揮作用，其機制可能與糖尿病腎病患者血管內皮功能受損有關。當腎臟局部ET-1分泌量增加時，其相應的2個受體含量也存在改變，在病情早期ETBR可競爭性抑制ETAR與ET-1結合，擴張血管，保護腎組織；隨病情發展ETBR分泌不足，腎組織損傷加重。相關性研究顯示，ETAR表達水平與病程、尿蛋白量、ROG呈正相關，ETBR與病程呈負相關，與其他兩項無相關性，提示ETAR在糖尿病腎病進展中發揮重要作用；ETAR與ETBR的比值異常與病程、ROG、尿蛋白量、GFR有相關性，說明在糖尿病腎病發展中的作用不可忽視。

綜上所述，糖尿病可激活內皮素系統，腎臟組織中持續高表達ETAR及ETAR/ETBR比值異常參與糖尿病腎病的發生、發展。本研究可為干預內皮素途徑治療糖尿病腎病提供新的理論基礎。

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ETAR and ETBR receptor subtypes in development of diabetic nephropathy in elderly

Hua-ni He
(Department nephrology,Qionghai People's Hospital,Qionghai,Hainan 571400,China)

R323.6

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.15.009

1005-8982（2017）15-0042-05

2016-12-26