HPLC法同時測定小兒清咽顆粒中5種成分的含量

張申亮，聶黎行（1.山西省平遙縣人民醫院藥劑科，山西平遙 031100；2.中國食品藥品檢定研究院中藥民族藥檢定所，北京 100050）

HPLC法同時測定小兒清咽顆粒中5種成分的含量

張申亮1＊，聶黎行2#（1.山西省平遙縣人民醫院藥劑科，山西平遙 031100；2.中國食品藥品檢定研究院中藥民族藥檢定所，北京 100050）

目的：建立同時測定小兒清咽顆粒中哈巴苷、哈巴俄苷、綠原酸、咖啡酸、連翹苷含量的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Zorbax SB-C18，流動相為乙腈-0.1%磷酸溶液（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，檢測波長為210 nm（0～13 min，哈巴苷）、327 nm（13～25 min，綠原酸、咖啡酸）、277 nm（25～29 min，連翹苷）、210 nm（29～40 min，哈巴俄苷），柱溫為30℃，進樣量為10 μL。結果：哈巴苷、哈巴俄苷、綠原酸、咖啡酸、連翹苷檢測進樣量線性范圍分別為8.400～168.0 ng（r＝0.999 6）、11.30～226.0 ng（r＝0.999 8）、128.8～257.6 ng（r＝0.999 3）、8.110～162.2 ng（r＝0.999 6）、29.69～593.8 ng（r＝0.999 4）；定量限分別為33.39、451.2、515.2、324.5、1 188 ng/mL，檢測限分別為8.348、112.8、128.8、81.12、297.0 ng/mL；精密度、穩定性、重復性試驗的RSD＜2.0%；加樣回收率分別為96.39%～98.64%（RSD＝0.83%，n＝6）、96.60%～98.89%（RSD＝0.89%，n＝6）、96.28%～99.22%（RSD＝1.25%，n＝6）、96.49%～99.54%（RSD＝1.16%，n＝6）、96.26%～99.70%（RSD＝1.30%，n＝6）。結論：該方法操作簡單、結果準確，適用于小兒清咽顆粒中5種成分含量的同時測定。

小兒清咽顆粒；高效液相色譜法；波長切換；哈巴苷；哈巴俄苷；綠原酸；咖啡酸；連翹苷

ABSTRACTOBJECTIVE：To develop a method for simultaneous determination of harpagide，harpagoside，chlorogenic acid，caffeic acid and phillyrin in Xiaoer qingyan granules.METHODS：HPLC method was adopted.The determination was performed on Zorbax SB-C18column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.1%phosphoric acid solution（gradient elution）at a flow rate of 1.0 mL/min.The detection wavelength was set at 210 nm（0-13 min，harpagide），327 nm（13-25 min，chlorogenic acid and caffeic acid），277 nm（25-29 min，phillyrin），210 nm（29-40 min，harpagosid）；the column temperature was 30℃，and sample size was 10 μL.RESULTS：The linear ranges of harpagide，harpagosid，chlorogenic acid，caffeic acid and phillyrin were 8.400-168.0 ng（r＝0.999 6），11.30-226.0 ng（r＝0.999 8），128.8-257.6 ng（r＝0.999 3），8.110-162.2 ng（r＝0.999 6），29.69-593.8 ng（r＝0.999 4），respectively.LOQs of the 5 components were 33.39，451.2，515.2，324.5，1 188 ng/mL；LODs were 8.348，112.8，128.8，81.12，297.0 ng/mL，respectively；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were all lower than 2.0%. The recoveries were 96.39%-98.64%（RSD＝0.83%，n＝6），96.60%-98.89%（RSD＝0.89%，n＝6），96.28%-99.22%（RSD＝1.25%，n＝6），96.49%-99.54%（RSD＝1.16%，n＝6），96.26%-99.70%（RSD＝1.30%，n＝6），respectively.CONCLUSIONS：The method is simple，accurate and suitable for simultaneous determination of 5 components in Xiaoer qingyan granules

KEYWORDSXiaoer qingyan granules；HPLC；Wavelength switching；Harpagide；Harpagosid；Chlorogenic acid；Caffeic acid；Phillyrin

小兒清咽顆粒是由玄參、蒲公英、連翹等中藥組成的成方制劑，具有清熱解表、解毒利咽的功效，可用于小兒外感風熱引起的發熱頭痛、咳嗽音啞、咽喉腫痛等癥。處方中玄參具有清熱涼血、滋陰降火、解毒散結的功效；蒲公英具有清熱解毒、消腫散結的功效；連翹具有清熱解毒、消腫散結、疏散風熱的功效[1]。小兒清咽顆粒現收載于《衛生部藥品標準中藥成方制劑（第六冊）》，但標準中只有薄層鑒別項，未有含量測定項，不能保證該制劑的質量和用藥的有效性[2]；且目前的文獻報道多為對小兒清咽顆粒中1～2個成分的含量進行測定，不能全面控制該制劑的質量[3-7]。鑒于此，筆者采用高效液相色譜法（HPLC）建立了同時測定小兒清咽顆粒中玄參的主要成分（哈巴苷和哈巴俄苷）、蒲公英中的主要成分（綠原酸和咖啡酸）、連翹中的主要成分（連翹苷）含量的方法，以期為完善該制劑的質量標準提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1200型HPLC儀，包括四元泵、可變波長檢測器、自動進樣器、ChemStation化學工作站（美國Agilent公司）；AE240型電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；KQ3200DB型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率：150 W，頻率：40 kHz）。

1.2 藥品與試劑

小兒清咽顆粒（福建省泉州羅裳山制藥廠，批號：160318、160106、150908，規格：6 g/袋）；哈巴苷對照品（批號：111729-201506，純度：95.9%）、哈巴俄苷對照品（批號：111730-201508，純度：96.0%）、綠原酸對照品（批號：110753-201415，純度：96.2%）、咖啡酸對照品（批號：110885-200102，純度：100.0%）、連翹苷對照品（批號：110821-201615，純度：94.9%）均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為重蒸水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：ZORBAX SB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～5 min，2%→7%A；5～10 min，7%→13%A；10～20 min，13%→25%A；20～40 min，25%→35%A）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：210 nm（0～13 min，哈巴苷）、327 nm（13～25 min，綠原酸、咖啡酸）、277 nm（25～29 min，連翹苷）、210 nm（29～40 min，哈巴俄苷）；柱溫：30℃；進樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 精密稱取哈巴苷、哈巴俄苷、綠原酸、咖啡酸、連翹苷對照品適量，加甲醇分別制成每1 mL含哈巴苷208.7 μg、哈巴俄苷225.6 μg、綠原酸257.6 μg、咖啡酸202.8 μg、連翹苷198.0 μg的單一對照品貯備液。分別精密量取哈巴苷對照品貯備液0.4 mL、哈巴俄苷對照品貯備液0.5 mL、綠原酸對照品貯備液0.5 mL、咖啡酸對照品貯備液0.4 mL、連翹苷對照品貯備液1.5 mL，置于同一10 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得。

畢總還特別提到，中美貿易戰中對叉車也加征了關稅，造成了中國叉車品牌在海外市場的價格相對上漲，比亞迪叉車也在其中。海外客戶則表示，相較于比亞迪叉車為企業節省的生產成本，比亞迪叉車仍是非常好的選擇。

2.2.2 供試品溶液 取樣品適量，研細，取約3 g，精密稱定，置于25 mL量瓶中，加50%甲醇溶液超聲處理30 min，放冷至室溫，再加50%甲醇定容，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.2.3 陰性對照溶液 按樣品的處方比例和制備工藝分別制備缺玄參、蒲公英、連翹的陰性樣品，再按“2.2.2”項下方法制備陰性對照溶液。

2.3 系統適用性試驗

分別取“2.2”項下混合對照品溶液、供試品溶液、各陰性對照溶液適量，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜，詳見圖1。由圖1可知，各成分均能達到基線分離，分離度均＞1.5；各成分的理論板數均＞3 000，哈巴苷、哈巴俄苷、綠原酸、咖啡酸、連翹苷的保留時間分別為9.6、30.9、15.3、17.1、28.3 min。結果表明，其他成分對測定無干擾。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.4 線性關系考察

精密吸取“2.2.1”項下混合對照品溶液1、2、5、10、15、20 μL，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以待測成分進樣量（x，ng）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，回歸方程與線性范圍見表1。

表1 回歸方程與線性范圍Tab 1 Regression equations and linear ranges

2.5 定量限（LOQ）與檢測限（LOD）考察

取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，倍比稀釋，按“2.1”項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。當信噪比為10∶1時，得LOQ；當信噪比為3∶1時，得LOD，結果見表2。

2.6 精密度試驗

精密吸取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果，哈巴苷、哈巴俄苷、綠原酸、咖啡酸、連翹苷峰面積的RSD分別為0.65%、0.75%、1.48%、1.07%、1.76%（n＝6），表明儀器精密度良好。

表2 LOQ與LOD測定結果（ng/mL）Tab 2 Results of LOQ and LOD（ng/mL）

2.7 穩定性試驗

取“2.2.2”項下供試品溶液（批號：160318）適量，分別于室溫下放置0、1、2、4、8、12 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，哈巴苷、哈巴俄苷、綠原酸、咖啡酸、連翹苷峰面積的RSD分別為0.97%、1.06%、1.57%、1.27%、1.46%（n＝6），表明供試品溶液在室溫下放置12 h內穩定性良好。

2.8 重復性試驗

取樣品（批號：160318）適量，研細，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算平均含量。結果，哈巴苷、哈巴俄苷、綠原酸、咖啡酸、連翹苷含量的平均值分別為62.90、88.62、115.9、64.29、271.4 μg/g，RSD分別為1.75%、1.46%、1.07%、1.58%、1.93%（n＝6），表明本方法重復性良好。

2.9 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的樣品（批號：160318）適量，共6份，每份約1.5 g，各置于25 mL量瓶中，分別加入一定質量的待測成分對照品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結果見表3。

2.10 樣品含量測定

取3批樣品各適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量，結果見表4。

3 討論

3.1 提取方法和提取溶劑的選擇

筆者分別考察了加熱回流和超聲兩種樣品提取方法對提取效果的影響，結果發現待測成分經超聲法提取時比加熱回流提取時的含量高，因此選擇超聲法為樣品的提取方法。此外，還考察了不同的提取溶劑（30%甲醇溶液、50%甲醇溶液、70%甲醇溶液、甲醇）對提取效果的影響，結果發現50%甲醇溶液作為提取溶劑時，待測成分的提取效率高于其他溶劑，因此選擇50%甲醇溶液為本試驗的提取溶劑。

3.2 檢測波長的選擇

小兒清咽顆粒中哈巴苷、哈巴俄苷、綠原酸、咖啡酸、連翹苷等5個成分的紫外特征吸收波長各不相同，為了準確測定其含量，本試驗根據2015年版《中國藥典》（一部）[1]和相關文獻[8-11]確定5個成分的最大吸收波長，再通過紫外檢測器的波長切換功能，在每個成分的最大吸收波長下同時、準確地測定小兒清咽顆粒中5個成分的含量，最終確定本試驗的檢測波長分別為210 nm（0～13 min，哈巴苷）、327 nm（13～25 min，綠原酸、咖啡酸）、277 nm（25～29 min，連翹苷）、210 nm（29～40 min，哈巴俄苷）。

表3 加樣回收率試驗結果（n＝6）Tab 3 Results of recovery tests（n＝6）

表4 樣品含量測定結果（n＝3，μg/g）Tab 4 Results of content determination of samples（n＝3，μg/g）

3.3 洗脫方式和流動相的選擇

小兒清咽顆粒中哈巴苷、哈巴俄苷、綠原酸、咖啡酸、連翹苷等5個成分的極性差異較大，且組分中化學成分較為復雜，采用等度洗脫流動相的方式，難以取得滿意的色譜分離效果，因此選擇梯度洗脫的方式。筆者還分別考察了不同的流動相體系（甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸溶液），結果發現采用乙腈-0.1%磷酸溶液作為流動相時，較其他流動相的色譜基線平穩，峰形更好，可達到分離測定的要求，因此本試驗選擇其作為流動相。綜上所述，本方法操作簡單、結果準確，適用于小兒清咽顆粒中5種成分含量的同時測定。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].2015年版.北京：中國醫藥科技出版社，2015：117、170、352.

[2] 國家藥典委員會.衛生部藥品標準中藥成方制劑：第六冊[S].1992：23.

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[6] 楊志一，王漢平.HPLC法測定小兒清咽顆粒中牛蒡苷的含量[J].中國藥師，2006，9（1）：44-45.

[7] 張曉南，毛云宏，游燕，等.小兒清咽顆粒中青黛的薄層色譜鑒別研究[J].中國民族民間醫藥，2015，24（22）：21-22.

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（編輯：劉 柳）

Simultaneous Determination of 5 Components in Xiaoer Qingyan Granules by HPLC

ZHANG Shenliang1，NIE Lixing2（1.Dept.of Pharmacy，Shanxi Pingyao County People’s Hospital，Shanxi Pingyao 031100，China；2.Division of TCM and Ethnomedicine，National Institute of Food and Drug Control，Beijing 100050，China）

R927.2

A

1001-0408（2017）21-3004-04

2017-01-19

2017-04-04）

＊副主任藥師。研究方向：醫院藥學。E-mail：zhangsl2000@hot ail.com

#通信作者：副研究員，碩士。研究方向：中藥分析。E-mail：nielixing@163.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.21.35