骨髓間充質干細胞提取培養分化鑒定

王可新，姚宏波，王 碩，劉子墨，廉 潔*

（齊齊哈爾醫學院基礎醫學院，1.卓越1班，2.組胚教研室，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

1 實驗材料及儀器

1.1 一般資料

SD級大鼠、DMEM培養基、Hanks液、20%完全培養基、雙抗、胰蛋白酶、胎牛血清、青霉素和鏈霉素、EDTA溶液

1.2 儀器

倒置顯微鏡、培養瓶、眼科鑷、眼科剪、二氧化碳培養箱、離心機、超凈工作臺、離心管、培養瓶、玻璃吸管、膠帽、注射器、小燒杯、細胞培養板

2 實驗方法

2.1 細胞的提取與培養

（1）取大鼠脫頸處死，浸泡于75%的乙醇溶液中20～30 min，無菌潔凈工作臺上，取大鼠雙側后肢股骨，置入小燒杯中，用適量Hanks液清洗2～3次，洗去血污。

（2）用眼科剪剪開兩端骨骺，暴露骨髓腔，一端置于離心管上方，另一端用注射器抽取Hanks液注入骨髓腔，沖出骨髓。反復沖洗至液體不再渾濁為止。離心10分鐘，骨髓下沉，用吸管吸出多余的Hanks液。

（3）用培養液清洗1次，加入20%培養液5 mL，放入培養瓶，置于37℃5%二氧化碳培養箱。

（4）第二日換液，觀察細胞貼壁情況。以后每3～4天更換培養基一次，當細胞融合80%～90%時，按1：2進行傳代培養。

（5）利用倒置顯微鏡下分別對原代培養的細胞和傳代培養的細胞進行觀察，觀察其生長特點。

（6）利用HE染色法對細胞進行染色，光鏡下觀察大鼠骨髓間充質干細胞的形態特征。

2.2 細胞的換液方法：

（1）37℃水浴中放入PBS及10%培養液，10分鐘。

（2）操作臺及實驗室內紫外照射20-30分鐘。

（3）紫外結束，開排風，點酒精燈，戴好手套，用酒精棉球擦拭工作臺及手。

（4）取出培養瓶，用酒精棉球擦拭培養瓶瓶口、體及底。

（5）在操作箱中，打開培養瓶，過火，倒掉培養液。

（6）PBS、培養液打開封口膜，過火，注射器分別插入瓶口。

（7）用PBS沖洗2次，加入5毫升培養液，蓋好瓶蓋，放入培養箱。

（8）將PBS、培養液封口膜封口，放入4℃冰箱。

2.3 細胞的傳代培養：

（1）待原代細胞長到80%-90%，細胞狀態接近融合時，于此時進行細胞的傳代培養。

（2）無菌條件下，在經過紫外線殺菌后的操作臺內，倒掉培養瓶中的舊培養液。

（3）Hanks液清洗培養瓶1-2次后，向其中加入1毫升胰蛋白酶和EDTA混合液（體積比為1:1），蓋好瓶蓋蓋，放置于37℃培養箱中溫育2-4分鐘。

（4）顯微鏡下觀察，若細胞回縮，細胞間隙變大，甚至漂浮起來，此時需立即停止消化。

（5）輕輕吸除消化液，加Hanks液清洗培養瓶1次，去除殘存的消化液。

（6）向培養瓶中加入培養液2毫升，用吸管反復吹打貼壁細胞，制成細胞懸液。

（7）用計數板計數懸液濃度約10^5/ml接種于新培養瓶中。

2.4 細胞的分化誘導鑒定：

（1）取生長狀態良好的第三代骨髓間充質干細胞以10^8/ml接種于預先置有小蓋玻片的6孔板中，將其放入37℃5%二氧化碳培養箱中進行培養。

（2）待細胞達到70%-80%融合后，加入分化誘導液。

（3）每3天換液一次，誘導14天后，對培養的細胞進行細胞分化水平的鑒定。

3 觀察指標：

（1）細胞形態學觀察。

（2）細胞多向分化能力的鑒定。

4 結 果

（1）在顯微鏡下觀察發現，骨髓間充質干細胞呈圓形，大小不一，胞體透亮，折光率強。

（2）培養24 h后，可以觀察到大量貼壁細胞，細胞形狀呈短棒狀。

（3）培養48 h后，細胞可呈扁平形，短梭形，小圓形或多角形，呈貼壁生長的狀態。

（4）培養3、4天后，貼壁細胞數量增多。

（5）培養6、7天后，細胞大量增殖并出現融合現象，且發現胞體略大，細胞間排列緊密，大多數細胞呈梭形。

（6）將細胞傳代培養至3、4代后，細胞體積較大，細胞呈梭形或紡錘形，此時細胞的核漿比例較小。

（7）在細胞誘導分化14天后，細胞出現類似神經元樣細胞的改變，細胞形態各異，呈錐體形、球形、星形、梨形等。

（7）神經元細胞的表型特征將在第三代骨髓間充質細胞的培養中表現出來，這說明體外分離培養的細胞為骨髓間充質干細胞。

5 討 論

骨髓間充質干細胞（bone mesenchymal stem cells ，BMSCs）是一種存在于骨髓基質內的，由中胚層細胞分化而來的具有多向分化潛能的干細胞。細胞處于未分化狀態，增殖能力強，可在體外進行大量的培養，而且取材方便，自體移植不會發生免疫排斥反應，更與醫學倫理問題無關。因此骨髓間充質干細胞的提取分化為治療神經退行性疾病的提供的全新的探索空間。然而，骨髓間充質干細胞的含量在骨髓中所占比例極小，如果想要利用間充質干細胞進行研究和治療，必須對其進行體外的分離培養及擴增。

骨髓間充質干細胞具有多向分化的潛能，易于誘導為脂肪細胞、成骨細胞、心肌細胞，神經細胞及其他細胞。這種特性使其在中樞神經系相關統疾病的治療中具有十分明顯的優勢。進行骨髓間充質干細胞的體外培養，誘導其定向分化為神經元樣細胞，研究分化方法，可實現個體化治療的目的，為臨床使用提供了極大的便利，為骨髓間充質干細胞在神經系統損傷病變的修復過程起到的重要作用提供了理論基奠，并對研究修復神經系統損傷的研究進一步實驗提供了可行性極大地實驗研究方案；為治療神經退行性疾病提供更多的治療方案，為患者增加治愈的希望，盡可能減輕患者的經濟負擔，并對推進間充質干細胞研究的進程具有極其重要的意義。

骨髓間充質干細胞是用于治療組織修復和重建的種子細胞，為骨髓間充質干細胞在神經系統損傷病變修復過程起到的作用提供理論基奠，并對研究修復神經系統損傷的進一步實驗提供可行性實驗研究方案，具有極大的發展空間。

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