小鼠11β-1基因真核表達載體的構建及應用

辛婧，葉磊，楊可，沈亞非，鄧飛

[1.河南省漯河市中心醫院（漯河市醫學高等專科學校第一附屬醫院）內分泌科，河南 漯河 462000；2.河南省漯河市召陵區人民醫院神經內科，河南 漯河 462000]

辛婧1，葉磊2，楊可1，沈亞非1，鄧飛1

[1.河南省漯河市中心醫院（漯河市醫學高等專科學校第一附屬醫院）內分泌科，河南 漯河 462000；2.河南省漯河市召陵區人民醫院神經內科，河南 漯河 462000]

目的構建小鼠11β-羥類固醇脫氫酶基因的慢病毒真核表達載體PLJM1-11β-HSD1-GFP，建立小鼠前體脂肪細胞（3T3-L1）高表達基因的穩定感染細胞株，為基因的功能研究奠定基礎。方法利用逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）從小鼠肝臟cDNA中擴增11β-HSD1開放閱讀框ORF，構建針對基因的真核表達載體，轉化感受態DH5α菌株，抽提質粒并進行測序鑒定。用測序成功的質粒和慢病毒包裝質粒共同轉染293T細胞，產生慢病毒并轉染3T3-L1細胞。根據綠色熒光效率挑取單克隆細胞團篩選出穩定細胞株，通過Western blot鑒定PLJM1-11β-HSD1-GFP轉染成功。結果經酶切、PCR及測序驗證，PLJM1-11β-HSD1-GFP真核表達載體構建成功，并包裝慢病毒，綠色熒光效率90%以上，并利用其慢病毒懸液成功感染3T3-L1細胞，篩選出的穩定感染細胞株的3T3-L1細胞成功高表達11β-HSD1蛋白。結論成功構建了基因的真核表達載體，并建立高表達的穩定感染細胞株PLJM1-11β-HSD1-GFP-3T3-L1，為進一步研究基因的功能，特別是在肥胖中的研究奠定了基礎。

基因；真核表達載體；前體脂肪細胞；肥胖

11β-羥類固醇脫氫酶（11beta-hydroxysteriod dehydrogenase，11β-HSD1）在體內廣泛分布，表達于脂肪、肝臟、肌肉、性腺及中樞神經系統等，以脂肪組織和肝臟中的含量最高[1]。它是糖皮質激素的代謝酶，有重要的生物學活性，有還原酶與氧化酶的雙重作用，但以還原酶作用為主，需要煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸（NADP+）參與，有活化糖皮質激素的作用，可以使人體無活性的可的松（動物的皮質酮）轉化為有活性的氫化可的松（皮質醇）[2]。資料顯示，11β-HSD1的轉基因小鼠顯示內臟脂肪組織肥厚；在代謝綜合征患者脂肪庫中細胞內11β-HSD1的活性是普遍增加的[3]。這可能與糖皮質激素能增加脂肪細胞內合成代謝有關，而11β-HSD1主要使糖皮質激素活化，提示其可能與向心性肥胖、胰島素抵抗及糖尿病有關[4]。本研究擬構建基因的真核表達載體，并建立高表達該基因的穩定感染細胞株，以進一步研究該基因與肥胖、胰島素抵抗及糖脂代謝相關性。

1 材料與方法

1.1 材料

PolyATtract_Series9600TMmRNA Isolation System試劑盒、末端轉移酶（TdT）、逆轉錄酶（AMV）及Taq DNA聚合酶均購自美國Promega公司，焦碳酸二乙酯（DEPC）及ExpandTMTemplate PCR System購自日本TaKaRa公司，DH5α菌株及PLJM1-NRG1-GFP載體由南京醫科大學分子遺傳研究室李建民教授饋贈，Lipofectamine 2000細胞轉染試劑盒購自美國Invitrogen公司，3T3-L1前體脂肪細胞株、293T細胞購自上海細胞生物研究所，DMEM培養液、10%胎牛血清購自南京生興公司，3-異丁基-1-甲基磺嘌呤（MIX）、胰島素及地塞米松購自美國Sigma公司，11β-HSD1兔源抗體購自美國Research Genetics公司，二抗羊抗兔IgG-辣根過氧化物酶及β-actin抗體購自武漢生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設計根據GenBank登錄號NM_008288 mRNA序列設計引物，由上海華大基因科技有限公司合成。正向引物：GGGGCTAGCGGATCCGCCACC ATGGCAGTTATGAAAAATTACC；反向引物：GGGG AATTCCTCGAGCCTAGTTACTTACAAACATGTCC。正向引物酶切位點為，反向引物酶切位點為擴增目的片段大小881 bp。

1.2.2 小鼠肝臟總RNA的抽提用PolyAT-tract_Series9600TMmRNA Isolation System試劑盒提取BABL/C 8周的小鼠肝臟組織總RNA，提取2μl經瓊脂糖凝膠電泳觀察總RNA完整性，并用紫外分光光度計分別測定260 nm、280 nm波長下的光密度（OD）值，并檢測總RNA的純度，其余RNA于-70℃冰箱冷凍保存。

1.2.3 逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）擴增目的基因取2μg mRNA加入PrimeSriptTMRT reagent Kit逆轉錄反應體系中，42℃孵育90 min，逆轉錄合成cDNA，結束后加入RNAase H內切酶，37℃孵育30 min，降解RNA。以上述小鼠的cDNA為模板擴增目的片段。PCR的反應條件為：94℃預變性5 min，94℃30 s，54℃30 s，72℃延伸1 min，35個循環，72℃10 min，4℃2 min，獲取小鼠基因全長開放閱讀框ORF。

1.2.4 真核表達質粒PLJM-11β-HSD1-GFP制備以上述小鼠3T3-L1細胞的cDNA為模板，相應引物擴增11β-HSD1全長ORF，用TaKaRa DNA Fragment Purification Kit純化靶DNA片段。將純化后的PCR產物行雙酶切。對酶切后產物用1%瓊脂糖凝膠行電泳檢測。并在切膠儀上切下目的片段。用Ultra-Sep Gel Extraction Kit（OMEGA）純化切膠產物。將酶切純化后的目的片段11β-HSD1連接至PLJM1-NRG1（NheI/EcoRI）載體（10μl體系：目的片段2μl，載體1μl，2×Ligase buffer 5μl，T4連接酶1μl，ddH2O 1μl；條件22℃1 h）。用連接產物轉化大腸桿菌DH5α菌株，在氨芐青霉素（Ampicillin，Amp）抗性的LB固體平板上生長過夜（37°孵箱16～18 h）。在過夜后的固體平板上挑取5個單克隆，分別加至Amp抗性的5 ml LB培養基里搖菌過夜并做好標記，次日以菌液為模板，以11β-HSD1-F/R為引物作PCR并行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。對獲取的陽性克隆進行保種，同時經堿裂解法提取質粒DNA，以CMV-F和11β-HSD1-R為測序引物并送上海華大基因科技有限公司進行測序。

1.2.5 序列分析應用NCBI網站BLAST分析軟件，對上述測序結果進行序列比對，鑒定PLJM1-11β-HSD1-GFP載體多克隆位點區表達序列的可靠性和準確性。

1.2.6 PLJM1-11β-HSD1-GFP-3T3-L1慢病毒細胞株的構建用中抽試劑盒抽取質粒PLJM1-11β-HSD1-GFP及空載對照質粒PLJM.1，保證OD值1.8～1.9，濃度在1 000μg/ml以上。轉染前24 h將處于對數生長期的293T細胞鋪6 cm培養皿，2×106～4×106個/皿。轉染體系如下：質粒PLJM1-11β-HSD1-GFP（或空載對照質粒PLJM.1）4μg，包裝質粒PVSVG 2μg，delta 8.91 3μg，與Lipofectamine 2000 20μl混合共同孵育形成復合物，然后轉染293T細胞。轉染后24 h換液3 ml，并用熒光顯微鏡觀察拍照。轉染后48和72 h收集包裝產生的病毒上清，經0.45μm濾膜過濾后加入polybrene（Millipore），使終濃度為10μg/ml。感染前24 h將3T3-L1細胞接種至6 cm培養皿，使感染前細胞密度為10%～20%。24 h后棄去培養液，用上述病毒上清3 ml感染靶細胞，37℃培養6 h后換液加入3 ml完全培養液DMEM。感染48 h后觀察熒光表達情況。根據熒光效率挑單克隆篩選穩定轉染株，并進行冷凍保存。

1.2.7 Western blot檢測分別提取正常3T3-L1細胞、高表達11β-HSD1的3T3-L1及轉入空載質粒的3T3-L1細胞的總蛋白質，用考馬斯亮藍法測定蛋白質濃度，制備14.7%分離膠和5%濃縮膠，60 V穩壓電泳；半干轉膜，封閉，按Western blot檢測試劑盒說明書進行操作。一抗為11β-HSD1多克隆抗體（抗體濃度為1∶200），二抗為羊抗兔IgG-辣根過氧化物酶，（抗體濃度為1∶800），用免疫印跡增強化學發光法分別檢測3組細胞株的11β-HSD1蛋白表達水平。實驗所得的Western blot條帶經Photoshop軟件處理，在Bandscan分析軟件中測得各自總度值，采用自身β-actin灰度值校正并進行定量分析。實驗數據輸入Excel數據庫用Excel軟件進行作圖。

1.3 統計學方法

采用SPSS 14.0統計學軟件對本研究中的數據進行分析和處理，計量資料應用均數±標準差（±s）表示，采用配對檢驗，<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 小鼠11β-HSD1 ORF片段擴增及載體克隆

以小鼠肝臟cDNA為模板，用正向引物和反向引物進行PCR擴增，得到小鼠11β-HSD1 ORF片段，目的片段為881 bp（見圖1）。

2.2 PLJM1-11β-HSD1-GFP重組載體的鑒定

以正向引物與反向引物進行PCR擴增，用Promega PCR純化試劑盒進行純化，酶切產物（見圖2）行切膠純化，將純化后產物連接至PLJM1-NRG1-GFP載體。隨機選取5個陽性克隆，行PCR鑒定（見圖3），獲取的陽性克隆經堿裂解法提取質粒DNA測序（見圖4），測序結果經序列比對分析確認無任何突變、插入等異常，慢病毒載體PLJM1-11β-HSD1-GFP構建成功（見圖5）。

2.3 慢病毒載體轉染293T細胞

圖1 小鼠11β-1基因ORF擴增片段

圖2 小鼠11β-1基因PCR酶切產物

圖3 小鼠11β-基因ORF片段單克隆PCR結果

慢病毒載體PLJM1-11β-HSD1-GFP轉染293T細胞24 h后熒光顯微鏡拍照見圖6，綠色熒光效率90%以上。

2.4 收取病毒上清感染3T3-L1細胞

收取293T細胞病毒上清感染3T3-L1細胞，48 h后熒光顯微鏡拍照結果見圖7。

2.53 T3-L1單克隆細胞株綠色熒光蛋白的表達

根據熒光情況挑單克隆并篩選穩定感染細胞株，3T3-L1單克隆細胞株綠色熒光蛋白的表達見圖8。

圖4 PLJM1-11β-HSD1-GFP質粒測序圖

圖5 PLJM1-11β-HSD1-GFP質粒序列比對圖

圖6 重組質粒轉染293T細胞后綠色熒光蛋白的表達（熒光顯微鏡×100）

圖7 重組質粒轉染3T3-L1細胞后綠色熒光蛋白的表達（熒光顯微鏡×100）

2.6PLJM1-11β-HSD1-GFP質粒轉染3T3-L1細胞蛋白水平驗證

分別提取3T3-L1、PLJM1-3T3-L1及PLJM1-11β HSD1-GFP-3T3-L1細胞組蛋白進行Western blot檢測，結果提示PLJM1-11βHSD1-GFP質粒轉染成功，PLJM1-11β-HSD1-GFP-3T3-L1組11β-HSD1蛋白表達水平明顯升高，見圖9。

圖83 T3-L1單克隆細胞株綠色熒光蛋白的表達（熒光顯微鏡×100）

圖9 各組細胞11β-HSD1蛋白表達情況

3 討論

11β-HSD1作為一種微線粒體酶，主要負責有活性與無活性的糖皮質激素之間的互相轉化，通過控制底物即糖皮質激素的利用率，從而調控組織特異性糖皮質激素受體的活性[5-6]。11β-HSD有2種同工酶。其中11β-HSD2是輔酶Ⅰ（NAD）依賴性脫氫酶，主要使活性的可的松變為無活性的氫化可的松。主要作用于鹽皮質激素敏感的靶組織如腎臟，結腸，唾液腺，胎盤等[7]。11β-HSD1直到最近才被發現并認為是重要的生物酶，是還原型輔酶Ⅱ（NADPH）依賴性的還原酶，與11β-HSD2作用相反，主要負責將無活性的氫化可的松轉化為有活性的可的松[8]。它廣泛分布于各組織，主要分布于肝臟、脂肪、性腺、腦、脈管系統等，這些組織則以糖皮質激素受體占優勢。研究表明，11β-HSD1調節糖皮質激素受體與配體的結合，參與了庫欣綜合征相似的疾病的發生發展，如向心性肥胖、糖尿病、多囊卵巢綜合征以及癡呆[9-10]。

慢病毒（Lentivirus）載體是以人類免疫缺陷病毒-1（HIV-1）為基礎發展起來的基因治療載體[11]。攜帶有目的基因的慢病毒載體在慢病毒包裝質粒及細胞系的輔助下，經過病毒包裝成為有感染力的病毒顆粒，通過感染細胞或組織，實現目的基因在宿主細胞中得到長期而穩定的表達[12]。經過改建后的慢病毒載體能夠容納約10 kb左右的外源基因，因此大多數的cDNA都能夠被克隆入慢病毒載體。293T細胞由293細胞派生，屬人腎上皮細胞系，作為包裝細胞，在包裝后產生了高滴度的病毒顆粒，同時表達目的基因。

本文利用慢病毒載體技術成功構建了帶有GFP目的基因HSD1的慢病毒載體PLJM1-HSD1-GFP，同時建立了3T3-L1穩定感染細胞株PLJM1-HSD1-GFP-3T3-L1，為進一步研究HSD1的生物學功能奠定了必要的基礎。

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（張蕾編輯）

Construction and role of mouse PLJM1-11β-HSD1-GFP plasmid

Jing Xin1,Lei Ye2,Ke Yang1,Ya-fei Shen1,Fei Deng1
(1.Department of Endocrinology,Luohe Central Hospital,Luohe,Henan 462000,China;2.Department of Neurology,the People's Hospital of Shaoling District,Luohe,Henan 462000,China)

ObjectiveTo construct a lentiviral vector of PLJM1-11β-HSD1-GFP and establish a stable cell line of 3T3-L1 with high expression of mousegene,and lay the foundation for the research ofgene.MethodsOpen reading frame(ORF)fragment of mouse tissues by RT-PCR,then inserted into the PLJM1-NRG1-GFP vector and transformed into competent DH5α strain ofThe plasmid was extracted and used for sequencing.The successfully-sequenced plasmid PLJM1-11β-HSD1-GFP and the packaging plasmid were transfected to 293T cell line to produce recombinant lentivirus.3T3-L1 cell line was transfected by recombinant virus and the stable cell line was isolated by selecting the single clone with GFP,and high expression of 11β-HSD1 was identified by Western blot.ResultsThe eukaryotic expression vector of PLJM1-11β-HSD1-GFP was constructed and confirmed by DNA sequencing.The lentivirus vector ofnamed PLJM1-11β-HSD1-GFP was successfully constructed and the virus was packaged in 293T cells.3T3-L1 cells were transfected by recombinant virus and the stable cell line was selected by green fluorescence efficiency,which showed that the lentivirus vector transfection rate was over 90%.A dramatically elevated protein level of 11β-HSDl was expressed in the positive clones of 3T3-L1 cells compared with the control group.Conclusions Mouse PLJM1-11β-HSD1-GFP plasmid has been successfully constructed.The 3T3-L1 cellsgene was amplified from mouse livertransfected by PLJM1-11β-HSD1-GFP could effectively elevate the expression ofgene,and can be used in the functional researches of mousegene,especially those related to obesity.

gene;eukaryotic expression vector;3T3-L1 cell;obesity

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.16.003

1005-8982（2017）16-0012-06

Q782

A

2016-11-28