胃癌中高表達的CBX7對細胞遷移、侵襲的影響

宗華，秦杰，李紅春，朱立元

（廣東省深圳市第三人民醫院普外科，廣東 深圳 518000）

胃癌中高表達的CBX7對細胞遷移、侵襲的影響

宗華，秦杰，李紅春，朱立元

（廣東省深圳市第三人民醫院普外科，廣東 深圳 518000）

目的探究人胃癌組織中染色盒同源物7（CBX7）的表達及對胃癌細胞侵襲能力的影響。方法收集2013年1月1日-2015年1月1日間于該院普通外科行手術切除的45例胃癌及對應癌旁組織，免疫組織化學染色觀察CBX7蛋白表達，分析胃癌組織中CBX7蛋白表達高低與腫瘤臨床特征的關系。通過重組質粒在胃癌SGC-7901細胞中過表達CBX7，經Transwell小室實驗確定CBX7過表達對胃癌細胞遷移侵襲的作用。結果CBX7在胃癌組織中表達較癌旁組織下降（=3.517，=0.000），胃癌組織低表達CBX7與腫瘤淋巴結轉移（χ2=5.829，=0.022）及高TNM分期（Ⅲ+Ⅳ期，χ2=4.465，=0.047）相關。過表達CBX7對SGC-7901的遷移（=42.040，=0.000）及侵襲（=40.119，=0.000）具有顯著的削弱作用。結論CBX7在胃癌組織中表達降低，過表達CBX7能夠通過抑制胃癌細胞遷移及侵襲發揮抗腫瘤作用。

CBX7；胃癌；遷移；侵襲

胃癌是我國常見的消化系統惡性疾病，幽門螺桿菌感染是胃癌發生的主要危險因素之一[1]。由于胃癌早期僅有腹痛、納差等非特異性表現，許多患者就診時已失去根治性手術機會。目前，生物靶向診斷及治療被認為是改善胃癌患者預后的重要方法之一。

染色盒同源物7（chromobox homolog 7，CBX7）是黑腹果蠅的異染色質蛋白在人類細胞中的同源物，定位于人染色體22q13.1上，共有6個外顯子，其編碼的蛋白質主要分布于細胞核的染色質當中，通過與染色質的結合而發揮其調節功能[2]。但CBX7在胃癌中的表達及其生物學功能尚不完全清楚。

本研究在胃癌組織中檢測了CBX7的表達，并探究CBX7表達與腫瘤臨床特征間的相關性。利用基因重組技術過表達胃癌SGC-7901細胞中的CBX7，檢測過表達CBX7后細胞遷移與侵襲的變化。旨在為CBX7成為胃癌診斷生物學標志物及治療靶點提供一定的研究依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料和試劑

本研究共收集在2013年1月1日-2015年1月1日行手術切除的胃癌及對應癌旁組織45例。其中男性31例，女性14例；年齡在47～65歲之間，中位年齡53歲。所有入組患者均簽署研究知情同意書。切取組織標本于4%多聚甲醛溶液中保存。Trizol試劑及轉染試劑均購自美國英威捷公司。逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）試劑盒、實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）試劑盒購自北京天根生物科技有限公司。CBX7正向引物（5'-CCTGCTTCCTGGTCAC TTTC-3'；反向引物5'-CAG GGAGCTGGCTCACTA CA-3'）及β-actin正向引物（5'-CTCCATCCTGGCC TCGCTGT-3'；反向引物5'-GCTGTCACCTTCACCGT TCC-3'）引物由北京天根生物科技有限公司合成。SP免疫組織化學檢測試劑盒由北京中杉金橋公司提供。基于pEX-1（pGCMV/MCS/EGFP/Neo）真核表達載體（貨號：C05001）的CBX7過表達質粒由上海吉瑪生物科技有限公司合成提供，以空載體質粒為對照質粒。CBX7及β-actin抗體均購自美國Santa Cruz公司，人胃癌SGC-7901細胞由廣東省深圳市第三人民醫院實驗室保存，Transwell小室購自美國康寧公司，基質膠購自美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學染色石蠟包埋的組織切片首先脫蠟、水化，進而行高壓抗原修復。通過3%雙氧水H2O2滅活內源性氧化物酶，10%血清封閉；以1×PBS溶液配制1∶100兔抗人CBX7抗體工作液充分覆蓋組織切片；4℃孵育一抗過夜，次日洗去多余一抗，并滴加相應物種二抗工作液；洗凈多余二抗后用HRP-BIO復合物，反應后使用DAB進行顯色。每張切片在×400放大下隨機選取10個視野觀察陽性表達細胞數量，按0分，<5%；1分，6%～25%；2分，26%～50%；3分，51%～75%及4分，>75%的方法計分[3]。以每張切片的平均得分為最終得分。

1.2.2 qRT-PCR檢測按試劑說明書采用氯仿-苯酚抽提法提取SGC-7901細胞總RNA。定量500 ng細胞總RNA，按逆轉錄說明書配置逆轉錄體系，采用42℃孵育15 min后95℃孵育30 min之步驟合成cDNA。取2μl cDNA為模板，按說明書配制qPCR反應體系，使用Bio-Rad Real-time PCR擴增儀進行PCR擴增CBX7及β-actin。

1.2.3 質粒轉染SGC-7901細胞在含10%FBS的1×DMEM培養基中培養至穩定傳代2、3代。按過夜增殖至愈合度達70%之密度接種6孔細胞培養板。達到預定培養密度后移除培養基，1×PBS溶液充分洗滌細胞。轉染分組：CBX7組加入2 500 ng/孔CBX7質粒及5μl轉染試劑；對照組加入2 500 ng/孔陰性對照質粒及5μl轉染試劑。添加DMEM培養液至終體積2 ml/孔。6 h后更換正常培養基繼續培養。

1.2.4 Western blot檢測提取轉染72 h后的SGC-7901細胞總蛋白。垂直電泳分離蛋白后以70V恒壓轉膜120 min，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h；以1∶1 000稀釋的CBX7抗體及β-actin抗體4℃下孵育相應條帶過夜。洗去殘余一抗后采用1∶5 000稀釋的HRP標記山羊抗兔或抗鼠二抗室溫孵育條帶1 h。于暗室內，ECL法發光觀察蛋白表達。

1.2.5 Transwell小室檢測按1∶8比例采用DMEM培養液稀釋基質膠后，100μl/孔包被Transwell小室膜的上室面制成包膠小室來檢測細胞侵襲；采用未包膠小室來檢測細胞遷移。取轉染72 h后的SGC-7901細胞，使用無血清培養基重懸細胞至5×105個/ml，上層小室每室加入250μl細胞懸液，培養室中加入含10%胎牛血清的培養基，置于37℃、5%二氧化碳CO2孵箱中培養12 h。用棉簽擦凈上室面細胞，4%多聚甲醛固定下室面細胞，Giemsa染液染色。100倍光鏡下隨機選擇10個視野計數下室面的細胞個數。以每個小室的平均細胞數為最終計數。

1.3 統計學方法

采用SPSS13.0統計軟件進行分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，配對檢驗分析CBX7在患者標本中的表達，成組檢驗分析其余計量資料。χ2檢驗分析計數資料。<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 胃癌中CBX7的表達

通過免疫組織化學染色發現CBX7蛋白主要定位于胃癌細胞及正常胃腺細胞的細胞核中（見圖1），以胃癌組織中CBX7免疫組織化學染色評分的均值為界，45例胃癌組織可劃分為CBX7低表達組（=33）及高表達組（=12）。對兩類組織中CBX7免疫組織化學評分進行統計學分析表明胃癌組織中CBX7蛋白的表達低于癌旁組織（1.24±0.31）vs（3.52±0.47），差異有統計學意義（=3.517，=0.000）。

2.2 CBX7在胃癌的臨床意義

針對不同CBX7表達量的兩組患者進行統計分析表明，淋巴結轉移（χ2=5.829，=0.022）及高TNM分期（III+IV期，χ2=4.465，=0.047）等顯示腫瘤惡性程度較高的病理特征較多出現在CBX7低表達的胃癌組織中。見附表。

2.3 過表達CBX7抑制SGC-7901細胞遷移及侵襲

圖1 CBX7在胃癌及癌旁組織中的表達（×400）

圖2 過表達CBX7對SGC-7901遷移及侵襲的影響

向SGC-7901細胞內轉染入重組CBX7過表達質粒后，過表達CBX7后胃癌細胞內CBX7 mRNA（=37.028，=0.000，見圖2A）和蛋白（=39.156，=0.000，見圖2B）的表達都明顯提高。過表達CBX7后采用Transwell小室檢測發現CBX7組遷移細胞數量（74.201±5.592 vs 35.374±5.217），差異有統計學意義（=42.040，=0.000），侵襲細胞數量（38.188±7.171 vs 16.224±3.113），差異有統計學意義（=40.119，=0.000），說明CBX7對細胞遷移及侵襲能力具有負向調控作用（見圖2C）。

附表CBX7表達與GC患者臨床病理特征的關系例

3 討論

CBX7屬于多梳蛋白家族，其在哺乳動物大腦、心臟、腎臟及骨骼肌中均有表達以維持正常組織的生長發育[4]。近年來的研究發現CBX7在腫瘤中具有多種生物學功能，可以通過下調INK4α/ARF信號通路而抑制腫瘤細胞增殖[5]，作為MIR-9[6]及MIR-375[7]等多種microRNA的靶基因而對細胞侵襲發揮調控作用，還能夠促進腫瘤干細胞增殖和自我更新[8]。本研究發現，CBX7低表達于胃癌組織中。淋巴結轉移及高TNM分期也較多的出現在CBX7低表達患者中，提示CBX7可能通過下調胃癌細胞侵襲而促進腫瘤發展。陳敏等[9]在甲狀腺乳頭樣癌中的研究也表明CBX7在腫瘤中的表達下調，說明CBX7的異常表達可能對腫瘤早期診斷具有一定的指導意義。

本研究通過基因重組技術提高了胃癌SGC-7901細胞中CBX7的表達，同時SGC-7901細胞的遷移及侵襲在過表達CBX7后也明顯下調。上皮細胞間質化改變是影響細胞遷移及侵襲能力的重要機制之一[10]，KARAMITOPOULOU等[11]在胰腺癌中的研究發現，在組織學分化越差的胰腺癌組織中CBX7表達量越低，在胰腺癌細胞中過表達CBX7也可以提高E-cadherin的表達。預后分析還提示，低CBX7表達的胰腺癌患者生存期明顯縮短。

綜上所述，CBX7的低表達在人類惡性腫瘤中具有一定的普遍性，且CBX7能夠抑制多種腫瘤細胞的侵襲能力，是一種潛在的生物治療靶點。

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[3]LI C,YANG W,ZHANG J,et al.SREBP-1 has a prognostic role and contributes to invasion and metastasis in human hepatocellular carcinoma[J].Int J Mol Sci,2014,15(5):7124-7138.

[4]GIL J,BERNARD D,MART?NEZ D,et al.Polycomb CBX7 has a unifying role in cellular lifespan[J].Nat Cell Biol,2004,6(1):67-72.

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[9]陳敏.CBX7蛋白在甲狀腺乳頭狀癌中的表達及意義[J].中國組織化學與細胞化學雜志,2015,24(2):185-188.

[10]TANG H,ZHAO J,ZHANG L,et al.SRPX2 enhances the epithelial-mesenchymal transition and temozolomide resistance in glioblastoma Cells[J].Cell Mol Neurobiol,2016,36(7):1067-1076.

[11]KARAMITOPOULOU E,PALLANTE P,ZLOBEC I,et al.Loss of the CBX7 protein expression correlates with a more aggressive phenotype in pancreatic cancer[J].Eur J Cancer,2010,46(8):1438-1444.

（張蕾編輯）

CBX7 expression in human gastric cancer and its role in cell migration and invasion

Hua Zong,Jie Qin,Hong-chun Li,Li-yuan Zhu
(Department of General Surgery,the Third People's Hospital of Shenzhen,Shenzhen,Guangdong 518000,China)

ObjectiveTo study the expression of chromobox homolog 7(CBX7)in human gastric carcinoma and its role in cell migration and invasion.MethodsImmunohistochemical method was applied to detect the expression of CBX7 in gastric cancer and matched tumor-adjacent tissues of 45 patients.The correlations between CBX7 expression and clinical features were analyzed by Pearson chi-square test.Recombinant CBX7 plasmid was used to over-express CBX7 in SGC-7901 cells.The effect of CBX7 on cell migration and invasion was measured by Transwell assay.ResultsThe expression of CBX7 was significantly down-regulated in the gastric cancer tissues,and the low expression of CBX7 was associated with lymphatic metastasis and advanced TNM stage(stageⅢandⅣ)(<0.05).Over-expression of CBX7 inhibited the migration and invasion of SGC-7901 cells(<0.05).ConclusionsCBX7 expression is decreased in gastric cancer tissues.Up-regulation of CBX7 expression could play an anti-cancer role through inhibition of cell migration and invasion.

CBX7;gastric cancer;migration;invasion

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.16.008

1005-8982（2017）16-0040-04

R735.2；

A

2016-11-21