不同結核桿菌檢測方法的臨床應用價值

王江峰，石 梁，夏建新

（紅安縣人民醫院，湖北 黃岡 438400）

不同結核桿菌檢測方法的臨床應用價值

王江峰，石 梁，夏建新

（紅安縣人民醫院，湖北 黃岡 438400）

目的探討羅氏培養、熒光聚合酶鏈反應技術（PCR）、痰涂片試驗、增菌聚合酶鏈反應技術（PCR）四種檢測方法對結核桿菌檢測的臨床應用價值。方法選取我院2015年6月～2016年6月收治的結核病患者60例分為觀察組，將同期收治的非結核病患者40例作為對照組。采集所有患者的痰液標本先后進行羅氏培養、PCR技術、痰涂片試驗、增菌PCR技術檢測，記錄檢測結果，比較不同檢測方法的檢測價值。結果觀察組患者檢測結果顯示，羅氏培養檢出痰液標本陽性14例，陽性率為23.33%；PCR技術檢出痰液標本陽性33例，陽性率為55.00%；痰涂片試驗檢出痰液標本陽性19例，陽性率為31.67%；增菌PCR技術檢出痰液標本陽性40例，陽性率為66.67%。對照組患者檢測結果顯示，四種檢測方法對痰液標本陽性檢出率均為0。增菌PCR技術對痰液標本陽性檢出率＞PCR技術＞羅氏培養＞痰涂片試驗，差異有統計學意義（P＜0.05）。結論臨床檢測結核桿菌的方法眾多，增菌PCR技術、PCR技術對結核桿菌的特異性強，敏感度高，操作簡單，檢測時間短，適合作為對結核桿菌檢測的實驗室首選檢測方法。

羅氏培養；PCR技術；痰涂片試驗；增菌PCR技術；結核桿菌檢測

結核病是一種因感染結核桿菌（TB）引起的慢性疾病，具有強傳染性。會侵犯主要臟器，引起肺結核、結核性胸膜炎、腎結核等多種疾病，不同發病階段的癥狀有所差異，增加了診斷難度[1]。我國是肺結核高負擔國家，結合病患者人數已經超過千萬，且25%的結核病患者具有傳染性。不僅增加了患者的痛苦，給患者及其家庭帶來了巨大的經濟壓力，還威脅他人安全，成為社會公共衛生問題。盡早明確診斷，及時規范治療多數患者可以治愈。實驗室結核桿菌檢測方法眾多，尋找檢測特異性強，操作簡單、快捷的檢測方法是臨床關注的重點[2]。本文就增菌PCR技術、羅氏培養、PCR技術、痰涂片試驗對TB檢測情況進行探討，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取我院2015年6月～2016年6月收治的60例結核病患者（觀察組）及同期收治的40例非結核病患者（對照組）。觀察組中男38例，女22例，年齡38～72歲，平均（54.6±4.1）歲。所有患者均符合中華醫學會結核病學分會關于結核病的診斷標準，患者均簽署《知情同意書》。對照組中男25例，女15例，年齡36～71歲，平均（54.3±4.0）歲，疾病類型：支氣管肺炎20例，間質性肺炎9例，細菌性肺炎5例，肺癌4例，肺膿瘍2例。

1.2 方法

1.2.1 檢測材料

在患者入院后次日清晨，分別采集兩組患者的痰液標本進行TB檢測。培養基為本院自制的酸性改良羅氏培養基，液體培養基為美國Becton Dickinson公司提供的Middlebrook 7H9液體培養基+10% OADC營養添加劑。不同結合桿菌標準菌株由上海肺科醫院實驗室提供，結合桿菌試劑盒由博奧生物有限公司負責提供。PCR擴增試劑盒由上海生工生物工程股份有限公司提供，嚴格按照實驗室檢驗標準進行操作。

1.2.2 檢測方法

痰涂片、羅氏培養：用4%氫氧化鈉將痰液標本進行液化后加入PBS，在離心機中以3000 r/min的速離心5 min，去除上清液。PBS重懸后再次離心5 min，洗滌兩次后沉淀。用PBS重懸、混勻后吸出0.1 mL，依次進行增菌PCR、羅氏培養、PCR、痰涂片試驗。

PCR：將0.1 mL處理后的待檢標本進行裂解液（蛋白酶K+Chelex）提取DNA，取一直單管PCR反應管，依次加入樣品、陰性質控品、2 μL陽性質控品。在離心機中以8000 r/min的速離心10 s后放入PCR儀。PCR擴增溫度為94°C，變性5 min，94°C時變性1 min，68°C時變性1 min，72°C時變性1 min，循環35次。再72°C延伸5 min，通過PCR-ELISA鑒定擴增產物。將擴增產物加入包被有結核桿菌包被的生物素標記探針的ELISA波板上，0.1 mL/孔。在37°C溫度中孵育1小時后洗板5次，加入有鏈霉親和素標記的過氧化物酶。在37°C條件下作用15 min，洗板5次后完全去除上清液。再加入TMB顯色液0.1 mL，在37°C條件下反應10 min后加入終止液0.1 mL，通過酶標儀判定反應物在450 nm時的吸光值，記錄檢測結果。

增菌PCR試驗：將0.1 mL處理后的待檢標本接種于1 mL血平板培養基，溫度為37°C，PH值維持在6.5～7.0，培養4～7天后判定PCR檢測結果

1.3 統計學方法

采用SPSS 13.00統計學軟件對數據進行分析，計數資料百分數（%）表示，采用x2檢驗；以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 不同檢測方法的檢測結果

羅氏培養、痰涂片試驗、PCR技術、增菌PCR檢測除觀察組痰液標本陽性率分別為23.33%、31.67%、55.00%、66.67%；四種檢測方法對對照組痰液標本陽性率均為0；增菌PCR技術對痰液標本陽性檢出率＞PCR技術＞羅氏培養＞痰涂片試驗，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 不同檢測方法的檢測結果（n，%）

2.2 細菌學檢查與PCR、增菌PCR檢測結果對比

觀察組60例患者細菌學檢查結果顯示涂陽培陽21例，涂陽培陰9例，涂陰培陽26例，涂陰培陰32例；7天增菌PCR檢測陽性率與細菌學檢查結果，差異無統計學意義（P＞0.05）；7天增菌PCR檢測陽性率明顯優于PCR，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 細菌學檢查與PCR、增菌PCR檢測結果比較 [n（%）]

2.3 PCR的特異性、敏感性

將HE7RV結核桿菌標準菌株調制1 mg/mL后進行稀釋，分別進行PCR、增菌PCR（4d、7d）。陰性：檢測含有TB的DNA；陽性：樣品中含有TB基因或表達產物。利用增菌PCR對牛分支桿菌、結核分枝桿菌等多種病原菌培養物檢測結果顯示，12中非TB檢測結果均為陰性，牛分支桿菌、結核分枝桿菌為陽性，說明PCR對結合TB的特異性、敏感性強。

3 討 論

我國結核病患者人數眾多，其具有傳染性的特點給患者及社會帶來了巨大的挑戰。TB是結核病患者的主要致病因，盡早明確患者是否存在TB對疾病的診治十分重要[3]。主要通過細菌學檢查明確患者是否存在TB感染、傳染源，細菌學檢查是臨床診斷結核病的“金標準”，對結核疾病的診斷及治療方案的選擇具有重要作用[4]。實驗室檢測TB的方法較多，不同檢測方法各具特色，尋找特異性強、敏感性強、操作簡單、準確檢出率高的檢測方法是臨床檢驗科醫師關注的重點。

痰涂片是細菌學檢查的基本方法，操作簡單，價格低廉，當天即可獲得檢測結果[5]。明確痰細菌類型，對痰液中的細菌在不同培養基中進行培養，通過觀察生長情況了解細菌種類。同時能進行藥敏分析，對合理用藥提供指導意見。但是，痰涂片不能分辨活菌、死菌，且細菌數量達到5000～1000條/mL時才能顯示陽性，當細菌數量未達到上述標準時就會有假陽性結果，特異性差[6]。且多種抗酸桿菌進行痰涂片時都會著色，難以辨別TB，需要通過進一步試驗才能確診，存在明顯的缺陷。細菌學檢測對TB敏感性強，但是需要1～2月才能得出檢測結果，不適用于急診檢測患者。TB、非TB菌株在細菌學培養時均會生長，需要通過菌種鑒定才能明確是否存在TB，在臨床實際運用中存在明顯的不足。隨著檢驗醫學的不斷進步，PCR技術在臨床的應用得到了廣大醫務人員的肯定[7]。PCR具備分子生物診斷技術、核酸擴增技術，是生物學領域的先進檢測方法，在結核病的診斷中發揮著明顯的優勢。具有檢測速度快，靈敏度高，特異性強的特點，TB桿菌生長速度慢，通過PCR可以迅速得出診斷結果，為患者的診治提供準確的診斷依據。

PCR有常規PCR、增菌PCR兩種檢測方式，本文將PCR兩種檢測方法與痰涂片、羅氏培養對人體TB檢測情況進行對比觀察發現，增菌PCR對觀察組痰標本陽性檢出率為66.67%，PCR對觀察組痰標本陽性檢出率為55.00%，明顯優于痰涂片（31.67%）、羅氏培養（23.33%），由表1可知PCR對TB檢出率明顯優于羅氏培養、痰涂片，尤其是增菌PCR對TB的陽性檢出率明顯高于其他方法，而無結核桿菌感染的對照組均未檢出陽性標本，無假陽性結果，說明PCR對TB檢出率高，特異性強[8]。將PCR、增菌PCR檢測結果與細菌學檢查結果進行對比觀察發現，PCR兩種檢測方法對涂陽培陽、涂陽培陰、涂陰培陽檢出率幾乎達到100%，但是PCR對涂陰培陰痰液標本陽性檢出率低，僅為18.75%，增菌PCR（4d）檢出率為31.25%，增菌PCR（7d）檢出率為56.25%，說明增菌PCR檢出率明顯優于超過PCR。

增菌PCR在對痰液標本進行處理基礎上在液體培養基中培養4～7天后再進行特點DNA片段擴增進行TB檢測的一種方法，對標本進行預培養使細菌數量增加，加入液體培養基后稀釋了擴增抑制物，使細菌高度表達，大大提高了陽性檢出率[9]。標本中存在活菌時通過細菌培養后數量會明顯增多，標本中不含活菌經過細菌培養后細菌數量不增加，從而保證了陽性檢出率的準確性，減少假陽性結果。由表2可知，7天增菌PCR后對涂陰培陽、涂陰培陰陽性檢出率明顯優于4d增菌PCR、常規PCR，差異有統計學意義（P＜0.05）。增菌PCR的液體培養時間比常規PCR長，但是靈敏度更強[10]。常規PCR在進行痰標本檢測時，標本中含有死菌時也會有陽性結果，影響結果的準確性。但是，通過與羅氏培養進行對比發現，增菌PCR的檢測時間相對較短，而結核病患者一般病程漫長，結核菌生長速度緩慢，可以作為TB檢測的常用方法。

綜上所述，在進行TB檢測時，PCR技術具有明顯的優勢，能夠明確痰液標本中是否含有TB。而且，增菌PCR技術在PCR基礎上進行痰液標本培養，大大提升了對TB的特異性、敏感性陽性檢出率高。操作簡單，受外因污染少，檢測結果準確率高，值得作為實驗室檢測TB的常用方法。

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本文編輯：趙小龍

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ISSN.2095-8242.2017.029.5677.02