鐵皮石斛種子在“組織培養(yǎng)技術(shù)”實(shí)驗(yàn)拓展中的應(yīng)用

謝婷婷 李小雪 王 靜 陳 潔 陳炳華

(福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 福州 350117)

鐵皮石斛(Dendrobiumofficinale)，是蘭科石斛屬多年生附生草本植物，亦是一種傳統(tǒng)的中藥材，全株可供藥用，具有抗腫瘤、抗衰老和提高人體免疫力等功效[1]。鐵皮石斛廣泛分布于浙江、福建、安徽、廣西和云南等省，自然生長(zhǎng)于巖石或樹干上。近些年來(lái)，由于人類的過(guò)度采集和生境的破壞，鐵皮石斛的野生種群急劇減少。為滿足市場(chǎng)需求，科研人員利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)開(kāi)展了鐵皮石斛產(chǎn)業(yè)化的生產(chǎn)，成功地培養(yǎng)出種苗，移栽至大棚[1]，進(jìn)而規(guī)?；卦灾灿诶?Pyrus×michauxii)、杉木(Cunninghamialanceolata)和木荷(Schimasuperba)等植株樹干上，帶來(lái)經(jīng)濟(jì)效益的同時(shí)，解決了鐵皮石斛野生資源匱乏的難題。目前，鐵皮石斛種苗的產(chǎn)業(yè)化采用“種子非共生性萌發(fā)”的方法，依據(jù)的原理是其單個(gè)蒴果中種子數(shù)量極多、體積小且無(wú)胚乳，在無(wú)菌的培養(yǎng)基及人工培養(yǎng)條件下，種子萌發(fā)率高。

目前，中學(xué)生做植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)往往由于污染問(wèn)題影響了實(shí)驗(yàn)的成功，其中外植體污染是重點(diǎn)難題之一[2]。在人教版生物學(xué)(選修1)《生物技術(shù)實(shí)踐》的專題3“植物的組織培養(yǎng)技術(shù)”中，采用的材料為新鮮的外植體。由于外植體長(zhǎng)期暴露于空氣中，本身帶有一些菌，加之外植體的結(jié)構(gòu)較不規(guī)整，影響了徹底消毒。眾所周知，在組培實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，愈傷組織的形成是該實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵一步，但在實(shí)踐操作中，往往因?yàn)橄具^(guò)度直接導(dǎo)致外植體的死亡，或者因消毒不充分，將外源菌帶入培養(yǎng)基中，造成培養(yǎng)基的污染，進(jìn)而影響了愈傷組織的形成，最終造成實(shí)驗(yàn)失敗或結(jié)果不理想的多。這些將在一定程度上挫傷學(xué)生對(duì)該實(shí)驗(yàn)的積極性，同時(shí)難以實(shí)現(xiàn)教學(xué)目標(biāo)，導(dǎo)致學(xué)生對(duì)植物組織培養(yǎng)技術(shù)的感性認(rèn)識(shí)缺失。

為此，如果能提供一種自然條件下無(wú)菌或少菌的胚(相當(dāng)于已消毒適當(dāng)?shù)耐庵搀w)為材料，讓學(xué)生開(kāi)展“植物組織培養(yǎng)技術(shù)”實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)成就感和自信心則大大地提升。筆者認(rèn)為，鐵皮石斛的種子是該實(shí)驗(yàn)專題拓展設(shè)計(jì)的好材料，尤其適合于南方地區(qū)的學(xué)校開(kāi)展教學(xué)。

1 實(shí)驗(yàn)材料的選取

鐵皮石斛采自人工種植的苗圃，系自然結(jié)實(shí)的蒴果。鐵皮石斛果實(shí)呈紡錘形，成熟時(shí)果皮由綠轉(zhuǎn)淺黃色，長(zhǎng)約2.4 cm，重不足1 g(表1)。采用“差減法與粘取計(jì)數(shù)法”相結(jié)合[3]的方法對(duì)蒴果內(nèi)種子進(jìn)行科學(xué)計(jì)數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 鐵皮石斛的蒴果和種子數(shù)

表1表明，成熟的鐵皮石斛蒴果中含有近15萬(wàn)粒的種子。種子數(shù)目之多，可為組織培養(yǎng)教學(xué)提供大量的材料。自然條件下，果實(shí)成熟后果皮開(kāi)裂，種子隨風(fēng)飄落在樹干或巖石上傳種接代。但鐵皮石斛的種子需要經(jīng)過(guò)特定的真菌感染后才能萌發(fā)，因此自然萌發(fā)率極低。顯微鏡下，種子呈紡錘形且不規(guī)則，中間膨大的部分有一個(gè)呈鮮黃色的胚，其余部分為種皮，種皮的一端較細(xì)尖，另一端較寬鈍(見(jiàn)圖1-A)。只有在外源能量(人工培養(yǎng)基)合適的條件下，種子才能萌發(fā)，并發(fā)育成苗。

為此，選取蒴果中的種子作為外植體是可取的。這完全有別于其他有胚乳種子的播種發(fā)芽。

2 外植體的消毒

在蒴果內(nèi)未開(kāi)裂前，成熟的鐵皮石斛種子表面無(wú)菌。因此，外植體消毒就只要對(duì)蒴果果皮進(jìn)行消毒即可。

具體流程如下：選擇成熟未開(kāi)裂的蒴果，先用流水沖洗干凈，在超凈工作臺(tái)內(nèi)將清洗完畢的蒴果置于體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇中浸泡3 min，并振蕩，接著用無(wú)菌水沖洗2～3次后；再用75%乙醇(考慮到升汞溶液本身有毒，在中學(xué)階段學(xué)生不宜接觸且在實(shí)驗(yàn)室其廢液不好處理等原因[4])處理5 min，用無(wú)菌水沖洗5次。

3 原球莖的分化

將已消毒的蒴果置于無(wú)菌濾紙上，用解剖刀(事先高壓滅菌過(guò))切開(kāi)蒴果果皮，然后用鑷子將果殼夾住，在培養(yǎng)瓶瓶口輕輕抖動(dòng)，邊抖邊轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)瓶，使種子均勻地灑在MS培養(yǎng)基表面。為使種子均勻分布，可事先在培養(yǎng)瓶中滴加3～5滴的無(wú)菌水。一個(gè)蒴果可接種5～10瓶。培養(yǎng)條件[1]：光照強(qiáng)度1500～2000 Lx，溫度為(26±2)℃，光照時(shí)間為12 h/d。培養(yǎng)4 d的情況，如圖1-B。種子在培養(yǎng)5 d后逐漸由黃變綠，10 d后胚發(fā)育明顯(圖1-C)。隨著胚進(jìn)一步膨脹，綠色逐漸加深，其形狀近似橢球體，胚的兩端呈不對(duì)稱，一端較另一端有突起出現(xiàn)，部分種皮逐漸消失。橢球體以原球莖途徑進(jìn)行生長(zhǎng)，在原球莖頂端突起一小綠點(diǎn)，后逐漸縱向伸長(zhǎng)，形成葉原基并逐漸增大長(zhǎng)成第一片幼葉(圖1-D)。

4 生根培養(yǎng)

培養(yǎng)41 d后，將形成的原球莖轉(zhuǎn)接至含10%香蕉汁和0.1g/L活性炭的MS培養(yǎng)基進(jìn)行生根培養(yǎng)。培養(yǎng)條件與原球莖的分化一致。

原球莖的底部顏色逐漸變淺，呈現(xiàn)為乳白色漸漸分化為白色的根，繼續(xù)培養(yǎng)，最終發(fā)育成幼苗(圖1-E和圖1-F)。

圖1 鐵皮石斛種子及非共生性萌發(fā)結(jié)果

5 討論

結(jié)實(shí)率高、其蒴果內(nèi)種子數(shù)量多，這是鐵皮石斛種子作為“組織培養(yǎng)技術(shù)”專題教學(xué)供選拓展材料的前提。在實(shí)際的教學(xué)中，采用鐵皮石斛的種子作為實(shí)驗(yàn)材料具有取材方便，經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)。此外，在未開(kāi)裂的鐵皮石斛蒴果中，其種子始終處于封閉環(huán)境中，是潔凈無(wú)菌的[5]。

因此，采用鐵皮石斛種子作為“組織培養(yǎng)技術(shù)”專題教學(xué)的拓展材料，能有效避免因消毒不當(dāng)而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果不理想的結(jié)果，有利于增強(qiáng)學(xué)生對(duì)該實(shí)驗(yàn)的信心及積極性，促進(jìn)學(xué)生感性知識(shí)的獲取，從而內(nèi)化形成理性認(rèn)識(shí)。

所以，將鐵皮石斛作為南方地區(qū)中學(xué)開(kāi)展“組織培養(yǎng)技術(shù)”專題教學(xué)的拓展材料是合適的。