ERK5在急性心肌梗死患者中的磷酸化水平及對體外血小板激活的影響

高 穩 李 劍 倪喚春 謝 坤 羅心平

(復旦大學附屬華山醫院心內科 上海 200040)

ERK5在急性心肌梗死患者中的磷酸化水平及對體外血小板激活的影響

高 穩 李 劍 倪喚春 謝 坤 羅心平△

(復旦大學附屬華山醫院心內科 上海 200040)

目的 觀察急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)患者血小板中細胞外信號調節激酶5 (extracellular signal-regulated kinase 5,ERK5)的活化水平及其特異性抑制劑XMD8-92對血小板功能的影響,探索ERK5調節血小板活性的分子機制。方法 運用Western bolt法檢測AMI患者(n=34)和穩定性心絞痛患者(n=33)血小板ERK5、Akt473及Akt308的磷酸化水平;通過檢測體外血小板的聚集,測定不同濃度XMD8-92對膠原(collagen)刺激引起的血小板聚集的影響;利用熒光素酶同期檢測XMD8-92對血小板致密顆粒分泌的影響;通過檢測血小板在纖維蛋白原上的鋪展、在血漿中的收縮,評價血小板整合素ɑIIbβ3的活化水平;運用Western bolt法檢測聚集反應中XMD8-92對Akt473、Akt308及PTEN370磷酸化的影響。結果 AMI患者組ERK5及Akt473、Akt308磷酸化水平顯著升高(P<0.05);ERK5抑制劑XMD8-92可抑制膠原誘導的血小板聚集、分泌、栓塊收縮及在纖維蛋白原上的鋪展等活化指標;XMD8-92處理后血小板Akt473、Akt308及PTEN370磷酸化水平減低。結論 ERK5的激活參與了AMI過程中血小板的活化;ERK5可通過調節PTEN的活性,從而調節Akt的磷酸化水平,進而調控血小板的功能。其特異性抑制劑有望成為新的抗栓藥物。

ERK5; 血小板; 血栓; 急性心肌梗死

目前,動脈血栓性疾病成為威脅我國人民健康的首位殺手,其死亡率已超過腫瘤。其中冠心病是主要的病種,而冠心病的致死事件多為急性心肌梗死所致。已明確動脈血栓形成的關鍵步驟為：血管壁受損、動脈粥樣硬化斑塊破裂暴露血管內皮下基質,血小板立即通過其表面黏附受體 GPIb-IX-V和GPVI 黏附于內皮下膠原(collagen)組織。膠原刺激導致血小板發生一系列信號轉導事件,引起血小板產生血栓烷A2以及釋放細胞內顆粒內容物(如二磷酸腺苷 ADP等),最終導致血小板整合素 αIIbβ3激活,激活的整合素 αIIbβ3向內傳遞信號,加強血小板活化、聚集、釋放顆粒,啟動凝血過程[1]。由此可見,血小板活化是動脈血栓形成過程中重要的始動環節。深入研究血小板活化新調控方式進而發現新作用機制的藥物是目前醫學研究領域的一個重點。

絲裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)信號通路是真核細胞中廣泛存在并發揮重要調節作用的信號通路,其中細胞外信號調節激酶1/2 (extracellular signal-regulated kinases,ERK1/2)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun NH2-terminal kinases,JNK)和p38絲裂原活化的蛋白激酶(p38MAPK)在血小板中的作用均有較深入的研究[2-3]。最新研究發現血小板中也存在細胞外信號調節激酶5 (extracellular signal-regulated kinase 5,ERK5)的穩定表達[4],但其在急性血栓事件中的作用及調節機制尚需進一步研究。本實驗擬采用ERK5特異性抑制劑研究ERK5在血小板中的作用,并探討其分子機制,從而為ERK5作為新型抗栓藥物靶點提供理論依據。

材 料 和 方 法

藥品與試劑

研究對象 選擇2015年1月至2016年6月于復旦大學附屬華山醫院急診就診的患者,參考指南標準[5]納入急性ST段抬高心肌梗死患者。根據人群特征,從心內科病房中入選穩定性心絞痛患者[6]作為對照。遵循赫爾辛基宣言,在得到華山醫院倫理委員會授權后(倫理號2015-050),對所有入選患者進行告知,并簽署知情同意書。進行臨床資料的收集,行肘部靜脈取血6 mL。體外實驗用血小板來自復旦大學健康志愿者,入選前簽署知情同意書。

所用試劑 膠原、熒光素酶(luciferase),購自美國CHRONO-LOG公司;ADP/ATP雙磷酸酶(apyrase)、前列腺素E1(PGE1)、纖維蛋白原(fibrinogen),購自美國Sigma公司;磷酸化Akt473抗體、磷酸化Akt308抗體、磷酸化ERK5抗體和GAPDH抗體,購自美國Cell Signaling公司;辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔和山羊抗鼠IgG,購自美國Jackson公司;XMD8-92,購自美國Selleck公司;凝血酶(α-Thrombin),購自美國Enzyme Reseach公司。

比濁法測定人血小板的體外聚集 采用枸櫞酸鈉抗凝管采集健康志愿者血標本,加入ADP/ATP雙磷酸酶和前列腺素E1抗凝,差速離心法制得血小板沉淀,重懸于臺式緩沖液中,采用血細胞計數儀計數并調整濃度為3×108/mL。DMSO及終濃度為5、10、20 μmol/L的XMD8-92與血小板懸液共孵育3 min,使用Chrono-Log公司血小板聚集儀檢測在膠原刺激下,相應濃度XMD8-92對人血小板聚集程度的影響[7]。

熒光素酶檢測人血小板的ATP分泌 在血小板聚集反應達到平穩后,加入10 μL的熒光素酶,利用血小板聚集儀同時檢測不同濃度XMD8-92對血小板ATP的分泌的影響[8]。

Western bolt法檢測Akt473、Akt308、PTEN370、PTEN380、ERK5分子的磷酸化水平 采集心?；颊呓M和穩定性心絞痛組(對照組)血標本,差速離心法制得洗滌血小板后,直接加入等體積2×SDS裂解液。對照組血小板在聚集反應結束后,加入等體積2×SDS裂解液。在冰上充分裂解后,煮沸使蛋白變性,采用聚丙烯酰胺凝膠電泳法分離蛋白,并轉至PVDF膜上。采用一抗4 ℃過夜,漂洗后加入辣根過氧化物酶標記的IgG,室溫振蕩孵育1 h。漂洗后顯色,終止反應后拍照[9]。

血小板在纖維蛋白原上的鋪展和栓塊收縮

鋪展 在載玻片上滴加50 μg/mL纖維蛋白原溶液100 μL,4 ℃孵育過夜,PBS洗去未結合的纖維蛋白原,加2% BSA溶液室溫封閉1 h,PBS洗去未結合的BSA;分別取DMSO或不同濃度XMD8-92孵育的血小板懸液(3×107/mL)100 μL加到包被有纖維蛋白原的載玻片上,37 ℃孵育60 min,4%甲醛溶液固定后,采用鬼筆環肽對細胞骨架F-actin進行染色,熒光顯微鏡下觀察并隨機選取視野拍照,Image J軟件測量血小板面積[10]。

栓塊收縮 向含有DMSO或XMD8-92的富血小板的血漿中分別加入凝血酶至終濃度為1 U/mL,37 ℃孵育,分別在 1 h、3 h 觀察栓塊的收縮情況并拍照,Image J 軟件測量栓塊面積。收縮率計算公式為:1-栓塊面積/起始栓塊面積。

結 果

急性心肌梗死患者組及對照組ERK5、Akt473及Akt308比較 為了明確ERK5是否參與了急性心肌梗死的發病,我們首先對急性心肌梗死患者組及對照組血小板中ERK5及Akt磷酸化水平進行了分析。ERK5及Akt473及Akt308磷酸化水平在急性心肌梗死患者組較對照組顯著升高,差異有統計學意義(P<0.05,圖1)。參照JUPITER研究,以CRP作為炎癥指標,以2.0mg/L為界[11],對心肌梗死患者組進行亞組分析。CRP≥2.0mg/L組ERK5磷酸化水平略高于非炎癥組,二者差異無統計學意義(P>0.1,圖1)。該結果表明,急性心肌梗死發病過程中,血小板中ERK5活性增強,其活化程度與炎癥水平無明顯相關性。

XMD8-92對血小板聚集和ATP分泌的影響 為了探索ERK5對血小板活化的影響,我們采用ERK5的選擇性抑制劑XMD8-92[12]對血小板的聚集進行了檢測。以膠原為刺激劑時,XMD8-92可顯著抑制血小板體外聚集,且呈現濃度依賴性。各濃度XMD8-92預孵育組與對照組相比,血小板聚集程度差異均有統計學意義(P<0.05,圖2)。

采用血小板聚集儀同時檢測該抑制劑對血小板致密顆粒分泌的影響。圖2可見隨著XMD8-92濃度升高,對ATP分泌的抑制作用逐漸增強。與對照組相比,各處理組ATP分泌水平差異均有統計學意義(P<0.05,圖2)。

XMD8-92對血小板鋪展及栓塊收縮的影響 整合素αIIbβ3是血小板表面最豐富的受體,血小板內信號通路激活可導致其發生構型改變,增加與配體纖維蛋白原結合的程度;反之,纖維蛋白原與整合素ɑIIbβ3結合也可以引起信號向血小板內部傳導,形成外向內的擴大信號[13]。血小板在纖維蛋白原表面的鋪展和在血漿中的收縮都是血小板外向內信號的反映。本實驗結果顯示,XMD8-92抑制了血小板在纖維蛋白原上的鋪展,處理組與對照組比較,血小板平均鋪展面積顯著減小,差異具有統計學意義(P<0.05,圖3)。

同樣,XMD8-92對血小板在血漿中收縮也產生了顯著抑制的效果,并呈現濃度依賴性(圖3)。這些研究表明,針對ERK5為靶點抑制血小板活化,可顯著抑制血栓形成的過程。

XMD8-92對Akt473、Akt308和PTEN370磷酸化的影響Akt作為生物系統中重要的靶酶,其通過對血小板聚集和分泌的調控,而在血小板活化中扮演重要角色[14]。我們對聚集反應后的血小板蛋白Akt473、Akt308位點磷酸化進行了檢測。圖4表明,XMD8-92對Akt這兩個位點磷酸化水平均呈現濃度依賴性抑制作用。

Statistical analysis of Western blot of phosphorylated ERK5 (A),phosphorylated Akt473 (B) and phosphorylated Akt308 (C);D:Subgroups analysis of ERK5 phosphorylation levels according to the CRP levels of the AMI patients.Control group,n=33,AMI group,n=34.

圖1 急性心肌梗死組及穩定性心絞痛組ERK5、Akt473及Akt308的磷酸化表達水平

Fig 1 The phosphorylation levels of ERK5,Akt473 and Akt308 in acute myocardial infarction (AMI) and stable angina (SA) group

A:The results of platelet aggregation induced by collagen in presence of XMD8-92 or dimethyl sulfoxide (DMSO);B:Collagen induced platelet aggregation was evaluated by the maximum platelet aggregation rate (MPAR);C:Platelet secretion of ATP was recorded in the presence of luciferin-luciferase agent.D:ATP secretion was evaluated by the maximum percentage.The quantitation was performed by Studentttest (mean±SEM,n≥3,(1)P<0.01).

圖2 ERK5抑制劑對膠原誘導的人血小板聚集和分泌的影響

Fig 2 Effect of ERK5 inhibitor XMD8-92 on human platelets aggregation and ATP secretion in response to collagen

圖3ERK5抑制劑對血小板鋪展和栓塊收縮的影響

Fig3EffectofERK5inhibitorXMD8-92onplateletspreadingandclotretraction

Washed human platelets were stimulated by collagen in the presence of XMD8-92 or DMSO,then immunoblotted with antibodies against:phosphorylated Akt473,phosphorylated Akt308,phosphorylated PTEN370,phosphorylated PTEN380 or GAPDH.

圖4 XMD8-92對Akt473、Akt308、PTEN370和PTEN380磷酸化的影響

Fig 4 The phosphorylation levels of Akt473,Akt308,PTEN370 and PTEN380 affected by XMD8-92

我們進一步對PI3K/Akt信號通路中主要的調控激酶PTEN[15]磷酸化水平進行了檢測。結果顯示,XMD8-92對PTEN380位點磷酸化無顯著影響,但對PTEN370位點磷酸化水平顯著抑制,趨勢和Akt磷酸化水平一致。因此,我們認為,XMD8-92通過影響PTEN370位點的磷酸化水平,進而調節PI3K/Akt信號通路的活化水平,從而調控血小板的分泌、聚集及血栓的形成。

討 論

ERK5作為MAPK家族中的新成員,可通過磷酸化作用激活或抑制其下游靶蛋白Akt、Bad、Caspase3等,調節細胞的增殖、分化、凋亡及遷移等[16],在多種生物系統中發揮關鍵調節作用。近來有研究證明,其在人和血小板中也存在穩定表達,并利用動物模型證實其參與了急性心肌梗死的進展[4]。膠原與血小板的結合是動脈血栓形成起始的關鍵步驟。本研究顯示：ERK5選擇性抑制劑XMD8-92對膠原引起的血小板的聚集及致密顆粒釋放呈濃度依賴性抑制作用,并顯著抑制了血小板在纖維蛋白原上鋪展及栓塊收縮,證明ERK5在血小板活化中扮演重要角色。

PI3K/Akt是血小板活化中的重要信號調節通路,在血小板黏附、聚集、伸展等過程中均起關鍵調節作用。PTEN是該信號通路重要的調控激酶,而PTEN自身活性被其370及380位點的磷酸化負向調節[15]。PTEN可通過影響Akt磷酸化水平,負向調控膠原引起血小板的活化[7]。在本研究中,ERK5的抑制劑降低了PTEN 370位點的磷酸化水平,從而使PTEN活性增強,引起Akt磷酸化水平減弱,從而抑制了血小板的聚集及分泌。

研究表明,ERK5在血小板上特異性敲除,可改善冠脈結扎后小鼠心功能的惡化[4]。我們對急性心肌梗死后患者血小板ERK5的磷酸化水平進行檢測,發現較穩定性心絞痛組,AMI組磷酸化水平顯著增加,血小板活化重要指標Akt磷酸化水平也呈現類似趨勢。結合動物模型中的研究,我們認為ERK5通過調控血小板的活化參與了急性心肌梗死的發生發展。本實驗研究為將來把ERK5作為抗栓靶點提供了依據。今后尚需對其他刺激劑作用下ERK5的作用進行探索,并應進一步對其抑制劑進行在體研究。

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Phosphoryaltion levels of ERK5 in acute myocardial infarction patients and its role in platelet activationinvitro

GAO Wen, LI Jian, NI Huan-chun, XIE Kun, LUO Xin-ping△

(DepartmentofCardiology,HuashanHospital,FudanUniversity,Shanghai200040,China)

Objective To observe the phosphorylation levels of extracellular signal-regulated kinase 5 (ERK5) in acute myocardial infarction (AMI) patients and the effects of ERK5 selective inhibitor XMD8-92 on human platelet activationinvitro,and to explore its mechanism. Methods Western blot was applied to detect the phosphorylation levels of ERK5,Akt473 and Akt308 in AMI patients (n=34) and stable angina patients (n=33,control).The effects of different concentration of XMD8-92 on human platelet aggregation induced by collagen was tested by aggregometerinvitro.The release of ATP was measured simultaneously by luciferase detection.The effects of XMD8-92 on integrin ɑIIbβ3 were detected by platelet spreading on immobilized fibrinogen and clot retraction.The effects of XMD8-92 on phosphorylation levels of Akt473,Akt308 PTEN370 and ERK5 were detected by Western blot.Results The levels of phosphor-Akt473,Akt308 and phosphor-ERK5 were significantly higher in

AMI patients than that in control group (P<0.05).ERK5 inhibitor XMD8-92 diminished collagen-induced platelet aggregation,ATP secretion,the average area of platelet spreading on immobilized fibrinogen and the clot retraction extent.The levels of phosphor-Akt (Ser-473/Thr-308) and phosphor-PTEN (Ser370) were significantly down-regulated in the presence of XMD8-92. Conclusions ERK5 plays a role in platelet activation in AMI process.It regulates platelet activation by regulating PTEN and Akt phosphorylation. Its specific inhibitor is hoped to be new antithrombotic drug.

ERK5; platelet; thrombosis; acute myocardial infarction

國家自然科學基金(81270278);上海市科委科研計劃項目(16411965600)

R543.3

A

10.3969/j.issn.1672-8467.2017.04.008

2016-12-06;編輯:王蔚)

△Corresponding author E-mail:luoxp2007@aliyun.com

*This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (81270278) and the Scientific Research Project of Science and Technology Committee of Shanghai Municipality (16411965600).