玄柏爽聲顆粒HPLC指紋圖譜研究

張琇雯 胡 霜 陳念祖 馬 勤 王東蕾 賴永華 黃滔敏△

(1復旦大學附屬眼耳鼻喉科醫院藥劑科 上海 200031; 2復旦大學藥學院藥理學教研室 上海 201203)

玄柏爽聲顆粒HPLC指紋圖譜研究

張琇雯1胡 霜2陳念祖1馬 勤1王東蕾1賴永華1黃滔敏1△

(1復旦大學附屬眼耳鼻喉科醫院藥劑科 上海 200031;2復旦大學藥學院藥理學教研室 上海 201203)

目的 建立玄柏爽聲顆粒HPLC指紋圖譜,為其質量控制提供依據。方法 采用Agilent TC C18(150 mm×4.6 mm,5 μm) 色譜柱,流動相為甲醇-0.2%乙酸水,0～60 min內進行梯度洗脫;柱溫25 ℃,流速1 mL/min,檢測波長278 nm。分別對11批樣品進行測定,采用“中藥指紋圖譜計算機輔助相似度評價軟件(2004A版)”建立玄柏爽聲顆粒HPLC指紋圖譜,并對共有峰進行藥材歸屬和指認。結果 建立了玄柏爽聲顆粒HPLC指紋圖譜,確定了27個共有峰,11批樣品的相似度均在0.9以上。各共有峰均能在對應藥材中得到歸屬。用對照品指認了制劑中5個色譜峰,分別為黃柏堿(11號峰)、甘草苷(22號峰)、安格洛苷C(25號峰)、肉桂酸(26號峰)、哈巴俄苷(27號峰)。結論 該方法簡便、準確、重現性好、穩定性好,可作為玄柏爽聲顆粒的質量評價方法。

玄柏爽聲顆粒; HPLC; 指紋圖譜; 質量控制

玄柏爽聲顆粒是由復旦大學附屬眼耳鼻喉科醫院在20世紀60年代末70年代初形成的經驗方,因療效顯著而沿用至今,是國內知名的十余種醫院內部制劑之一。玄柏爽聲顆粒方由玄參、黃柏、山豆根、紫苑、蟬蛻、桔梗、甘草組成,其中,玄參為君藥,山豆根為臣藥,蜜紫菀為佐藥,具有清熱滋陰、開音利咽的作用,用于喉炎、聲帶紅腫、咽喉干燥。目前,玄柏爽聲顆粒的質量標準采用薄層鑒別的方法,該方法尚未建立反映整體信息的指紋圖譜或有效成分含量測定項目,因此有必要進一步建立專屬性更強的質控項目以控制藥品的質量。

中藥指紋圖譜具有信息量大、特征性強和整體性等特點,能表征藥物的整體信息,是符合中藥特色的評價方法,目前在中藥質量控制方面得到了廣泛認可[1-2]。其中HPLC指紋圖譜分析方法由于具有分離效能高、操作簡單、分析迅速、重現性好等特點,是目前應用最廣泛的指紋圖譜技術[3-5]。本文采用HPLC對玄柏爽聲顆粒樣品進行較為全面的指紋圖譜研究,采用“中藥指紋圖譜計算機輔助相似度評價軟件(2004A版)”進行分析,為該制劑的質量控制提供參考。

材 料 和 方 法

儀器 Agilent1100型高效液相色譜儀(美國惠普公司)包括G1322A Degasser在線脫氣、G1311A QuartPump四元泵、G1316A Column柱溫箱、G1314A VWD 紫外檢測器、惠普色譜工作站及20 μL手動進樣系統;Auto ScienceAP-01P型純凈水發生器(天津奧特賽恩斯儀器有限公司);B5500s-MTH 超聲波清洗器(上海Branson超聲波儀器廠);電子天平(北京賽多利斯儀器系統有限公司,Sartorius,d=0.1 mg)。

試劑和藥品 黃柏堿對照品(批號:140318,上海康標化學品有限公司);甘草苷對照品(批號:111610-200604,中國藥品生物制品檢定所);安格洛苷C對照品(批號:151205,上海康標化學品有限公司);哈巴俄苷對照品(批號:111730-200604,中國藥品生物制品檢定所);肉桂酸對照品(批號:110786-200503,中國藥品生物制品檢定所)。甲醇(HPLC純,美國Tedia公司);乙酸(批號:20121009,上海凌峰化學試劑有限公司);玄柏爽聲顆粒(SYZ-ZF-061-2005,復旦大學附屬眼耳鼻喉科醫院委托上海練塘藥業有限公司加工,批號:20160401、20160402、20160501、20160502、20160601、20160602、20160603、20160604、20160605、20160606、20160607,8 g/袋)。玄參(批號:1008-200003)、山豆根(批號:120976-200503)、紫菀(批號:120956-200505)、蟬蛻(由上海練塘藥業有限公司鑒定及提供,符合國家藥典標準)、桔梗(批號:121028-200608)、黃柏(批號:121510-201105)及甘草(批號:120904-201318)對照藥材均購于中國藥品生物制品檢定所。

色譜條件 Agilent TC C18(150 mm×4.6 mm,5 μm) 色譜柱;流動相為甲醇-0.2%乙酸水,梯度洗脫:0～10 min用2%～10%甲醇;10～40 min用10%～60%甲醇;40～60 min用60%～90%甲醇;柱溫25 ℃,流速1 mL/min,檢測波長278 nm,進樣量20 μL。

對照品溶液配制 精密稱取哈巴俄苷、肉桂酸、甘草苷、黃柏堿和安格洛苷C各10 mg,分別置于10 mL容量瓶中。用75%甲醇水溶解,定容至刻度,制成對照品溶液。

供試品溶液配制 精密稱取玄柏爽聲顆粒1.0 g,置于25 mL的容量瓶中,加入蒸餾水至刻度,超聲提取60 min,取適量提取液經0.45 μm微孔濾膜濾過,即得玄柏爽聲顆粒供試品溶液。

藥材供試品的制備 按玄柏爽聲顆粒制劑的處方比例,精密稱取玄參、山豆根、紫苑、蟬蛻、桔梗、黃柏及甘草對照藥材,研細,按供試品溶液配制項下方法進行處理,得各藥材供試品溶液。

結 果

提取方法的選擇 我們考察了玄柏爽聲顆粒在水及30%、50%、75%、100%乙醇中的提取效果,結果表明隨著乙醇濃度的增加,提取出的色譜峰個數逐漸減少;在100%乙醇溶劑中僅提取出2個色譜峰。部分峰在水溶劑中提取效率不是最高,如哈巴俄苷、安格洛苷C、肉桂酸等,在0～75%乙醇溶液中,這部分峰的提取效率隨著乙醇濃度的增加而增加,而在100%乙醇中,其提取效率又顯著降低,甚至不能提取。因此,綜合考慮指紋圖譜反映樣品的整體性情況,再結合顆粒劑的制作過程(該制劑是由各藥材水提成分濃縮噴霧干燥而成,溶化性檢查要求可溶顆粒全部溶化,有輕微渾濁),我們選擇提取色譜峰個數最多的水作為提取溶劑。

檢測波長的選擇 玄柏爽聲顆粒方中玄參為主藥,具有涼血滋陰、瀉火解毒的功效,化學成分主要有哈巴俄苷、巴苷元、玄參苷甲、乙等環烯醚萜類和安格洛苷C、肉蓯蓉苷D等苯丙素苷類[6-7]。其中,哈巴俄苷、安格洛苷C、肉桂酸是玄參中主要活性成分[8],哈巴俄苷具有抗炎、降壓、抗乙肝病毒等作用[9],安格洛苷C具有抑制血小板聚集、保肝等作用[9],而肉桂酸能誘導腫瘤細胞分化[10]。主藥各有效成分在278 nm均有適宜的靈敏度。處方中臣藥山豆根的主要活性成分為苦參堿、氧化苦參堿等生物堿及高麗槐素等黃酮類[11-12],它們均在短波長處有吸收,在210 nm處對制劑進行進樣分析,發現色譜基線飄移嚴重,且尚有部分信息未顯示。同時我們考查了254 nm下樣品的色譜情況,發現與278 nm相比,254 nm波長下測到的共有峰數目及主要活性成分的吸收峰面積均有所減少。再綜合考慮指紋圖譜君臣佐使的原則,選擇278 nm作為檢測波長,在該條件下色譜峰基線穩定,各吸收峰吸收強,受干擾小。

流動相的選擇 在乙腈-0.2%乙酸水溶液體系下,哈巴俄苷峰分裂,甘草苷拖尾;在甲醇-0.2%三乙胺色譜系統中,主要活性成分出峰時間較晚;在甲醇-0.2%乙酸色譜系統中,各色譜峰能較好分離,峰形良好、且出峰較多;流動相中加入10 mmol/L KH2PO4、0.5%三乙胺及磷酸調pH對峰形也無改善作用,故選擇甲醇-0.2%乙酸色譜系統作為流動相。

色譜柱的選擇 在Agilent TC色譜柱中,色譜柱的分離度高,且色譜峰數多,故選其為本實驗的分離柱。

精密度試驗 取批號為20160602的玄柏爽聲顆粒樣品,按照“供試品溶液配制”項下方法制備,按色譜條件項下方法進行測定,重復進樣6次,記錄色譜圖,考察儀器的精密度。結果表明,以26號峰肉桂酸作為參照峰,各色譜峰的相對保留時間的RSD均小于0.8%,各色譜峰的相對峰面積的RSD均小于3%,表明儀器精密度良好,符合指紋圖譜的技術要求。

重復性試驗 取批號為20160602的玄柏爽聲顆粒樣品,按照“供試品溶液配制”項下方法平行制備供試品溶液6份,按色譜條件項下方法進行測定,記錄色譜圖,考察方法的重復性。結果表明,以26號峰肉桂酸作為參照峰,各色譜峰的相對保留時間的RSD均小于1%,各色譜峰的相對峰面積的RSD均小于5%,表明該方法重復性良好,符合指紋圖譜的技術要求。

穩定性試驗 取批號為20160602的玄柏爽聲顆粒樣品,按照“供試品溶液配制”項下方法制備供試品溶液,按色譜條件項下方法,分別于0、3、6、9、12、24 h進行測定,記錄色譜圖,考察供試品溶液的穩定性。結果表明,以26號峰肉桂酸作為參照峰,各色譜峰的相對保留時間的RSD均小于1%,各色譜峰的相對峰面積的RSD均小于5%,表明供試品溶液在24 h內穩定,符合指紋圖譜的技術要求。

指紋圖譜的建立及相似度計算 分別準確吸取11批玄柏爽聲顆粒樣品的供試品溶液,采用上述色譜條件項下方法測定,記錄60 min的HPLC色譜圖。采用國家藥典委員會“中藥指紋圖譜計算機輔助相似度評價軟件(2004A版)”分析,將11批玄柏爽聲顆粒圖譜數據導入,時間窗口設為0.1,經多點校正和數據匹配,以平均數法生成指紋圖譜和對照指紋圖譜(圖1)。相似度計算結果見表1,11批玄柏爽聲顆粒的相似度良好,均在0.9以上。

共有峰的標定 選擇11批玄柏爽聲顆粒指紋圖譜中均存在的色譜峰作為共有峰,共確定共有峰27個,依次編號為1～27。通過對照品對照,分別指認5個色譜峰,其中11號峰為黃柏堿、22號峰為甘草苷、25號峰為安格洛苷C、26號峰為肉桂酸、27號峰為哈巴俄苷。選取12個主要的共有峰作為特征峰,以面積較大、分離度好且出峰穩定的26號峰肉桂酸作為參照峰(S),統計了12個主要的共有色譜特征峰的相對保留時間和相對峰面積(表2～3)。不同批次制劑的共有特征峰的相對保留時間差別較小,9號和11號共有特征峰的相對峰面積的RSD均大于20%,但由于這兩個峰占總峰面積的比例均小于10%,符合指紋圖譜的技術要求。

圖1 11批玄柏爽聲顆粒HPLC指紋圖譜及對照指紋圖譜(R)

SampleS1S2S3S4S5S6S7S8S9S10S11RS110.9810.9780.9560.9630.9460.9750.9730.9720.9640.9640.986S20.98110.970.960.9630.9420.9710.9650.9670.9630.9660.983S30.9780.9710.9430.9520.9330.9820.9820.9780.970.9640.984S40.9560.960.94310.9970.9870.960.9420.9570.9630.9480.98S50.9630.9630.9520.99710.9840.9660.9510.9630.9650.9510.984S60.9460.9420.9330.9870.98410.950.9330.9480.9510.9330.97S70.9750.9710.9820.960.9660.9510.9890.990.9840.9720.992S80.9730.9650.9820.9420.9510.9330.98910.9880.9780.9720.986S90.9720.9670.9780.9570.9630.9480.990.98810.9920.9830.992S100.9640.9630.970.9630.9650.9510.9840.9780.99210.9820.989S110.9640.9660.9640.9480.9510.9330.9720.9720.9830.98210.982R0.9860.9830.9840.980.9840.970.9920.9860.9920.9890.9821

11:Phellodendrine;22:Liquiritin;25:Angoroside C;26:Cinnamic acid;27:Harpagoside.

圖2 對照品(A)和玄柏爽聲顆粒(B)HPLC圖

表3 11批玄柏爽聲顆粒各共有特征峰的相對峰面積

玄柏爽聲顆粒與原藥材指紋圖譜相關性 在同一測定條件下,對玄柏爽聲顆粒和各原藥材的供試品溶液進行色譜測定,通過對共有峰的保留時間、峰形等因素進行考察,以確定玄柏爽聲顆粒與各原藥材指紋圖譜的相關性,找出各共有峰的來源。結果表明,玄柏爽聲顆粒的27個共有峰均可以在相應的藥材中得到指認,其中,11號峰為黃柏堿來源于黃柏、22號峰為甘草苷來源于甘草、25號峰為安格洛苷C來源于玄參、26號峰為肉桂酸來源于玄參、27號峰為哈巴俄苷來源于玄參(圖3、表4)。

A:XuanboShuangshengGranule; b:Periostracum Cicada; c:Platycodon Grandiflorum; d:Liquorice; e:Radix Asteris; f:Cortex Phellodendri; g: SophoraTonkinensis; h: Radix Scrophulariae.

圖3 玄柏爽聲顆粒指紋圖譜中各共有峰歸屬色譜圖

討 論

本實驗建立了玄柏爽聲顆粒的指紋圖譜,確定了27個共有峰,并指認了其中5個色譜峰。對11批制劑進行了相似度分析,相似度均在0.9以上,符合中藥指紋圖譜相似度評價的基本要求。通過原藥材指紋圖譜,我們對制劑中各共有峰進行了歸屬,可分析出制劑中各色譜峰的藥材來源。該方法準確、穩定,可為該制劑的質量控制提供一定的參考。

[1] 李強,杜思邈,張忠亮,等.中藥指紋圖譜技術進展及未來發展方向展望[J].中草藥,2013,44(22):3095-3104.

[2] 楊方良,張晶,孫國祥,等.中藥組方指紋圖譜研究方法和思路[J].色譜,2016,34(07):715-725.

[3] 馬麗娜,張巖,陶遵威.色譜分析技術在中藥指紋圖譜研究中的應用[J].藥物評價研究,2012,35(1):58-62.

[4] 王晴,王英姿,李友林,等.紅鶴方制劑HPLC指紋圖譜研究[J].北京中醫藥大學學報,2016,39(01):40-45.

[5] 孫國祥,閆波,侯志飛,等.中藥色譜指紋圖譜評價方法研究進展[J].中南藥學,2015,13(7):673-681.

[6] 薛剛強,杜婧,潘新艷,等.玄參化學成分研究[J].中藥材,2014,37(9):1597-1599.

[7] 謝小艷,夏春森．中藥玄參的化學成分及藥理研究進展[J].亞太傳統醫藥,2010,6( 5) :121-125.

[8] 劉承偉,畢志明,祝艷斐,等.玄參中4種主要活性成分的HPLC定量分析[J].中國藥學雜志,2007,42(21):1614-1616.

[9] 王建華,謝麗華,劉洪宇,等.玄參不同加工品中哈巴俄苷與肉桂酸的HPLC含量測定[J].中國藥學雜志,2000,35(06):375-378.

[10] LIU L,HUDGINSWR,SHACK S,etal.Cinnamic acid- a natural product with potential use in cancer intervention[J].IntJCancer,1995,62(3):345-350.

[11] 黃穎,王乃平,陳勇.廣西產山豆根HPLC指紋圖譜測定[J].中國實驗方劑學雜志,2011,17(14):66-68.

[12] 黃韻詩.高效液相色譜法測定山豆根中高麗槐素的含量[J].中南藥學,2008,6 (2):193-195.

HPLC fingerprint ofXuanboShuangshengGranule

ZHANG Xiu-wen1, HU Shuang2, CHEN Nian-zu1, MA Qin1,WANG Dong-lei1, LAI Yong-hua1, HUANG Tao-min1△

(1DepartmentofPharmacy,EyeandENTHospital,FudanUniversity,Shanghai200031,China;2DepartmentofPharmacology,SchoolofPharmacy,FudanUniversity,Shanghai201203,China)

Objective To establish the HPLC fingerprint ofXuanboShuangshengGranule for its quality control. Methods The components were separated on an Agilent TC-C18column (150 mm×4.6 mm,5 μm) at 25 ℃,with a gradient elution in 0-60 min at the flow rate of 1 mL/min using 0.2% acetic acid aqueous solution and methanol as the mobile phase.The detection wavelength was 278 nm.By detecting 11 batches ofXuanboShuangshengGranule,the HPLC fingerprint was established using “Similarity Evaluation System for Chromatographic Fingerprint of TCMs (Version 2004A)”and the common peaks were analyzed and identified in raw herbal material. Results The HPLC fingerprint ofXuanboShuangshengGranule was obtained with similarity all over 0.9.Totally 27 common peaks were confirmed,and each common peak could be found in raw herbal medicines.Based on the reference substances,5 common peaks were identified,including phellodendrine (peak 11),liquiritin (peak 22),angoroside C (peak 25),cinnamic acid (peak 26) and harpagoside (peak 27). Conclusions This method is simple,accurate,repeatable and reliable,which could be applied in the quality control ofXuanboShuangshengGranule.

XuanboShuangshengGranule; HPLC; fingerprint; quality control

R917

A

10.3969/j.issn.1672-8467.2017.04.023

2016-11-08;編輯:王蔚)

△Corresponding author E-mail:taominhuang@139.com