烏司他丁通過誘導miR-155抑制體外循環心臟手術患者炎癥反應的作用機制研究

徐黎青，韋江啟（新鄉市第一人民醫院心胸外科，河南新鄉 453000）

烏司他丁通過誘導miR-155抑制體外循環心臟手術患者炎癥反應的作用機制研究

徐黎青＊，韋江啟（新鄉市第一人民醫院心胸外科，河南新鄉 453000）

目的：研究烏司他丁在體外循環（CPB）心臟手術中對患者炎癥因子抑制作用的機制。方法：選取2012年7月－2016年7月于我院擇期行CPB心臟手術的40例患者為研究對象，按照隨機數字表法分為對照組和觀察組，各20例。觀察組患者于麻醉誘導后即給予30萬U烏司他丁靜脈泵注，以2.5 mL/min的速率在20 min內完成，再將70萬U烏司他丁以0.2 mL/min的速率使用微量泵持續靜脈泵注至術畢；對照組患者給予等容量生理鹽水。分別于麻醉誘導前（術前）和CPB停止（術后）6、12、24 h采集患者血液標本，以實時定量逆轉錄聚合酶鏈反應和蛋白質免疫印跡法檢測外周血單核細胞中微小核糖核酸155（miR-155）及其靶基因髓樣分化因子88（MyD88）的表達情況；以酶聯免疫吸附測定法檢測血清腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素6（IL-6）和IL-8的表達情況；采用Pearson相關系數分析觀察組患者術后24 h的miR-155與TNF-α、IL-6、IL-8表達的相關性。結果：與對照組比較，觀察組患者的miR-155表達水平顯著升高，其靶基因MyD88的表達水平顯著降低，炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-8的表達水平顯著降低，差異均有統計學意義（P＜0.01）。觀察組患者術后24 h的miR-155與TNF-α、IL-6、IL-8的表達水平呈顯著負相關（P＜0.01）。結論：烏司他丁可通過誘導miR-155的表達來抑制炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-8的釋放，這可能是該藥在CPB心臟手術中發揮抗炎作用的新機制。

烏司他丁；體外循環；心臟手術；微小核糖核酸155；炎癥反應

體外循環（Cardiopulmonary bypass，CPB）心臟手術是近年來開展較多的一類手術方式，CPB現已成為心內直視術的輔助手段。但是，手術期間由于血液與人工管道的接觸、各臟器的低灌注及手術器械對機體的機械性損傷，加之器官缺血再灌注、疼痛等多因素的強烈刺激，從而激活體內的中性粒細胞、單核-巨噬細胞、內皮細胞等釋放大量的炎癥因子，進而激活體內免疫系統誘發級聯炎癥反應，導致全身炎癥反應及多器官功能障礙綜合征，甚至引起患者死亡[1-2]。因此，對此類手術患者在圍術期的防控干預對其臟器的功能狀態有著較大的影響，直接關系到手術的效果和預后。目前，臨床常用一些蛋白酶抑制劑改善CPB引起的炎癥反應，其中烏司他丁（Ulinastain）作為一種廣譜蛋白水解酶抑制劑，對體內多種蛋白水解酶的活性發揮了廣泛的抑制作用。其可清除氧自由基，減少炎癥介質釋放和炎癥細胞浸潤[3-4]，從而減輕CPB心臟手術后患者的炎癥反應，對CPB造成的心肌損傷發揮重要的保護作用，但目前關于其對心肌損傷的保護機制尚需要進一步研究。近年來的研究發現，心肌中的微小核糖核酸（miRNA）在心肌損傷的保護功能中起到重要的調控作用[5-7]，這為臨床上進行心肌保護治療提供了新的靶點。那么烏司他丁減輕CPB心臟手術后患者的炎癥反應、對心肌的保護作用是否與調節miRNA相關？研究發現，miR-155是一個重要的心肌功能調控miRNA，可通過抑制Toll樣受體（TLRs）信號通路中重要的轉導蛋白髓樣分化因子88（MyD88）進而抑制核轉錄因子kappa B（NF-κB）信號通路的激活，減少炎癥因子[腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素6（IL-6）和IL-8]的分泌[8]。因此，本研究中，筆者考察了烏司他丁對CPB心臟手術患者miR-155、TNF-α、IL-6和IL-8表達的影響，探討了烏司他丁通過誘導miR-155進而抑制CPB心臟手術患者炎癥反應、發揮心肌保護作用的機制。

1 資料與方法

1.1 納入與排除標準

納入標準：（1）擬擇期行全身麻醉下CPB心臟手術的患者；（2）美國紐約心臟病協會（NYHA）分級1～3級；（3）年齡＜65歲。

排除標準：（1）伴有嚴重呼吸、循環系統基礎疾病者；（2）肝腎功能和凝血功能異常者；（3）心率＜60次/min或心律失常者；（4）血氣分析和（或）電解質異常、血紅蛋白＜110 g/L者。

1.2 研究對象

選取2012年7月－2016年7月于我院進行CPB心臟手術的40例患者，按照隨機數字表法分為對照組和觀察組，各20例。兩組患者的性別、年齡、體質量、手術類型、手術時間、CPB時間等一般資料比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），具有可比性，詳見表1。本研究方案經醫院醫學倫理委員會審核通過，所有患者或其家屬術前均閱讀并簽署知情同意書。

表1 兩組患者一般資料比較（n＝20）Tab 1 Comparison of general information of patients between 2 groups（n＝20）

1.3 治療方法

兩組患者術前均常規禁食禁飲且均未用藥。采用氣管插管靜吸復合麻醉常規CPB的方法進行手術；麻醉誘導均采用咪達唑侖4 mg+芬太尼15μg/kg+順苯磺酸阿曲庫銨0.15 mg/kg+依托咪酯0.2 mg/kg；麻醉維持采用七氟醚最小肺泡濃度（MAC）的0.8～1.5倍量。術中連續監測患者的平均動脈壓、中心靜脈壓、心電圖、尿量，并進行血氣分析。觀察組患者在麻醉誘導后即給予注射用烏司他丁（廣東天普生化醫藥股份有限公司，批準文號：國藥準字H19990134，批號：031604143，規格：10萬U）30萬U溶入50 mL生理鹽水中靜脈泵注，以2.5 mL/min的速率在20 min內完成，再將70萬U（溶入50 mL生理鹽水中）烏司他丁以0.2 mL/min的速率使用微量泵持續靜脈泵注至術畢。對照組患者給予等容量生理鹽水。兩組其他預充液及CPB方法相同。

1.4 觀察指標

（1）比較兩組患者麻醉誘導前（術前）和CPB停止（術后）6、12、24 h外周血單核細胞中miR-155及其靶基因MyD88的表達情況。（2）比較兩組患者術前及術后6、12、 24 h血清炎癥因子（TNF-α、IL-6和IL-8）的表達結果。（3）分析觀察組患者術后24 h的miR-155與炎癥因子表達情況的相關性。（4）觀察兩組患者不良反應發生情況。

1.5 檢測方法

（1）兩組患者分別于術前和術后6、12、24 h由中心靜脈導管采集血液標本，按照Ficoll-Paque PREMIUM細胞分離液（瑞典GE公司）說明書分離外周血單核細胞；依據Trizol試劑（美國Invitrogen公司）說明書提取細胞總RNA，采用miRNA實時定量逆轉錄聚合酶鏈反應（qRT-PCR）試劑盒（美國GeneCopeia公司）檢測外周血單核細胞中miR-155的表達情況。miR-155上游引物：5′-CTCCTACATATTAGCATTAACA-3′；下游引物：由試劑盒提供；以snRNA U6為內參，內參上游引物：5′-CGCTTCGGCAGCACATATACTAA-3′；下游引物：5′-TATGGAACGCTTCACGAATTTGC-3′。以循環閾值（Ct值）為統計參數，采用2－ΔΔCt計算方法，用相對定量法（目的基因Ct值/snRNA U6內參基因Ct值）對miR-155的表達進行相對定量。（2）采用蛋白質免疫印跡（Western blot）法檢測外周血單核細胞中miR-155靶基因MyD88的表達情況：外周血單核細胞經RIPA裂解液（上海碧云天生物公司）裂解，離心，取上清，采用BCA試劑盒（上海碧云天生物公司）測定蛋白濃度。取等量蛋白通過十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）后，以半干法轉至聚偏氟乙烯（PVDF）膜，于5%脫脂奶粉中室溫封閉2 h；將膜分別置于兔抗MyD88多克隆抗體（美國CST公司）、兔抗β-actin多克隆抗體（美國CST公司）一抗稀釋液（稀釋比例均為1∶1 000，V/V）中，4℃孵育過夜，用含吐溫20的磷酸鹽緩沖液（PBST）洗膜3次，每次10 min；再將膜置于辣根過氧化物酶（HRP）標記山羊抗小鼠免疫球蛋白（Ig）G（北京中杉公司）二抗稀釋液（稀釋比例均為1∶10 000，V/V）中室溫孵育2 h，PBST洗膜3次，每次10 min。將增強型化學發光（ECL）底物（美國Millpore公司）滴加至PVDF膜上，于化學發光檢測儀收集熒光信號，用Gel-Pro Analyzer分析軟件分析蛋白的灰度值，與內參蛋白β-actin的灰度值進行相對定量（目的蛋白灰度值/內參蛋白灰度值）。（3）應用酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（美國R&D Systems公司）測定患者血清中炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-8的表達情況。

1.6 統計學方法

采用SPSS 16.0軟件對數據進行統計分析。計量資料以±s表示，采用t檢驗；計數資料以例數表示，采用χ2檢驗；應用Pearson相關系數分析miR-155與TNF-α、IL-6、IL-8表達的相關性。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者手術前后外周血單核細胞中miR-155及其靶基因MyD88的表達情況

術前，兩組患者外周血單核細胞中miR-155的表達水平比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。與術前比較，對照組患者術后6、12、24 h外周血單核細胞中miR-155的表達水平均顯著降低，觀察組患者的表達水平均顯著升高；且觀察組患者術后各時點miR-155的表達水平均顯著高于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05或 P＜0.01），詳見表2。

表2 兩組患者手術前后外周血單核細胞中miR-155的表達結果（±s，n＝20）Tab 2 Expression of miR-155 in peripheral blood mononuclear cells in 2 groups before and after surgery（±s，n＝20）

表2 兩組患者手術前后外周血單核細胞中miR-155的表達結果（±s，n＝20）Tab 2 Expression of miR-155 in peripheral blood mononuclear cells in 2 groups before and after surgery（±s，n＝20）

注：與術前比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與對照組比較，#P＜0.01Note：vs.before operation，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.control group，#P＜0.01

術后24 h 0.317±0.035＊＊6.573±0.334＊＊#組別對照組觀察組術前1.123±0.105 1.037±0.103術后6 h 0.820±0.030＊1.560±0.105＊＊#術后12 h 0.543±0.080＊＊3.340±0.248＊＊#

術前及術后6 h，兩組患者外周血單核細胞中MyD88的表達水平比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。與術前比較，兩組患者術后12、24 h外周血單核細胞中MyD88的表達水平均顯著升高，但觀察組患者顯著低于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01），詳見表3。

表3 兩組患者手術前后外周血單核細胞中MyD88的表達結果（±s，n＝20）Tab 3 Expression of MyD88 in peripheral blood mononuclear cells in 2 groups before and after surgery（±s，n＝20）

表3 兩組患者手術前后外周血單核細胞中MyD88的表達結果（±s，n＝20）Tab 3 Expression of MyD88 in peripheral blood mononuclear cells in 2 groups before and after surgery（±s，n＝20）

注：與術前比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與對照組比較，#P＜0.01Note：vs.before operation，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.control group，#P＜0.01

術后24 h 4.323±0.485＊＊2.125±0.283＊＊#組別對照組觀察組術前0.512±0.078 0.525±0.068術后6 h 0.699±0.081 0.598±0.072術后12 h 2.321±0.312＊＊1.413±0.202＊#

2.2 兩組患者手術前后血清炎癥因子的表達情況

術前，兩組患者各血清炎癥因子表達水平比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。與術前比較，兩組患者術后6、12、24 h的TNF-α、IL-6和IL-8水平均顯著升高，但觀察組顯著低于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01），詳見表4。

表4 兩組患者手術前后血清TNF-α、IL-6和IL-8的表達結果（±s，n＝20，pg/mL）Tab 4 The expression of serum TNF-α，IL-6 and IL-8 in 2 groups before and after surgery（±s，n＝20，pg/mL）

表4 兩組患者手術前后血清TNF-α、IL-6和IL-8的表達結果（±s，n＝20，pg/mL）Tab 4 The expression of serum TNF-α，IL-6 and IL-8 in 2 groups before and after surgery（±s，n＝20，pg/mL）

注：與術前比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與對照組比較，#P＜0.01Note：vs.before operation，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.control group，#P＜0.01

組別對照組觀察組TNF-α IL-6 IL-8術后24 h 25.82±9.56＊＊13.73±6.15＊#術前30.23±10.78 28.56±6.35術后6 h 178.28±38.33＊＊112.58±34.62＊＊#術后12 h 135.46±25.63＊＊75.33±28.59＊＊#術后24 h 88.56±25.48＊＊65.49±22.60＊＊#術前13.51±4.54 15.34±5.12術后6 h 125.35±28.11＊＊62.15±16.46＊＊#術后12 h 98.45±18.37＊＊43.21±11.78＊＊#術后24 h 67.21±18.05＊＊34.78±11.05＊#術前10.12±3.85 9.12±2.57術后6 h 55.33±9.67＊＊28.17±5.47＊＊#術后12 h 42.72±10.16＊＊18.62±4.49＊＊#

2.3 烏司他丁誘導表達miR-155與炎癥因子表達的相關性

采用Pearson相關系數分析觀察組患者術后24 h的miR-155與炎癥因子表達的相關性，發現經烏司他丁誘導表達的miR-155水平與TNF-α（r＝－0.760，P＜0.01）、IL-6（r＝－0.726，P＜0.01）、IL-8（r＝－0.767，P＜0.01）的表達水平均呈顯著負相關。相關性分析結果見圖1。

3 討論

CPB過程中有大量炎癥因子產生，形成復雜的炎癥因子網絡和級聯炎癥反應[9]。其中，TNF-α是主要由單核-巨噬細胞產生的早期炎癥細胞因子，是CPB圍術期炎癥反應中最主要的內源性炎癥介質，在級聯炎癥反應中起核心作用[10]。TNF-α可刺激多種炎癥細胞產生IL-6，而IL-6是具有代表性的炎癥因子，其表達水平變化可作為早期機體損傷的參考指標，與多種心血管疾病的病理生理過程密切相關，也是后續嚴重臨床并發癥的預測因子[11]。TNF-α還可誘導單核-巨噬細胞產生IL-8，使中性粒細胞釋放活性氧自由基、蛋白水解酶及其他細胞因子，共同引起組織器官損傷[12]。因此，如何降低CPB過程中對機體的損傷成為臨床干預及治療的研究熱點。

圖1 觀察組患者術后24 h的miR-155與TNF-α、IL-6、IL-8表達的相關性分析結果Fig 1 Correlation of the expression of miR-155 with the expression of TNF-α，IL-6 and IL-8 in observation group 24 h after surgery

烏司他丁是從男性新鮮尿液中分離純化而來的一種酸性糖蛋白，是一種廣譜的酶抑制劑，對多種蛋白酶、水解酶具有顯著抑制作用，可抑制中性粒細胞過度激活、清除氧自由基、抑制炎癥介質釋放、降低炎癥損傷程度[13]。目前臨床上常將烏司他丁用于CPB過程中改善器官缺血再灌注損傷和保護心肌，但關于其作用機制尚缺乏相關報道。

miRNA在生物體各個組織器官的生長發育和某些疾病的發病過程中發揮著極其重要的調節作用。目前已經發現眾多的miRNA參與了機體多種病理生理的發展過程。其中，miR-155是一個重要的抗炎miRNA，在造血細胞分化、免疫、炎癥以及心血管功能方面發揮重要作用[14-16]。本研究發現，心臟手術患者在CPB過程中應用烏司他丁可顯著誘導外周血單核細胞中miR-155的表達，并抑制miR-155靶基因MyD88的表達，從而抑制MyD88介導的NF-κB炎癥信號通路的活化，減弱炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-8的表達；進一步的研究發現，經烏司他丁誘導表達的miR-155水平與TNF-α、IL-6、IL-8的表達水平呈顯著負相關。這提示烏司他丁抑制炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-8的表達與誘導抗炎分子miR-155的表達相關。

綜上所述，烏司他丁可通過誘導miR-155的表達來抑制炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-8的釋放，這可能是該藥在CPB心臟手術中發揮抗炎作用的新機制。但本研究并未檢測烏司他丁對其他炎癥相關的miRNA的表達以及其他炎癥信號通路的作用效應，鑒于miRNA對基因的表達調控是一個復雜的網絡調控系統，且炎癥信號通路是相互關聯的，故今后的研究可進一步探討烏司他丁對多種miRNA及炎癥信號通路串聯的調控機制，從而為更加深入地闡明該藥對機體多器官的保護作用機制以及指導臨床合理用藥提供依據。

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（編輯：胡曉霖）

Study on the Mechanism of Ulinastain Inhibiting Inflammatory Reaction of Patients Underwent Cardiopulmonary Bypass Cardiac Surgery by Inducing miR-155

XU Liqing，WEI Jiangqi（Dept.of Cardiothoracic Surgery，Xinxiang First People’s Hospital，Henan Xinxiang 453000，China）

OBJECTIVE：To study the mechianism of inhibitory effect of ulinastain on inflammatory factors of patients during cardiopulmonary bypass（CPB）cardiac surgery.METHODS：Totally 40 patients underwent selective CPB cardiac surgery collected from our hospital during Jul.2012-Jul.2016 were divided into control group and observation group according to random number table，with 20 cases in each group.Observation group was given 300 000 U of ulinastatin at 2.5 mL/min by intravenous pump within 20 min after anesthesia induction，then given 700 000 U of ulinastatin at 0.2 mL/min by continuous intravenous pump until operation finish.Control group was given equal volume of normal saline.Blood samples of patients were collected before anesthesia induction（before surgery）and 6，12，24 h after CPB（after surgery），respectively.The expression of miR-155 and its target gene MyD88 in peripheral blood mononuclear cells of each group were detected by Real-time PCR and Western blot.The expression of TNF-α，IL-6 and IL-8 were measured by ELISA.The correlation of miR-155 with the expression of TNF-α，IL-6 and IL-8 in patients of observation group 24 h after surgery were analyzed by using Pearson correlation analysis.RESULTS：Compared with control group，the expression of miR-155 in observation group was significantly increased，while the expression of its target gene MyD88 was significantly decreased；the expression of TNF-α，IL-6 and IL-8 were reduced significantly，with statistical significance（P＜0.01）.The expression of miR-155 was significantly negative correlation with the expression of TNF-α，IL-6 and IL-8 in the patients of observation group 24 h after surgery（P＜0.01）.CONCLUSIONS：Ulinastatin can inhibit the release of inflammatory factors TNF-α，IL-6 and IL-8 by inducing the expression of miR-155，which may be a new mechanism for the anti-inflammatory effect of the drug in CPB cardiac surgery.

Ulinastain；Cardiopulmonary bypass；Cardiac surgery；miR-155；Inflammatory reaction

R614

A

1001-0408（2017）20-2742-04

2017-02-08

2017-04-22）

＊副主任醫師。研究方向：心肌缺血再灌注損傷。電話：0373-3665261。E-mail：xliqing6997@163.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.20.02