DNA疫苗浸泡免疫預防鱖魚傳染性脾腎壞死病毒

周偉東+周勇+劉奕+張立強+鄧平+艾桃山+曾令兵+喻運珍+喻婷

摘要：以ISKNV MCP基因為目的基因，克隆到真核表達質粒pcDNA3.1（+）中，構建成DNA疫苗pcMCP，對鱖魚（Siniperca chuatsi）pcMCP DNA疫苗進行浸泡免疫效果研究。結果表明，pcMCP DNA疫苗能夠刺激免疫系統，對非特異性免疫和IgM的表達都具有激活作用。免疫后血液中白細胞含量、白細胞吞噬能力和SOD活力都顯著提高，14 d時均達到最大。IgM和Mx基因的mRNA表達研究顯示，72 h大量表達，96 h達到最大，分別是對照組的3.05倍和2.02倍。攻毒試驗顯示，浸泡免疫能夠有效保護ISKNV感染的鱖魚，在第11天，浸泡免疫組的累計死亡率僅為40%，而對照組死亡率都達到了100%，pcMCP浸泡免疫降低了ISKNV感染的鱖魚死亡率。

關鍵詞：鱖魚（Siniperca chuatsi）；DNA疫苗；浸泡免疫；傳染性脾腎壞死病毒

中圖分類號：S942.5 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）14-2731-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.14.034

Abstract：In this study， ISKNV MCP gene was cloned into eukaryotic expression plasmid pcDNA3.1（+） to construct DNA vaccine，pcMCP，to study the immune effect of DNA vaccine. The results showed that immersion immunity by pcMCP DNA vaccine could stimulate the immune system. After immunization，White blood cell content，leukocyte phagocytosis and SOD were significantly improved，and they reached the maximum at 14th day. The mRNA level of IgM and Mx gene was expressed at 72 h，and reached the maximum at 96 h， and they were upto 3.05 fold and 2.02 fold respectively，compared with control group. Challenge test， immersion immunization could effectively protect the ISKNV infected mandarin fish. at the eleventh day，the total death rate of immersion immunization groupwas only 40%， the control groups were mortality rate reached 100%. So these results showed that immersion immunity of DNA vaccine reduced death of ISKNV infected Mandarin fish.

Key words：mandarin fish（Siniperca chuatsi）； DNA vaccine； immersion immunization； infectious spleen and kidney necrosis virus

病毒性疾病對水產養殖業造成的損失呈上升趨勢，且大多缺乏針對性的治療藥物和手段，疫苗防控作為疾病控制方法越來越受到水產養殖業的重視[1，2]。目前，大量使用的注射免疫方式使得水產疫苗在水產養殖業的應用和推廣受到了很大的限制。因此，開發使用簡單、成本低廉的DNA疫苗和免疫方式對水產養殖業尤為重要。研究表明，基于黏膜系統的疫苗能夠提高病原體感染后試驗動物的生存能力[3，4]。DNA疫苗不僅能夠通過黏膜系統使魚體產生足夠的免疫保護力，同時還能夠刺激機體非特異性免疫產生額外的免疫保護力[5-8]。

鱖魚病毒病對中國的鱖魚養殖業造成很大危害，其主要病原是傳染性脾腎壞死病毒（Infectious spleen and kidney necrosis virus，ISKNV）。目前，鱖魚病毒病還沒有特效藥物，仍以預防為主，通過水質調節，免疫增強為主，疫苗防治為鱖魚養殖業急需。由于鱖魚是肉食性魚類，性格暴躁，只吃活魚，口服或注射的免疫方式很難在鱖魚養殖中使用，疫苗浸泡免疫是鱖魚免疫的惟一選擇。Fernandez-Alonso等[9]在鱒魚上利用DNA疫苗浸泡免疫預防出血性敗血癥病毒的研究中，浸泡組在第35天的死亡率比對照組降低了36%。ISKNV主要衣殼蛋白（Major capside protein，MCP）是病毒粒子的主要抗原蛋白，本研究克隆了ISKNV MCP基因，構建了重組MCP基因的DNA疫苗（pcMCP），并對鱖魚苗進行浸泡免疫，免疫后血液中白細胞含量、白細胞吞噬能力和超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）都顯著提高，IgM和Mx基因的mRNA在72 h大量表達，pcMCP浸泡免疫降低了ISKNV感染的鱖魚死亡率。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

鱖魚購自武漢佳恒水產鱖魚繁殖廠，體重40～50 g，試驗水池內暫養，水溫25 ℃，連續通氣。

1.2 DNA疫苗的構建

以ISKNV核酸為模板，利用表1中的引物P1和P2擴增MCP基因全長序列，表中下劃線表示限制性內切酶Kpn I和 EcoR I的酶切位點。將PCR產物MCP基因克隆到真核表達質粒pcDNA3.1（+）中，構建DNA疫苗真核表達質粒pcMCP。

1.3 MCP基因在鯉魚上皮瘤細胞中的表達

將鯉魚上皮瘤細胞（Epithelioma papulosum cyprini，EPC）接種在6孔板中，用含10%牛血清的M199培養基培養至細胞長成單層后，通過脂質體Lipofectamine 2000，將重組質粒pcMCP轉染到EPC細胞中。在轉染后72 h將細胞用4%多聚甲醛于4 ℃固定，以兔抗MCP多克隆抗體為一抗，紅色熒光探針標記的羊抗兔IgG（H+L）抗體為二抗，DAPE為細胞核染色劑，參照免疫熒光染色試劑盒（Beyotime，免疫熒光染色試劑盒—抗兔Cy3）對轉染重組質粒的EPC細胞進行檢測。同時用轉染空質粒pcDNA3.1（+）的EPC細胞作為對照進行相同操作。

1.4 血細胞計數和白細胞吞噬活性

取樣采血后，立即用事先配制的Dacie液稀釋血液，血球計數板計血細胞數[紅細胞（Blood cell，RBC）與白細胞（White blood cell，WBC）]，重復計數3次。將金黃色葡萄球菌菌液（Staphylococcus aureus）加入終濃度為0.3%的福爾馬林溶液，恒溫水浴鍋28 ℃滅活48 h，即濃度為1×108 CFU/mL的金黃色葡萄球菌，作為吞噬原，置于4 ℃冰箱備用。0.2 mL抗凝血中加入0.05 mL經福爾馬林滅活的金黃色葡萄球菌，充分混勻后置25 ℃恒溫水浴鍋中孵育60 min，每10 min搖勻1次，1 000 r/min離心10 min，吸取白細胞層制涂片3張。Wright-Giemsa染液混合染色，油鏡下觀察。吞噬活性以吞噬百分比（Phagocytic percentage，PP），計算公式為：PP=N100/100×100%；N100指100個吞噬細胞中參與吞噬的細胞數。

1.5 SOD活力測定

使用超氧化物歧化酶試劑盒（購于南京建城生物工程研究所）進行測定，采用黃嘌呤氧化酶法測定SOD活力。

1.6 RT-PCR檢測樣品中IgM和Mx基因表達量

利用熒光定量PCR分析免疫鱖魚魚體免疫相關基因（Mx、IgM）的表達差異。分別在浸泡免疫后12、24、48、72、96 h采樣，每組隨機取3尾魚，解剖取其脾臟組織，用Trizol（Invitrogen）提取樣品中的總RNA，經DNase Ⅰ消化后，反轉錄獲得cDNA第一鏈。按照Realtime PCR Master Mix（SYBR Green）試劑盒中的操作說明，在AB Plus one熒光定量PCR儀上對所取的試驗樣品進行RT-PCR。

1.7 免疫保護試驗

將健康鱖魚（40～50 g）隨機分為2組，每組30尾，即對照組和免疫組。免疫組浸泡于濃度為100 ng/mL pcMCP質粒的免疫浸泡液中30 min，對照組浸泡于PBS溶液中，浸泡免疫后25 ℃恒溫養殖，投喂鯪魚。免疫后第28天進行攻毒試驗，各組每尾魚通過腹腔注射10×TCID50 ISKNV，連續觀察15 d，記錄感染發病和死亡情況，計算相對免疫保護率（Relative percent survival，RPS）。RPS=[1-（免疫組死亡率/對照組死亡率）]×100%

2 結果與分析

2.1 pcMCP的重組質粒構建及真核表達

以鱖傳染性脾腎壞死病毒主衣殼蛋白MCP基因為目的基因，利用MCP特異性引物PCR擴展MCP基因，插入到真核表達質粒pcDNA3.1（+）中，構建成DNA疫苗pcMCP。PCR鑒定結果顯示，大小約為1 300 bp的ISKNV MCP基因成功克隆到真核表達質粒pcDNA3.1（+）上（圖1A）。

脂質體Lipofectamine 2000介導真核重組質粒pcMCP轉染EPC細胞，轉染后72 h間接熒光免疫試驗結果顯示，轉染重組質粒的EPC細胞胞質中可觀察到紅色熒光見圖1B。同時用pcDNA3.1（+）空質粒轉染EPC細胞作為對照進行間接熒光免疫試驗，未發現任何熒光。這表明成功構建的重組質粒pcMCP能夠在EPC細胞中表達。

2.2 鱖魚血液中白細胞數目和吞噬活性分析

經DNA疫苗浸泡免疫后，免疫組鱖魚白細胞變化趨勢計數結果如圖2A所示。DNA浸泡免疫后，鱖魚外周血白細胞數目都有不同程度的增加，其中14 d和21 d浸泡組白細胞顯著高于對照組（P<0.05）。白細胞吞噬試驗結果（圖2B）顯示，在7～21 d浸泡免疫組中白細胞吞噬滅活的金黃色葡萄球菌的吞噬百分比顯著高于對照組（P<0.05），第28天的浸泡免疫組的吞噬百分比高于對照組，但差異不顯著。同時還發現，鱖魚白細胞中的中性粒細胞和單核細胞存在吞噬多個滅活的金黃色葡萄球菌的現象。

2.3 對血清超氧化物歧化酶活性的影響

SOD活力檢測結果如圖3所示，免疫后鱖魚血清中SOD活力與對照相比有所提高，其中7 d和14 d浸泡免疫組SOD活力顯著高于對照組（P<0.05），21 d和28 d浸泡免疫組SOD酶活比對照組有所提高，但差異不顯著。

2.4 浸泡免疫對IgM和Mx基因表達的影響

實時定量PCR檢測DNA疫苗浸泡免疫對鱖魚脾臟中IgM mRNA表達變化如圖4，在浸泡免疫后48 h內，IgM mRNA表達量與對照組幾乎沒有變化，72 h后IgM mRNA表達量逐步升高，72 h IgM mRNA表達量是PBS組的2.04倍，96 h達到3.05倍。DNA疫苗浸泡免疫能夠有效激活鱖魚體液免疫。

RT-PCR檢測DNA疫苗浸泡免疫對鱖魚脾臟中Mx mRNA表達變化如圖5，浸泡免疫后12 h和24 h，脾臟中Mx mRNA的表達量略低于PBS組， 72 h和96 h的Mx mRNA表達量分別是PBS組的1.45倍和2.02倍。隨時間的增加，浸泡免疫組Mx基因表達量逐步增加。

2.5 ISKNV DNA疫苗浸泡免疫的保護效果

用10×TCID50 ISKNV攻毒后，免疫組與對照組在11 d內均出現了不同程度的死亡，死亡時間集中在攻毒的第5天后，如圖6所示。DNA疫苗浸泡免疫鱖魚后產生了較高的免疫力，PCR檢測死亡鱖魚為ISKNV陽性，同時觀察其發病癥狀，與自然環境下感染ISKNV發病癥狀相同，表明其死亡原因是由于人工感染ISKNV所致。免疫后第11天，ISKNV DNA疫苗浸泡免疫組累計死亡率40%，空質粒pcDNA3.1（+）和PBS對照組累計死亡率為100%。

3 討論

魚類的嗜中性白細胞和單核細胞已被證實有很強的吞噬能力，白細胞的吞噬作用是魚類非特異免疫的重要組成部分[10]。通過對鱖魚進行DNA疫苗浸泡免疫，鱖魚白細胞數和白細胞吞噬百分比與對照組相比都有所增加，而且白細胞中大量存在一個白細胞吞噬多個金黃色葡萄球菌的現象。pcMCPE DNA疫苗浸泡免疫后，鱖魚吞噬細胞的吞噬活性被提高。除此之外，魚類的紅細胞也有一定的吞噬活性，本研究在鏡檢中也觀察到了許多紅細胞的吞噬現象，由此可見鱖魚的紅細胞在免疫反應中也發揮了一定的免疫調節作用。

SOD常作為動物體極為重要的一類非特性免疫因子，在各種需氧生物體內廣泛存在，它可以抑制和清除超氧陰離子自由基，保護細胞免受損傷，屬于機體內的防御系統酶類。SOD活力與機體的免疫水平密切相關，對增強巨噬細胞的防御功能和整個機體的免疫機能發揮著十分重要的作用[11]。本研究顯示，浸泡免疫可以提高血清SOD活力，免疫后7～14 d的血清SOD活力顯著高于對照組。

Mx蛋白是一類由I型干擾素（IFN）誘導表達的抗病毒蛋白，當機體或細胞受到病毒感染時，能與其他干擾素誘導的蛋白一起形成體內抗病毒感染的防線，以達到抗病毒的目的。本研究結果表明，浸泡免疫后鱖魚脾臟中Mx mRNA相對表達量隨時間呈上升趨勢，72 h和96 h的Mx mRNA含量分別是對照組的1.45倍和2.02倍。DNA疫苗浸泡免疫后，IgM mRNA表達含量隨時間呈上升趨勢，與對照組比 72 h達到2.04倍，96 h達到3.05倍。pcMCP DNA疫苗浸泡免疫能夠激活天然免疫和特異性免疫。在本研究中Mx和IgM mRNA大量表達出現在72 h，疫苗刺激的效應基因表達較晚，可能是因為DNA疫苗浸泡后的細胞攝入、抗原表達、加工、識別，以及免疫效應分子的表達都需要一定的時間。本研究結果與斜帶石斑魚、牙鲆免疫浸泡后IgM基因的表達相一致[12，13]，結合之前的相關報道，IgM表達高峰出現時間可能與魚的種類、疫苗、免疫方式等有關，DNA疫苗浸泡免疫的產生要晚于蛋白疫苗免疫。

通過對免疫后的鱖魚攻毒試驗顯示，DNA疫苗浸泡組在免疫后第11天的累計死亡率為40%，而未免疫組在第11天已經全部死亡，對照組死亡時間主要集中在5～9 d，這與Mx基因和IgM基因在第3天后大量表達相一致。

參考文獻：

[1] EVENSEN O，LEONG J A. DNA vaccines against viral diseases of farmed fish[J].Fish & Shellfish Immunology，2013，35（6）：1751-1758.

[2] KURATH G. Biotechnology and DNA vaccines for aquatic animals[J].Revue Scientifique Et Technique，2008，27（1）：175-196.

[3] RAJESHK S，AHMEDVPIS，PARAMESWARAN V，et al. Potential use of chitosan nanoparticles fororal delivery of DNA vaccine in Asian sea bass（Lates calcarifer） to protect from Vibrio （Listonella） anguillarum[J].Fish & Shellfish Immunology，2008， 25（2）：47-56.

[4] VIMAL S，MAJEED S A，NAMBI K S N，et al. Delivery of DNA vaccine using chitosan-tripolyphosphate（CS/TPP）nanoparticles in Asian sea bass，Lates calcarifer（Bloch，1790） for protectionagainst nodavirus infection[J].Aquaculture，2014，420-421：240-246.

[5] ABU-ELALA N M，MOHAMED S H，ZAKI M M，et al. Assessment of theimmune-modulatory and antimicrobial effects of dietary chitosan on Niletilapia（Oreochromis niloticus） with special emphasis to its bio-remediatingimpacts[J].Fish & Shellfish Immunology，2015，46（2）：678-685.

[6] CHENG W，YU J S. Effects of the dietary administration of sodium alginate onthe immune responses and disease resistance of Taiwan abalone，Haliotisdiversicolor supertexta[J].Fish & Shellfish Immunology，2013，34（3）：902-908.

[7] FUJIKI K，MATSUYAMA H，YANO T. Protective effect of sodium alginates againstbacterial infection in common carp，Cyprinus carpio L.[J].Journal of Fish Diseases，2010，17（4）：349-355.

[8] LIN S，PAN Y，LUO L，et al. Effects of dietary beta-1，3-glucan，chitosan or raffinoseon the growth，innate immunity and resistance of koi（Cyprinus carpio koi）[J].Fish & Shellfish Immunology，2011，31（6）：788-794.

[9] FERNANDEZ-ALONSO M，ROCHA A，COLL J M. DNA vaccination by immersion and ultrasound to trout viral haemorrhagic septicaemia virus[J].Vaccine，200，19（23-24）：3067-3075.

[10] IAKHNENKO V M，KLIMENKOV I V. Specific features of blood cell composition and structure in fishes from the pelagial and coastal zones of Lake Baikal[J].Biology Bulletin，2009， 36（1）：37-44.

[11] 李 赫，宋文華，于 翔，等.幾種免疫增強劑對草魚SOD、CAT及AKP活性的影響[J].水產學雜志，2010，23（4）：7-8.

[12] CUI M，ZHANG Q Z，YAO Z J，et al. Immunoglobulin M gene expression analysis of orange-spotted grouper， Epinephelus coioides，following heat shock and Vibrio alginolyticus challenge[J].Fish Shellfish Immunol，2010，29（6）：1060-1065.

[13] 宋曉青，邢 婧，戰文斌.牙鲆經注射和浸泡免疫鰻弧菌滅活疫苗后7種免疫相關基因表達的變化[J].中國水產科學，2014， 21（4）：747-758.