31種藥用植物HMGR蛋白的生物信息學分析

郝愛平+國會艷+薛巨坤

摘要：利用生物信息學方法對大戟（Euphorbia pekinensis）、曼地亞紅豆杉（Taxus media）、球藥隔重樓（Paris fargesii）等31種藥用植物HMGR蛋白質的理化性質、親/疏水性、跨膜結構、蛋白質二級結構、信號肽等進行預測和分析。結果表明，31種藥用植物HMGR蛋白氨基酸殘基數量大部分在500～600 aa之間；大多數定位于質膜上；分子質量在58～65 ku之間；主要富含Gly、Ala、Leu、Ser和Val等氨基酸。HMGR蛋白具有一定的親水性，含有兩個跨膜結構域，均不具有信號肽，二級結構的主要構件為α-螺旋和不規則卷曲。曼地亞紅豆杉、羅漢果、假馬齒莧、蒼術、秦艽、土沉香、丹參、銀杏、黃花蒿HMGR蛋白為穩定蛋白，而其余均為較不穩定蛋白。同源性分析表明，除了靈芝以外，其他植物均聚集在同一枝上，藥用植物HMGR蛋白有較高的保守性。

關鍵詞：藥用植物；生物信息學；HMGR；萜類化合物

中圖分類號：Q71；R282.71 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）14-2761-07

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.14.042

Abstract： The physical and chemical properties，Pro/hydrophobicity，transmembrane structure，protein two structure，signal peptide and other aspects of the prediction of the HMGR protein of 31 kinds of medicinal plants were analyzed by using bioinformatics methods and tools，including Euphorbia pekinensis，Taxus media， Paris fargesii and other 31 kinds of medicinal plants. Results showed thatthe number of amino acid residues of HMGR protein of 31 medicinal plants was mostly between 500 aa and 600 aa；Most localized on the plasma membrane；Molecular mass was 58～65 ku；Mainly riched in Gly，Ala，Leu，Ser and Val and other amino acids. HMGR protein has a certain degree of hydrophilicity，which contains two transmembrane domains，and has no signal peptide. The main component of the two stage structure was alpha helix and random coil. The HMGR proteinof Taxus media，Siraitia grosvenorii，Bacopa monnieri，Atractylodes lancea，Gentiana macrophylla，Aquilaria sinensis，Salvia miltiorrhiza，Ginkgo biloba and Artemisia annua were a stable protein，while the rest were less stable protein. In addition to ganoderma lucidum，other plants were gathered on the same branch，which showed that the medicinal plant HMGR protein has a high conservation.

Key words： medicinal plants； bioinformatics； HMGR； terpenoids

萜類化合物種類繁多，廣泛存在于植物、動物以及微生物等體內。截至目前，已經從生物界中鑒定了50 000種以上，而大多數萜類化合物是從植物中分離得到的[1]。萜類化合物的結構極其多樣化，生理作用更是復雜多樣，它所產生的應用價值和經濟價值都是非常可觀的，目前在醫療衛生、工農業生產、能源等領域均作為重要原料使用[2]。該類成分具有較好的抗菌、抗病毒、抗腫瘤等活性。目前應用于實際的有抗腫瘤特效藥物紫杉醇（Paclitaxel）、抗瘧藥特效藥物青蒿素（Artemisinin）以及用于臨床治療心血管系統疾病的丹參酮（Bunge）[3-5]。某些植物的香精、樹脂、色素油（檸檬烯）、類胡蘿卜素和天然橡膠等的主要成分都是由萜類化合物構成的；萜類化合物在植物與無機生活環境的互作中也發揮著重要作用，如植物對昆蟲的防御力、增強植物的抗病能力、化感作用、與其他種群的互利關系等[6，7]。

萜類化合物合成的途徑主要分為兩種途徑[8]，第一條途徑是甲羥戊酸（Me-valonate，MVA）途徑，在細胞質中完成；第二條途徑是2-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸（2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate，MEP）途徑，在質體中完成[8]。MVA途徑是2個乙酰CoA分子在乙酰乙酰CoA轉運酶作用下形成乙酰乙酰CoA，經羥甲基戊二酰CoA合酶催化形成3-羥基-3-甲基戊二酰CoA，在羥甲基戊二酰CoA還原酶（HMGR）和2個NADPH分子催化下生成MVA，而后MVA在MVA激酶的作用下，形成甲羥戊酸-5-磷酸，接下來在二氧磷基MVA激酶作用下生成MVA-5-二磷酸，最終在MVA焦磷酸脫羧酶作用下生成IPP[2]。有大量相關試驗研究指出兩條途徑并不是完全獨立存在的，而是有相互交叉存在的IPP基因。IPP是MVP和DXP兩條途徑的交匯處，兩條途徑所產生的IPP可以穿過質體膜互為對方所用[3]，合成途徑如圖1所示。

植物MVA的途徑中的第一個關鍵酶是3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶（3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A reductase，HMGR），與NADPH催化3-羥基-3-甲基戊二酰CoA生成甲羥戊酸，該反應是不可逆的反應，更是萜類合成的一個重要的調控位點[9]。武瑩[10]克隆了藥用植物雷公藤（Tripterygium wilfordii）HMGR基因，其全長序列為1 909 bp，包括98 bp的5′上游序列，50 bp的3′序列，該序列以Poly A結尾，開放閱讀框1 860 bp，編碼579個氨基酸。羅紅梅等[11]克隆了人參（Panax ginseng）的一個HMGR基因片段，該基因片段全長1 770 bp，編碼589個氨基酸殘基，不含信號肽，包括兩個跨膜結構域，HMGR的表達直接促進人參皂苷的合成。陳鳳美等[12]首次克隆了播娘蒿（Descurainia sophia）HMGR基因458 bp保守區片段。韓興杰等[13]通過PCR方法從茶樹（Camellia sinensis）中克隆了1個編碼HMG-CoA還原酶的cDNA全長序列，該序列由1 979 bp組成，包含1個1 722 bp的完整開放閱讀框，編碼573個氨基酸。邢朝斌等[14]克隆了刺五加（Acanthopanax senticosus）HMGR基因，開放閱讀框全長1 713 bp，編碼570個氨基酸。有藥用植物橡膠草（Taraxacum kok-saghyz Rodin）、烏拉爾甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch）、巨尾桉（Eucalyptus grandis×E.urophylla）和甜瓜（Cucumis melo）等HMGR基因被克隆。Majdi等[15]從小白菊（Chrysanthemum parthenium）中克隆出HMGR基因，該基因在小白菊花中表達表達量最高。李非非等[16]對刺五加HMGR基因的表達進行了系統分析，結果表明，HMGR基因在根莖葉等器官中均有表達，但相對表達量間有較大的差異；不同產地的刺五加其HMGR基因的表達量與總皂苷成正相關。楊錦芬等[17]報道擬南芥（Arabidopsis thaliana）的HMGR1基因在番茄（Lycopersicon esculentum Mill.）中過量的表達，可使番茄中的植物甾醇含量增加到2.4倍。劉穎等[18]克隆了甘草（Glycyrrhiza uralensis）的HMGR基因全長序列并構建了該基因的原核表達載體，通過產物純化得到了60 ku的HMGR蛋白，表明該蛋白能較好完成特定的酶促反應任務。Ramm等[19]通過試驗證實甲羥戊酸途徑是青蒿素生物合成的主要來源，且HMGR限制植物黃花蒿中青蒿素的合成和積累。Nafist等[20]證實HMGR基因的過量表達，可以增加了黃花蒿中青蒿素的產量。Olofssonl等[21]研究發現，與其他組織相比，HMGR基因在黃花蒿老葉片中的表達量較低。

本研究采用生物信息學的分析方法，以杜仲為重點，對大戟、曼地亞紅豆杉、球藥隔重樓等31種藥用植物HMGR蛋白氨基酸序列理化特性、系統進化、親/疏水性、植物亞細胞定位、跨膜結構域、蛋白質二級結構、信號肽等進行預測和分析，為深入開展藥用植物HMGR蛋白的酶學特性、萜類化合物生物合成的分子機制等研究提供理論依據。

1 材料方法

1.1 數據來源

氨基酸序列均來自于NCBI中已登錄的序列：大戟（Euphorbia pekinensis：ABK56831.1）、曼地亞紅豆杉（Taxus media：AAQ82685.1）、球藥隔重樓（Paris fargesii：AGC13078.1）、南非醉茄（Withania somnifera：ADN39417.1）、羅漢果（Siraitia grosvenorii：AEM42971.1）、假馬齒莧（Bacopa monnieri：ADX31914.1）、小木通（Clematis armandii：AEU08408.1）、甘草（Glycyrrhiza uralensis：ADM87300.1）、杜仲（Eucommia ulmoides：AAV54051.1）、西洋參（Panax quinquefolius：ACV65036.1）、砂仁（Amomum villosum：ACR02667.1）、蒼術（Atractylodes lancea：ABK88909.1）、蹄葉橐吾（Ligularia fischeri：ABJ16394.1）、三七（Panax notoginseng：AIK21780.1）、雷公藤（Tripterygium wilfordii：ALU11310.1）、澤瀉（Alisma plantago-aquatica Linn. ：AKR79505.1）、盾葉薯蕷（Dioscorea zingiberensis：AGN32411.1）、秦艽（Gentiana macrophylla：AFN89599.1）、長春花（Catharanthus roseus：AAT52222.1）、人參（Panax ginseng：AIX87980.1）、土沉香（Aquilaria sinensis：AGA83240.1）、龍膽草（Gentiana lutea：BAE92731.2）、鐵皮石斛（Dendrobium catenatum：AGA18962.1）、刺五加（Eleutherococcus senticosus：AFM77981.1）、丹參（Salvia miltiorrhiza：ACT65734.1）、銀杏（Ginkgo biloba：AAU89123.1）、穿心蓮（Andrographis paniculata：AAP14352.2）、紫草（Arnebia euchroma：ABE27875.1）、胡黃連（Picrorhiza kurrooa：ABC74565.1）、靈芝（Ganoderma lucidum：ABY84848.1）、黃花蒿（Artemisia annua：AAD47596.1）共計31種藥用植物。

1.2 方法

運用在線軟件ProtParam分析藥用植物HMGR蛋白氨基酸序列理化性質；運用在線軟件ProtScale分析藥用植物HMGR蛋白親/疏水性；運用在線軟件PSORT分析HMGR蛋白亞細胞定位；運用在線工具SignalP分析HMGR蛋白信號肽；運用SOPMA軟件對HMGR蛋白氨基酸序列二級結構進行分析和預測；運用TMHMM 2.0 Server對HMGR蛋白進行跨膜結構域的分析和預測；運用MEGA 5.1構建分子進化樹，相關生物學軟件如下表1所示。

2 結果與分析

2.1 藥用植物HMGR蛋白的理化性質分析

利用ProtParam在線軟件分析大戟、曼地亞紅豆杉、球藥隔重樓等31種藥用植物HMGR基因的氨基酸序列，結果見表2。由表2可知，植物HMGR氨基酸殘基數量除了長春花601 aa、澤瀉602 aa、靈芝1 126 aa以外，其余31種藥用植物均分布在500～600 aa。靈芝HMGR蛋白分子質量最大（13.174 9 ku）；其余31種藥用植物HMGR蛋白分子質量均為58～65 ku。31種藥用植物HMGR蛋白的理論等電點大小不等，土沉香最小（5.69），靈芝最大（8.51）。根據穩定指數在40以下則為穩定蛋白質，40以上為不穩定蛋白的標準，表明曼地亞紅豆杉、羅漢果、假馬齒莧、蒼術、秦艽、土沉香、丹參、銀杏、黃花蒿HMGR蛋白為穩定蛋白，而其余均為較不穩定蛋白，曼地亞紅豆杉HMGR蛋白最為穩定，其不穩定指數低至32.94，長春花HMGR蛋白最為不穩定，其不穩定指數為51.76。Gly、Ala、Leu、Ser、Val在大戟、曼地亞紅豆杉、球藥隔重樓等31種植物的HMGR蛋白中含量最為豐富，由此推測其可能與維持HMGR蛋白空間結構的穩定性有關。

對大戟、曼地亞紅豆杉、球藥隔重樓等31種藥用植物HMGR蛋白采用PSORT在線生物學軟件進行亞細胞定位分析。結果表明，大戟、球藥隔重樓、南非酔茄、西洋參、蹄葉橐吾、三七、人參、龍膽草HMGR蛋白定位于線粒體內膜上，小木通HMGR蛋白定位于高爾基體上。其余植物HMGR蛋白定均定位于質膜上。由此推斷，在大戟、曼地亞紅豆杉、球藥隔重樓等31種藥用植物體中，雖然HMGR蛋白的定位有所不同，但絕大多數定位于質膜上，少數定位于線粒體內膜上，定位機制較為復雜。

2.2 藥用植物HMGR蛋白的疏水性/親水性分析

利用ProtScale在線軟件對大戟、曼地亞紅豆杉、球藥隔重樓等31種植物的HMGR蛋白疏水性/親水性進行預測，根據正值表示疏水，其絕對值越大表示疏水性越強；反之負值表示親水，其值絕對值越大表示親水性越強；而數值在+0.5到-0.5之間的主要表現為兩性氨基酸為標準，以杜仲為例，結果見圖2。由圖2可知，杜仲HMGR蛋白多肽鏈中第73位有最低分值-2.667，其親水性最強；第93位有最高值2.822，其疏水性最強。在整個HMGR多肽鏈中，親水性氨基酸數量略多于疏水性氨基酸，因此，杜仲HMGR蛋白表現為一定的親水性，但親水性很低。其余幾種藥用植物的HMGR氨基酸序列的疏水性與親水性進行預測結果與杜仲相似，可以推測藥用植物HMGR蛋白主要表現為親水性蛋白，但親水性較低，內部有疏水區。

2.3 藥用植物HMGR蛋白的跨膜結構分析

蛋白質序列中的跨膜區域，既可作為膜受體起作用，與此同時也可能是定位于膜上的錨定蛋白或是離子通道蛋白，所以含有跨膜區蛋白往往和細胞的功能狀態密切相關，在真菌和動物細胞中的HMGR蛋白的跨膜結構域一般為7～8個跨膜結構域[18]，而植物HMGR一般只有1～2個跨膜結構域[19]。以杜仲HMGR為研究對象，用在線生物學工具TMHMM 2.0 Server進行預測分析，結果如圖3所示。由圖3可知，該蛋白具有兩個跨膜結構域，分別在氨基酸序列的46～68，89～111氨基酸處，同時對大戟、曼地亞紅豆杉、球藥隔重樓等31種不同藥用植物的HMGR蛋白分析和預測，均具有跨膜結構。大部分有兩個跨膜結構域，位于30～120氨基酸之間；其中龍膽草只有一個跨膜結構域為33～55氨基酸處；靈芝有3個跨膜結構域，分別位于13～35、222～244、251～270氨基酸處。由于HMGR蛋白具有跨膜結構域，表明其可能為跨膜蛋白。蛋白質的跨膜結構與其功能都是相對應的，因此推測此該蛋白可能為某種物質的膜受體或者參與物質的運輸。

2.4 藥用植物HMGR蛋白的二級結構分析

蛋白質二級結構指多肽鏈按照一定的周期性，由氫鍵維持的空間結構。以杜仲為研究對象進行蛋白質二級結構分析，使用在線網站SOPMA進行分析預測HMGR蛋白的二級結構，結果如圖4所示。由圖4可知，該蛋白由39.32%的α-螺旋（Alpha helix）、15.93%的延伸鏈（Extended strandn）、7.80%的β-轉角（Beta turn）和36.95%的無規卷曲（Random coil）組成，其中α-螺旋和不規則卷曲是HMGR蛋白中主要的結構元件，散布于整個肽鏈中。大戟、曼地亞紅豆杉、球藥隔重樓等其他31種藥用植物HMGR蛋白的二級結構中也有類似的情況。

2.5 藥用植物HMGR蛋白的信號肽分析

信號肽位于分泌性蛋白N端，一般有16～26個氨基酸殘基組成，包括疏水核心區、信號肽的N端和C端3個部分組成，其在分泌性蛋白合成結束將被切除[15]。利用在線工具Signal 4.1 Server分析杜仲HMGR蛋白的信號肽及其位置，結果如圖5所示。由圖5可知，杜仲HMGR蛋白不具有信號肽的特點，同時對大戟、曼地亞紅豆杉、球藥隔重樓等31種藥用植物分析確定以上植物HMGR蛋白均不具有信號肽的特點，因此推測HMGR蛋白為非分泌性蛋白。

2.6 藥用植物HMGR蛋白的分子進化分析

對大戟、曼地亞紅豆杉、球藥隔重樓等31種不同藥用植物的HMGR蛋白序列運用MEGA5.1軟件中的NJ法進行分子系統進化分析，結果如圖6所示。由圖6可知，除了靈芝以外，其他植物均聚集在同一枝上，具有較為親近的親緣關系和進化地位。其中親緣關系較近的假馬齒莧、丹參和紫草聚集在同一枝上；長春花、秦艽和龍膽草聚集在同一枝上；同為人參科的人參、西洋參和三七也聚在同一枝上。結果表明，HMGR蛋白具有較高的保守性，可以作為藥用植物遺傳分子進化的重要理論依據。

3 結論

采用生物信息學的分析方法，以杜仲為例對大戟、曼地亞紅豆杉、球藥隔重樓等31種藥用植物HMGR蛋白進行預測和分析，得出以下結論。

1）31種藥用植物HMGR蛋白氨基酸殘基數量大部分在500～600 aa，其中靈芝HMGR氨基酸殘基數量最大為1 126 aa。分子質量除靈芝為（131.174 9 ku），其余均介于58～65 ku。

2）曼地亞紅豆杉、羅漢果、假馬齒莧、蒼術、秦艽、土沉香、丹參、銀杏、黃花蒿HMGR蛋白均為穩定蛋白，而其余均為較不穩定蛋白。

3）31種藥用植物HMGR蛋白的亞細胞絕大多數定位于質膜上，少數定位于線粒體內膜上。

4）31種藥用植物HMGR蛋白其親水性氨基酸數量略多于疏水性氨基酸主要表現為親水性蛋白，但是親水性很低，內部有疏水區。

5）大部分藥用植物HMGR蛋白都有兩個跨膜結構域，處于30～120 aa，均不具有信號肽；α-螺旋和不規則卷曲是藥用植物HMGR蛋白二級結構的主要元件。

6）除了靈芝以外，其他植物均聚集在同一枝上，具有較為親近的親緣關系和進化地位，其中親緣關系較近的假馬齒莧、丹參和紫草聚集在同一枝上；長春花、秦艽和龍膽草聚集在同一枝上；同為人參科的人參、西洋參和三七也聚在同一枝上；藥用植物HMGR蛋白有較高的保守性。

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