冠心顆粒的標準研究

胡北　張朝紳　姜范成

[摘要] 目的 建立冠心顆粒的質量標準。 方法 采用薄層色譜法（TLC）對冠心顆粒中丹參、三七進行定性鑒別；采用2015年版《中國藥典》微生物限度檢查法進行驗證試驗，并對2批次樣品進行微生物限度檢查；采用高效液相色譜法對丹酚酸B進行含量測定：色譜柱為Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為以甲醇-乙腈-1%甲酸水溶液（29∶9∶62），流速為1.0 mL/min檢測波長為286 nm。 結果 TLC鑒別斑點清晰、分離較好，陰性對照無干擾；2批冠心顆粒微生物計數方法適用性試驗需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數各菌的回收率均在50%～200%，且均未檢出大腸埃希菌，驗證組可檢出大腸埃希菌，該方法可行；丹酚酸B在0.06～0.54 mg/mL與峰面積呈良好的線性關系（r = 0.9998），平均加樣回收率為98.61%，RSD = 1.24%（n = 6）；2批樣品含量測定結果均符合要求。 結論 本方法所用定性、定量及微生物限度檢查方法準確可靠、重現性好，能有效控制冠心顆粒的藥品質量。

[關鍵詞] 冠心顆粒；薄層色譜法；微生物限度檢查；丹酚酸B；高效液相色譜法

[中圖分類號] R286.0 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）07（a）-0012-05

[Abstract] Objective To establish the quality standard of Guanxin Keli. Methods TLC method was used for the qualitative identification of Salvia miltiorrhiza Bge.， Panax notoginseng （Burk） F.H.Chen； the method validation was conducted by using microbial limit test in Chinese Pharmacopoeia 2015. 2 batches of Guanxin granules were tested under the validated method. HPLC was used to determine the content of salvianolic acid B. The determination was performed on KromasilC18 （250 mm×4.6 mm， 5 μm） column with mobile phase consisted of methanol-acetonitrile-1% formic acid water （29∶9∶62） at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 286 nm. Results TLC spots were clear and well-separated without negative interference. The recoveries of each validation strain for the total aerobic micribial count， total yeasts and mold count were among 50%-200%， and did not test E. coli. This validation of method could test E. coli， and was capable. The linear range of salvianolic acid B was 0.06-0.54 mg/mL （r = 0.9998） with an average recovery of 98.61 %， RSD = 1.24% （n = 6）； the content of two batchs samples were satisfactory. Conclusion The method is simple， accurate and reproducible. It is effective in controlling the quality of Guanxin Keli and providing the basis for improving the quality standas of Guanxin Keli.

[Key words] Guanxin Keli； TLC； Microbial limit test； Salvianolic acid B； HPLC

冠心顆粒是沈陽軍區總醫院（以下簡稱“我院”）自主研發的制劑，在我院已臨床應用多年，由丹參、當歸、川芎、三七、降香5味中藥組成，此制劑用于治療冠狀動脈粥樣硬化、供血不足導致的冠心病、心絞痛、心肌梗塞即中醫的“胸痹”。本實驗采用高效液相色譜法對丹參中丹酚酸B的含量進行檢測，并采用薄層色譜法（TLC）對方中丹參、三七進行鑒別；參照2015年版《中國藥典》微生物限度檢查法進行微生物驗證試驗，建立了完善的冠心顆粒標準。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1100型高效液相色譜儀（DAD檢測器）；島津紫外-可見分光光度計（UV-1750）；AUW 120D型電子分析天平（島津公司），超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，型號：KQ3200）。

1.2 試藥與試劑

金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、銅綠假單胞菌[CMCC（B）10104]、枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]、白色念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉[CMCC（F）98003]和大腸埃希菌[CMCC（B）44102]均由中國食品藥品檢定研究院提供。

冠心顆粒（批號：20151101、20150809）及各陰性樣品均由我院自制；丹酚酸B對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：111562-201313），丹參對照藥材（中國食品藥品檢定研究院，批號：120923-200610），三七皂苷R1對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110745-200312）；水為重蒸水（自制），甲醇和乙腈均為色譜純（購自Fisher公司），其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 薄層鑒別

2.1.1 丹參的薄層鑒別

取冠心顆粒1.3 g，研細，加10 mL水使其溶解，用稀鹽酸將pH值調至2，加20 mL乙酸乙酯，進行萃取，分取乙酸乙酯液，蒸干，殘渣加2 mL甲醇，作為供試品溶液。此外再取丹參對照藥材0.5 g，加水30 mL，煎煮30 min[1-3]，濾過，同法制成對照藥材溶液。按處方配比，取除丹參外的其他藥材，制成顆粒劑，再按上述方法制得陰性樣品溶液。照薄層色譜法試驗，分別吸取5 μL上述溶液，再各自點于同一硅膠G薄層板上，以二氯甲烷-丙酮-甲酸（10∶4∶1.6）為展開劑[4-5]，展開，取出，晾干，置氨氣熏蒸后，放置10 min，最后置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，且陰性對照不干擾丹參的鑒別（圖1）。

2.1.2 三七的薄層鑒別

取冠心顆粒10 g，研細，加水50 mL使溶解，加入水飽和正丁醇30 mL，超聲提取10 min，離心，取上清液，加3倍量以正丁醇飽和的水，搖勻，靜置使其分層，分取正丁醇液[6-7]，蒸干，殘渣加1 mL甲醇，作為供試品溶液。再取三七皂苷R1對照品，加甲醇制成1.5 mg/mL的溶液，作為對照品溶液。按處方配比，取除三七外的其他藥材，制成顆粒劑，再按上述方法制得陰性樣品溶液。照薄層色譜法試驗，分別吸取10 μL上述溶液，各自點于同一硅膠G薄層板上，以二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水（15∶40∶22：10）10℃以下放置的下層溶液為展開劑[8-9]，展開，取出，晾干，然后用10%硫酸乙醇溶液進行顯色，最后在105℃情況下加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應位置上，顯相同顏色的斑點，且陰性對照不干擾三七的鑒別（圖2）。

2.2 微生物限度檢查

2.2.1 菌液制備

取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌的新鮮培養物，制成需要濃度的菌懸液（用pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液進行配置）；取黑曲霉的新鮮培養物，用3～5 mL含0.05%聚山梨酸酯80的pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，將孢子洗脫。吸出孢子混懸液至無菌試管內，制成需要濃度的黑曲霉孢子懸液（用含0.05%聚山梨酸酯80的pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液進行配置）[10-12]。

2.2.2 供試液制備

取冠心顆粒10 g，加入100 mL pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，振搖使其充分溶散，混勻，制成1∶10的供試液。

2.2.3 微生物計數法

2批次冠心顆粒的5株驗證菌中，樣品的回收率均在50%～200%的范圍內，常規平皿傾注法適用于冠心顆粒的需氧菌總數、霉菌及酵母菌總數計數。

2.2.4 大腸埃希菌檢查驗證試驗

取冠心顆粒10 g，加入100 mL pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，振搖使其充分溶散，混勻，制成1∶10的供試液。

2.2.4.1 供試品組 取供試液10 mL，接種于100 mL胰酪大豆胨液體培養基中。

2.2.4.2 陰性對照組 取pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液10 mL，接種于100 mL胰酪大豆胨液體培養基中。

2.2.4.3 陽性驗證組 取供試液10 mL，接種于100 mL胰酪大豆胨液體培養基中，加入菌落數在10～100 cfu的大腸埃希菌菌懸液1 mL。

陰性對照組和供試品組均未見菌生長，陽性驗證組麥康凱瓊脂培養基平板上有菌落生長，經分離、純化和鑒定試驗確證為大腸埃希菌。結果表明直接接種法可用于冠心顆粒大腸埃希菌檢查。

2.2.5 微生物限度檢查結果

2批冠心顆粒微生物限度檢驗結果表明：2批冠心顆粒需氧菌總數均小于103 cfu/g，霉菌和酵母菌總數均小于102 cfu/g；2批冠心顆粒均未檢出大腸埃希菌。符合2015版《中國藥典》微生物限度標準。

2.3 含量測定

2.3.1 色譜條件與系統適用性試驗

用C18色譜柱；流動相：甲醇-乙腈-1%甲酸水溶液（29∶9∶62）[13-16]；以286 nm為檢測波長。理論板數按丹酚酸B峰計算應不低于4000。

2.3.2 對照品溶液的制備

精密稱定丹酚酸B對照品，用75%甲醇制成0.3 mg/mL的對照品溶液。

2.3.3 供試品溶液的制備

取本品，研細，取約5.0 g，放在具塞錐形瓶中，精密加入50 mL 75%甲醇，密塞，稱定其重量，超聲30 min后，放冷，再稱定其重量，用75%甲醇補足其減失的重量，搖勻，濾過，得供試品溶液[17-20]。

2.3.4 陰性對照溶液的制備

取按處方除去丹參的陰性樣品5.0 g，按上述方法制備陰性對照溶液，即可。

2.3.5 專屬性考察

分別精密吸取10 μL上述陰性對照溶液、供試品溶液、對照品溶液，注入高效液相色譜儀，測定結果見圖3。

結果表明，丹酚酸B的保留時間約為13 min，陰性對照樣品不干擾丹酚酸B的測定，丹酚酸B與其他成分或雜質的分離度大于1.5，理論板數按丹酚酸B峰計算均不低于4000。試驗結果表明此法專屬性強。

2.3.6 線性范圍

精密吸取10 μL丹酚酸B對照品溶液，濃度分別為0.06、0.18、0.3、0.42、0.48、0.54 mg/mL，注入液相色譜儀，按“2.3.1”色譜條件進行分析，測定各自丹酚酸B的峰面積，以丹酚酸B對照品濃度（mg/mL）為橫坐標，丹酚酸B峰面積值為縱坐標，求得線性回歸方程：y = 12299 x-49.236，r = 0.9998。結果表明丹酚酸B在0.06～0.54 mg/mL與峰面積呈良好的線性關系。

2.3.7 精密度試驗

精密吸取10 μL對照品溶液，按“2.3.1”色譜條件分析，連續進樣6次，記錄丹酚酸B色譜峰的峰面積，測得其峰面積值的RSD為0.46%（n = 6），結果證明儀器精密度較好。

2.3.8 穩定性試驗

取冠心顆粒約5.0 g，精密稱定，按照“2.3.3”項下制備供試品溶液，按“2.3.1”色譜條件分析，分別在0、2、4、6、8、10 h，測定樣品中丹酚酸B峰面積值，其RSD為1.73%（n = 6），結果表明冠心顆粒供試品溶液放置10 h穩定。

2.3.9 重復性試驗

取冠心顆粒6份，每份約5.0 g，精密稱定，按照“2.3.3”項制備供試品溶液，按“2.3.1”色譜條件分析，測定每份樣品中丹酚酸B含量。結果6份樣品中丹酚酸B平均含量為2.2982 mg/g，RSD為2.52%（n = 6），結果證明本方法重復性較好。

2.3.10 加樣回收率試驗

取冠心顆粒6份，每份約2.5 g，精密稱定，分別加入6 mL丹酚酸B對照品溶液（濃度為1.0000 mg/mL），按照“2.3.3”項下制備供試品溶液，按“2.3.1”色譜條件分析，計算每份樣品中丹酚酸B含量，求得回收率，結果表明，冠心顆粒中丹酚酸B的平均回收率為98.61%，RSD為1.24%（n = 6），符合要求。

2.3.11 樣品含量測定

取2批冠心顆粒，按照上述方法制備供試品溶液，按“2.3.1”色譜條件項下色譜條件分析，測定每份樣品中丹酚酸B的含量，結果見表1。

3 討論

3.1 薄層鑒別

本實驗對丹參薄層鑒別中提取溶劑乙酸乙酯、乙醚等溶劑進行考察，并對二氯甲烷-丙酮-甲酸、環已烷-乙酸乙酯等不同展開系統及不同比例進行比較，得到上述最佳薄層鑒別方法，使結果斑點清晰、陰性無干擾。

本實驗對三七薄層鑒別中提取溶劑正丁醇、甲醇等溶劑進行考察，并對二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水等不同展開系統及不同比例進行比較，得到上述最佳薄層鑒別方法，使結果斑點清晰、陰性無干擾。

3.2 微生物限度檢查

2015年版《中國藥典》由于培養體系的變化，微生物限度方法將需要重新驗證。本文的實驗結果表明，2015年版《中國藥典微生物限度檢查》可以參照2010年版驗證過的方法，采用類似的稀釋步驟，建立滿足2015年版《中國藥典》需求的微生物限度檢查方。2015年版《中國藥典》方法在需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數的計數上，檢出率和檢出數量都明顯高于2010年版的細菌數、霉菌和酵母菌總數。

3.3 含量測定

本實驗考察了超聲和回流的提取方法，結果采用超聲提取方法與加熱回流提取方法的含量基本相同，但考慮到超聲提取方法較為簡便，故將提取方法定為超聲提取。考察50%甲醇、75%甲醇、甲醇不同提取溶劑，結果表明：提取溶劑為75%甲醇時，測得的樣品含量稍高于其他兩種溶劑，故采用75%甲醇為提取溶劑。考察75%甲醇25、50、75 mL的溶劑用量，結果表明，溶劑用量為50 mL和70 mL時，測得的樣品含量明顯高于25 mL；溶劑用量為70 mL和50 mL時，測得的樣品含量差別不大，故將提取溶劑用量定為50 mL。分別考察超聲提取10、20、30 min，結果表明提取時間為30 min時測得的含量大于10 min和20 min，故將提取時間定為30 min。根據考察的結果確定下供試品溶液制備方法，此方法簡便易行，且丹酚酸B含量較高，陰性無干擾，符合要求。

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（收稿日期：2017-03-08 本文編輯：蘇 暢）