不同氮磷比對福建沿海米氏凱倫藻生長的影響

潘非斐， 吳 楠

(福建省海洋環境與漁業資源監測中心，福建 福州 350003)

不同氮磷比對福建沿海米氏凱倫藻生長的影響

潘非斐， 吳 楠

(福建省海洋環境與漁業資源監測中心，福建 福州 350003)

本文在不同氮磷比(N∶P=4∶1、8∶1、16∶1、32∶1、80∶1)培養條件下，對福建沿海赤潮海域分離的米氏凱倫藻(Kareniamikimotoi)進行培養，研究其生長特性。實驗結果表明：不同的氮磷比對米氏凱倫藻的生長有明顯的影響。過高或過低的氮磷比均不適合米氏凱倫藻的生長，該藻在N∶P=32∶1條件下比生長率最快，為0.33 d-1。米氏凱倫藻對氮的需求高于磷，在適當的磷限制環境中能夠維持更長的生長周期。引發赤潮的主要原因并不是由于米氏凱倫藻赤潮暴發海域的低氮磷比，而是赤潮暴發過程中，米氏凱倫藻對營養鹽的大量消耗，尤其是對氮的消耗。

氮磷比；赤潮；米氏凱倫藻

米氏凱倫藻(Kareniamikimotoi)，屬于裸甲藻目(Gymnodiniales)、凱倫藻屬(Karenia)，是一種典型的有毒有害赤潮種。近年來，該種在我國沿海頻繁引發赤潮，造成了嚴重的漁業經濟損失。2012年5—6月，福建福鼎、霞浦、黃岐、平潭、湄洲島等10處海域先后發生米氏凱倫藻赤潮，持續時間達20 d，累計面積323 km2，并導致水產養殖貝類尤其是養殖鮑的大規模死亡，直接經濟損失高達20.11億元[1]。

氮和磷是浮游植物生長的重要營養物質，通常浮游植物是按照Redfield系數(N/P=16)吸收利用海水中的氮磷，當海水中的營養鹽摩爾比值偏離該系數時，則會對浮游植物的生長產生一定的限制作用，因此，海水中的氮磷比將影響海洋浮游植物的生長速率和細胞內物質合成[2]。但是Redfield系數并不適合所有浮游植物，不同的浮游植物有適合其自生長的最適氮磷比[3-4]。因此，研究米氏凱倫藻赤潮發生時的氮磷濃度對藻類生長的影響，對探究赤潮發生規律、演替和成因，并進行赤潮預測預報，減少對水產養殖業的損害有著重要的意義。本文結合2012年福建省沿海米氏凱倫藻赤潮發生時的現場環境條件，研究了不同氮磷濃度比對米氏凱倫藻生長的影響，以期為福建沿海米氏凱倫藻赤潮監測預警提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 藻種

米氏凱倫藻藻種來源于2012年福建米氏凱倫藻赤潮發生海域。實驗前取200 mL處于對數期的米氏凱倫藻(密度達104個/mL以上)離心，培養于無氮無磷的f/2培養基，培養4 d后待用。

1.2 培養條件

實驗所用的器皿均用5% HCl浸泡后，以蒸餾水反復沖洗，滅菌后備用。培養基采用天然外海水通過0.45 μm醋酸纖維膜過濾，按照不加硅酸鹽的f/2配方配制，氮、磷濃度按實驗要求添加，經120℃高溫蒸汽滅菌15 min后備用。培養溫度為(20±2)℃，鹽度利用滅菌蒸餾水稀釋至鹽度約為28.4，光照強度為2 500 Lx，光暗比為12 h∶12 h。

1.3 實驗方法

以NO3-N為氮源、NaH2PO4·2H2O為磷源，通過固定磷濃度，改變氮濃度梯度設置初始氮磷比進行實驗。設置初始磷濃度為0.8 μmol/L(約0.024 8 mg/L，參考2012年連江黃岐米氏凱倫藻赤潮發生期間磷濃度含量)，初始氮濃度依次為0(對照組，即不添加氮元素)、3.2、6.4、12.8、25.6、64.0 μmol/L，使得氮磷比依次為0、4、8、16、32、80。每個濃度梯度設置兩個平行樣，每個平行樣培養體積為600 mL，接種的初始密度為5×102個/mL。

細胞計數：自接種日起，每天在上午10∶30左右取樣，每個梯度取2個樣，每個樣取1 mL藻液，用魯哥試劑固定，用0.1 mL的浮游生物計數框，在BX51生物顯微鏡下進行細胞計數，實驗共觀察15 d。

N、P測定：與細胞計數同步進行，取20 mL藻液，用0.45 μm混合纖維素酯濾膜過濾后，4℃保存，用德國Brant Luebbe GmbH AA3HR型流動化學分析儀測定。

1.4 數據處理

細胞比生長率按以下公式計算：μ=(lnC1-lnC2)/(T1-T2)，其中C1和C2分別是藻類在T1和T2時刻的細胞數量。

利用SPSS18.0軟件在單因素方差分析(one-way ANOVA)的基礎上，采用LSD多重比較法檢驗不同氮磷比處理間的差異(P<0.05)。

2 結果

2.1 不同氮磷比條件下米氏凱倫藻的生長情況

在不同初始氮磷比條件下米氏凱倫藻的生長特征如表1和圖1所示，各組米氏凱倫藻細胞數均能達到103個/mL。最高細胞數在N/P為0～16之間是隨著氮磷比的增加而增加，在N/P =32時則略有下降，低于N/P =16；但在N/P =80時最高細胞數則大幅上升，達到3.74×103個/mL，遠高于其他組；最大比生長率在N/P為0～32之間的變化趨勢也是隨著氮磷比的增加而增加，最高值出現在N/P =32條件下，達到0.33 d-1，而在N/P =80時最大比生長率卻大幅下降，僅為0.20 d-1。

表1 不同氮磷比下米氏凱倫藻的最高細胞數和最大比生長率

從圖1可以看出，各組米氏凱倫藻的生長在前三天均處于停滯期，生長緩慢，差異不大；但從第4天開始，受不同的氮磷比影響，米氏凱倫藻的生長趨勢在不同的培養液中明顯不同。當N/P =4時，米氏凱倫藻細胞數量雖有增加，但生長緩慢，在第6天達到細胞密度最高值，僅為1.31×103個/mL，第7天細胞數量迅速下降，提前進入衰亡期，期間并未經過平穩期，與對照組相比未有顯著差異(P>0.05)。N/P=8與對照組相比具有極顯著差異(P<0.01)，藻類在停滯期后快速生長，經歷了3 d的對數期，第6天達到生長高峰，最高細胞數達到2.66×103個/mL，但隨后第7天細胞密度迅速下降，提前進入衰亡期。N/P=16與對照組之間也存在極顯著差異(P<0.01)，在第4天進入對數期，第7天達到生長高峰，最高細胞數為3.01×103個/mL，隨后也是提前進入衰亡期。N/P=32和N/P=80也分別與對照組間存在極顯著差異(P<0.01)，二者由于前期受到高氮濃度的抑制作用，生長緩慢，分別在第5天和第6天進入對數期，隨后細胞快速生長，在第7天和第11天達到細胞最大值，分別為2.68×103個/mL和3.74×103個/mL；與前幾組不同的是，在N/P=32和N/P=80條件下的米氏凱倫藻在達到細胞最大值后并未直接進入衰亡期，而是進入平穩期，直至實驗結束仍維持較高的細胞密度。多重比較分析結果顯示，實驗期間除了N/P=16條件下米氏凱倫藻細胞密度均值與N/P=8及N/P=32的差異并不顯著(P>0.05)，以及在N/P=80條件下米氏凱倫藻細胞密度均值與N/P=32的差異亦不顯著(P>0.05)外，其余各組間均存在顯著差異(P<0.05)。

2.2 不同氮磷比下米氏凱倫藻對氮的消耗特征

從圖2中可以看出，除N/P=4組外，其余各組在實驗條件下均是于第2天氮濃度有所下降，而第3天則與第2天持平，隨即第4天各組氮濃度均開始持續下降。在N/P=4條件下，氮濃度的消耗主要集中在前4天，第5天氮濃度開始迅速下降，至第15天實驗結束時，培養液中氮的含量減少了3.275 μmol/L，氮的吸收率為99.46%。在N/P=8條件下，氮濃度從第4天開始大幅下降，至第15天實驗結束時，培養液中氮的含量接近于0，共減少了9.389 μmol/L，氮的吸收率為99.70%。當N/P=16時，第2天和第4天氮的濃度均有大幅度下降，隨后持續平緩下降，直至第15天實驗結束時，培養液中氮的含量減少了18.004 μmol/L，吸收率為99.72%。當N/P=32時，氮濃度在第4天開始持續下降，至第15天實驗結束時，培養液中氮的含量減少了29.300 μmol/L，吸收率為94.79%。在N/P=80條件下，氮消耗分為2個階段，從初始到第12天為氮的快速消耗階段，氮含量消耗至29.071 μmol/L；從第13天開始進入氮的緩慢消耗階段，氮略有消耗，但消耗量不大；此后至第15天實驗結束，培養液中的氮濃度雖然大量減少，但是與其它組氮濃度接近于0的情況相比較，該條件下的氮濃度仍然較高，減少了51.746 μmol/L，氮的吸收率為68.93%。

2.3 不同氮磷比條件下米氏凱倫藻對磷的消耗特征

米氏凱倫藻對磷的吸收特征如圖3所示，前3天各組培養液中的磷濃度均持續下降，而后由于受氮濃度的影響，第4天開始各組米氏凱倫藻對磷的吸收特征有所不同。在N/P=4條件下，磷的消耗主要發生在前3天，第4天開始磷含量就趨于平穩，且保持較高水平，在0.600 0 μmol/L附近浮動，至第15天實驗結束時，培養液中磷含量減少了0.229 0 μmol/L，吸收率為28.17%；當N/P=8時，前5天磷含量快速減少，降低至0.387 1 μmol/L，之后磷水平一直維持在該水平，但是在第8天時磷含量又開始上升，上升至約0.600 0 μmol/L水平，并維持在該水平，至實驗結束時，培養液中磷含量降低了0.256 5 μmol/L，吸收率為31.86%；在N/P=16條件下，磷的消耗主要是在前5天，在第6天時磷含量降低至0.196 8 μmol/L，并一直維持在該水平，至實驗結束時，磷含量減少了0.532 3 μmol/L，吸收率為69.18%；在N/P=32條件下，前6天磷含量快速下降，在第7天時下降至0.227 4 μmol/L，此后一直維持在該水平，至第15天時磷含量減少了0.622 6 μmol/L，吸收率為77.05%；當N/P=80時，前10天磷含量大量下降，在第10天磷含量降至0.209 7 μmol/L，之后基本維持在該水平，至第15天實驗結束時，培養液中磷酸鹽含量減少了0.637 1 μmol/L，磷吸收率為79.16%。

2.4 米氏凱倫藻生長過程中氮磷比的變化

從圖4中可以看出，除了N/P=80組外，其他各組的氮磷比的總體變化趨勢為逐漸下降，具體可分為兩個階段，第一個階段是在停滯期和對數生長期，由于氮和磷同時被消耗，氮磷比下降幅度小，甚至個別組還出現高于初始氮磷比的現象；但是到了第6～7天，此時各組細胞均已接近最高細胞數，但培養液中的氮磷比均開始逐漸下降，直至實驗結束時，各組氮磷比均在10以下，N/P為4、8和16組甚至接近0。而在N/P=80條件下，由于磷限制問題，藻類對氮的吸收有限，導致氮磷比未有明顯下降，反而有所升高。

同時從閩東監測中心提供的2012年三沙灣米氏凱倫藻赤潮發生海域監測的營養鹽數據來看，當三沙灣海域米氏凱倫藻密度超過赤潮基準濃度(103個/mL)形成赤潮時，發生海域的氮磷比值較低，變化范圍為0.14～33.86，絕大部分監測點氮磷比比值在16以下。

3 討論

氮和磷是浮游植物生長所需的必要元素，營養鹽結構的改變將會導致浮游植物群落組成的改變以及赤潮的頻發[5-6]。但是不同的藻類對于營養鹽的需求不同，因此每一種浮游藻類的最適氮磷比也有不同。本次實驗結果表明除了N/P=4外，米氏凱倫藻在其它氮磷濃度比條件下均生長良好，與對照組相比存在極顯著差異。在中低氮磷比(N/P為4、8、16)條件下，米氏凱倫藻能夠較快進入對數期，并且達到最高細胞數，但之后細胞數隨即下降，提前進入衰亡期；通過檢測培養液中氮和磷的濃度可知，在中低氮濃度組的對數期，米氏凱倫藻消耗了大量的氮，氮的吸收率均接近100%，而磷濃度的消耗主要在停滯期，進入對數期后磷濃度則變化不大。可見，在中低氮磷比條件下，米氏凱倫藻前期迅速耗盡了營養鹽，較早地進入對數期并且達到最高細胞數，但是對數期后較低含量的氮濃度無法繼續支持細胞的繼續生長和繁殖，所以藻細胞數迅速下降，提前進入衰亡期。而在高氮磷比(N/P為32、80)條件下，米氏凱倫藻推遲進入對數期，可能是由于前期過高的氮濃度單鹽毒害，抑制了藻細胞的分裂，而經過數天的抑制期，氮濃度相對降低后，藻類才得以進入對數期[7]；但在該條件下，藻類達到最高細胞數后并沒有直接進入衰亡期，而是進入平穩期，維持著較高的細胞密度。通過檢測培養液中氮和磷的濃度可知，在高氮磷比條件下，米氏凱倫藻在對數生長期主要消耗的是磷，而對于氮的消耗遠低于中低氮磷比組。相關研究表明米氏凱倫藻對氮的需求高，不僅在對數生長期對氮的吸收利用較高，在培養后期仍然會持續利用[8]。本次實驗結果也顯示，米氏凱倫藻在氮磷比值較低的情況下，雖然前期消耗大量的氮濃度以快速進入對數期，但卻由于后期氮含量耗盡提前進入衰亡期；在高氮磷比值條件下，雖然前期磷被大量消耗，但中后期氮含量仍然較高，藻類能夠維持較長時間的高密度狀態，可見米氏凱倫藻對于氮的需求高于磷，適當的高氮環境更適合米氏凱倫藻生長。

Klausmeier等利用模型得出浮游植物的最適氮磷比是根據生態條件的變化而變化，變化范圍在8.2～45.0之間，還指出Redfield系數(N/P=16)并非普遍的生化最適氮磷比，而是代表了平均水平[9]；曹春暉等[7]的研究結果表明米氏凱倫藻在氮磷比為15∶1到276∶1之間均可達到最高細胞密度和相對生長率；孫軍等[10]指出米氏凱倫藻在氮磷比為80的條件下比生長率最大；斯丹等[11]的研究結果認為米氏凱倫藻的最適氮磷比為50；而馬龍等[12]認為較高或較低的N/P均不適合米氏凱倫藻生長，該藻的最適氮磷比應該為24.4。本次實驗結果可知，米氏凱倫藻在氮磷比為8到32之間，其最高細胞數和最大比生長率隨著氮磷比的增加而增加，當氮磷比為80時，雖然最高細胞數高于其他組，但是最大比生長率僅為0.20 d-1；過高或過低的氮磷比均不適合米氏凱倫藻的生長，其最適氮磷比為32，與馬龍等[12]實驗結果較為接近。Redfield定律認為，如果氮磷比高于16∶1，則考慮磷為限制因素，而當氮磷比小于10∶1時，則認為氮為限制因素；當氮磷比比值在10～20之間時，限制性因素則變得不確定[13]。綜合本次實驗結果和其他研究成果可見，米氏凱倫藻最適氮磷比均高于16∶1，更適合生長于磷限制潛在的生態環境中。

同時，將本次實驗結果與2012年三沙灣米氏凱倫藻赤潮現場數據相比較發現，現場氮磷比比值均較低，最小值僅為0.14。龍華等[14]在2003年連江米氏凱倫藻赤潮現場監測的氮磷比比值也偏低，多數小于16，最低值僅為0.4，認為低氮磷比是米氏凱倫藻赤潮形成的重要原因，與2012年三沙灣現場調查結果接近。但現場調查往往是在赤潮發生、海水開始變色后才開展的，此時米氏凱倫藻的密度均在103個/mL以上，已逐漸接近最高密度，而根據實驗室結果發現，當藻類細胞數接近最高密度時，培養液中的氮磷比比值已經開始下降，至赤潮結束時，氮磷比比值已大幅下降，有的甚至接近于0。因此本文認為，造成實驗室米氏凱倫藻生長最適氮磷比與赤潮暴發現場氮磷比的差異巨大的原因在于，赤潮現場測定的氮磷濃度是在米氏凱倫藻大量吸收利用營養鹽后測定的，周圍環境中的硝酸鹽含量的消耗大于磷酸鹽，從而導致了氮磷比下降。該現象在姚煒民等[15]在浙江米氏凱倫藻赤潮海域的連續監測結果中也有出現：在赤潮未發生時，N/P比值為24.2，赤潮維持期間N/P比值為12.5，赤潮消亡期間N/P比值為12.8，赤潮期間氮磷比顯著低于初始氮磷比。綜上所述，低氮磷比并非是米氏凱倫藻形成的重要原因，而是赤潮發生期間，米氏凱倫藻消耗了大量的營養鹽，氮含量大幅下降造成的結果。

4 結論

1)分離自福建沿海的米氏凱倫藻在氮磷比比值為4～80之間均能生長，氮磷比對米氏凱倫藻的生長有顯著影響，過高或過低的氮磷比均不適合米氏凱倫藻生長，其最適生長氮磷比比值為32。在該條件下，米氏凱倫藻的最高細胞數為2.68×103個/mL，最大比生長率為0.33 d-1。

2)米氏凱倫藻對氮的需求高于磷，整個生長周期都會持續利用吸收氮，在適當的磷限制環境中，米氏凱倫藻能夠維持較長的生長周期。

3)與現場測定的營養鹽數據相比較，發現低氮磷比并不是米氏凱倫藻赤潮形成的原因，而是赤潮發生期間，米氏凱倫藻消耗大量營養鹽，氮含量大幅下降的結果。

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The effects of nitrogrn to phosphorus ratio on the growth ofKareniamikimotoiseparated from Fujian coastal area

PAN Feifei，WU Nan

(Monitoring Center of Marine Environment and Fishery Resources，Fuzhou 350003，China )

The growth character ofKareniamikimotoiwas studied in culture medium at different ambient ratios of N/P(4∶1，8∶1，16∶1，32∶1，80∶1).The results showed that N/P ratio significantly affected the growth ofKareniamikimotoi.Too high or too low N/P ratio was not suitable forKareniamikimotoigrowth.The algae grew fastest under 32 N/P ratios，and the maximum specific growth rate was 0.33 d-1.Kareniamikimotoidemanded more nitrogen than phosphorus for growth，and it could maintain a longer growth cycle in the appropriate phosphorus limited environment.The main reason ofKareniamikimotoired tides was not the low N/P ratio in the environment，but was a large number of nutrient consumption，especially nitrogen.

N/P ratio；red tide；Kareniamikimotoi

2017-05-12

福建省海洋與漁業結構調整專項資金(閩財指〔2016〕841號文).

潘非斐(1987-)，女，工程師，碩士，研究方向：海洋環境.Tel：18695602045.E-mail： 782494772@qq.com

P735

A

1006-5601(2017)04-0287-08

潘非斐， 吳 楠.不同氮磷比對福建沿海米氏凱倫藻生長的影響[J].漁業研究，2017，39(4)：287-294.