BAG3蛋白ser187位點(diǎn)磷酸化與膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性研究*

韓福新,胡世頡，閆志強(qiáng)，胡學(xué)安，李 亮，趙東升，董必鋒，費(fèi) 舟，李 兵

第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院神經(jīng)外科(西安710032)

·基礎(chǔ)研究·

BAG3蛋白ser187位點(diǎn)磷酸化與膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性研究*

韓福新,胡世頡，閆志強(qiáng)，胡學(xué)安，李 亮，趙東升，董必鋒，費(fèi) 舟△，李 兵

第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院神經(jīng)外科(西安710032)

目的：觀察BAG3蛋白在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)，及其ser187位點(diǎn)磷酸化與膠質(zhì)瘤間的相關(guān)性。方法：收集膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本，進(jìn)行分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，觀察BAG3蛋白在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)情況及BAG3蛋白ser187位點(diǎn)磷酸化對細(xì)胞侵襲的影響。結(jié)果：①IHC：BAG3在IV級膠質(zhì)瘤組織表達(dá)顯著高于正常腦組織及Ⅰ、Ⅱ級膠質(zhì)瘤組織(P<0.05)。②Western Blot：BAG3蛋白在II、III、IV級別膠質(zhì)瘤表達(dá)量，顯著高于正常腦組織(P<0.05)，且相對于II級膠質(zhì)瘤，在III、IV級膠質(zhì)瘤中表達(dá)顯著增高(P<0.05)，而在III級、IV級膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)量之間無顯著性差異(P>0.05)。③三維Matrigel transwell轉(zhuǎn)移小室實(shí)驗(yàn)，S187A-BAG3蛋白過表達(dá)U87細(xì)胞侵襲Matrigel模擬基質(zhì)膜的細(xì)胞數(shù)顯著高于U87細(xì)胞和S187D-BAG3過表達(dá)U87細(xì)胞。結(jié)論：BAG3蛋白膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)量高，且在IV級膠質(zhì)瘤組織中，BAG3蛋白的表達(dá)明顯高于I、II級及正常腦組織，且S187位點(diǎn)磷酸化能抑制U87細(xì)胞的侵襲。

本研究收集了膠質(zhì)瘤組織98例，采用免疫組織化學(xué)、蛋白印跡、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)及三維Matrigel transwell轉(zhuǎn)移小室實(shí)驗(yàn)觀察BAG3蛋白在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)情況及BAG3蛋白ser187位點(diǎn)磷酸化對細(xì)胞侵襲的影響，現(xiàn)報(bào)告如下。

資料與方法

1 一般資料 收集2014年12月至2016年12月膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本94例，按WHO2000年分級分類標(biāo)準(zhǔn)，其中I級膠質(zhì)瘤16例，II級29例，III級328例；IV級25例。取腦外傷或良性病變手術(shù)病人未受損正常腦組織56例為正常對照。分別以4 μm厚度連續(xù)切片用以免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)，及5 mm×5 mm×5 mm大小于-80 ℃冰箱或液氮罐中保存，以備蛋白印跡實(shí)驗(yàn)使用。購置U87細(xì)胞系(賽齊上海生物工程有限公司)傳代，用以質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，及細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 免疫組織化學(xué)：Anti-Bag3兔抗人多克隆抗體購自Santa Cruz公司，工作濃度為1∶100。DAB顯色試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司。

2.2 蛋白印跡Western Blot: Anti-Bag3兔抗人抗體1∶100，Anti-GAPDH鼠抗人抗體1∶400；二抗：按照1∶2500比例用TBST稀釋辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記鼠抗兔IgG。

2.3 蛋白條帶分析：將顯影獲得的結(jié)果，在Quantity One 軟件(Bio-Rad)下進(jìn)行分析，將各觀察蛋白條帶的光密度值除以對照組蛋白的光密度值，獲得其相對值。再將觀察蛋白的相對值除以GAPDH相對值，即觀察蛋白的相對表達(dá)量。

2.4 建立BAG3及BAG3各突變型穩(wěn)定過表達(dá)U87細(xì)胞系，及BAG3過表達(dá)U87細(xì)胞(WT-BAG3)、阻礙磷酸化BAG3過表達(dá)U87細(xì)胞(S187A-BAG3)、擬磷酸化BAG3過表達(dá)U87細(xì)胞(S187D-BAG3)真核表達(dá)載體。按照說明書進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染試劑盒為Invitrogen公司的Lipofectamine 2000TM Reagent。分析s187位點(diǎn)磷酸化的BAG3蛋白對細(xì)胞侵襲的影響。

3 結(jié)果判定 BAG3表達(dá)(-)：為細(xì)胞核藍(lán)染，胞漿不染色。BAG3表達(dá)(+)：細(xì)胞核藍(lán)染，胞漿染成棕紅色。計(jì)數(shù)5個(gè)高倍鏡(×400)的BAG3蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)，及膠質(zhì)瘤細(xì)胞總數(shù)。BAG3蛋白表達(dá)情況：(-)(<5%陽性細(xì)胞)，(+)(5%<陽性細(xì)胞<40%)，()(>40%陽性細(xì)胞)。

結(jié) 果

1 IHC實(shí)驗(yàn)結(jié)果 在正常腦組織中BAG3蛋白陽性率為9.4%，在Ⅰ、Ⅱ級膠質(zhì)瘤組織中為39.2%，在 IV級膠質(zhì)瘤組織中為81.6%，BAG3在IV級膠質(zhì)瘤組織表達(dá)顯著高于正常腦組織及Ⅰ、Ⅱ級膠質(zhì)瘤組織(P<0.05)。

2 Western blot結(jié)果 BAG3蛋白在II、III、IV級別膠質(zhì)瘤表達(dá)量顯著高于正常腦組織(P<0.05)，且相對于II級膠質(zhì)瘤，在III、IV級膠質(zhì)瘤中表達(dá)顯著增高(P<0.05)，而在III級、IV級膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)量之間無顯著性差異(P>0.05)。

3 BAG3蛋白Serl87磷酸化抑制了腫瘤細(xì)胞的增殖 三維Matrigel transwell轉(zhuǎn)移小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果，S1 87A．BAG3穩(wěn)定過表達(dá)U87細(xì)胞的侵襲能力顯著提高，通過DAPI染料對細(xì)胞核染色后，熒光顯微鏡觀察結(jié)果示大量細(xì)胞穿過小室膜，對三維Matrigel transwell轉(zhuǎn)移小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行定量分析，結(jié)果提示S187A．BAG3蛋白過表達(dá)U87細(xì)胞侵襲通過Matrigel模擬基質(zhì)膜的細(xì)胞數(shù)顯著高于U87細(xì)胞和S187D-BAG3過表達(dá)U87細(xì)胞。

討 論

有研究顯示，BAG3蛋白通過結(jié)合熱休克蛋白(HSP70)，從抑制泛素化蛋白酶的降解途徑，進(jìn)而損害NF-αB信號通路，促進(jìn)TNF介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡發(fā)生[1]。在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，BAG3蛋白能促進(jìn)了HSP70與BAX的結(jié)合[2-3]，阻止BAX向線粒體的運(yùn)送，促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的存活。越來越多研究結(jié)果顯示，上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)在惡性腫瘤的發(fā)展過程中起了重要的作用[4]。BAG3磷酸化的具體激酶及具體作用靶點(diǎn)及其功能尚未完全清楚，有報(bào)道指出BAG3蛋白Setl87位點(diǎn)磷酸化修飾參與了EMT過程的調(diào)節(jié)[5]，促進(jìn)了細(xì)胞EMT表型轉(zhuǎn)換，并提高了甲狀腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

IHC及Westen Blot結(jié)果均顯示在I、II、III、IV級人腦膠質(zhì)瘤組織中，BAG3蛋白表達(dá)均有表達(dá)，特別是IV級膠質(zhì)瘤組織中，BAG3蛋白的表達(dá)明顯高于I、II級及正常腦組織。這說明BAG3蛋白可能參與了膠質(zhì)瘤的形成。結(jié)果提示：S187位點(diǎn)磷酸化與非磷酸化BAG3蛋白有著相反的作用，S187位點(diǎn)磷酸化能抑制U87細(xì)胞的侵襲，也說明抑制了BAG3蛋白的表達(dá)，能抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲。

總之，本文結(jié)果表明BAG3蛋白可能參與了膠質(zhì)瘤的形成，且S187位點(diǎn)磷酸化能抑制U87細(xì)胞的侵襲，但今后仍需對S187位點(diǎn)磷酸化抑制U87細(xì)胞的機(jī)制進(jìn)行深入研究。

[1] 劉寶琴,宗志紅,李 超,等.蛋白酶體抑制劑對肝癌HepG2細(xì)胞BAG3表達(dá)影響及其機(jī)制探討[J]. 中華腫瘤防治雜志,2014,18:1395-1399.

[2] 朱華淵,伏 媛,吳 微,等. BAG3在急性髓系白血病中的表達(dá)及臨床價(jià)值[J]. 中國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志,2015,4:925-929.

[3] 李繼強(qiáng),楊吉安,邵靈敏,等. 穩(wěn)定低表達(dá)BAG3的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U87細(xì)胞株的構(gòu)建及鑒定[J]. 中國臨床神經(jīng)外科雜志,2015,6:353-356.

[4] 陳浩月,劉 澎,孫 淼,等. Bag3基因在慢性淋巴細(xì)胞白血病的表達(dá)及其與預(yù)后關(guān)系的研究[J]. 中國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志,2010,4:838-842.

[5] 崔 凱,王武平,孫 盈,等.非小細(xì)胞肺癌中Twist通過TGF-β/Smad3信號通路促進(jìn)EMT的發(fā)生[J].陜西醫(yī)學(xué)雜志,2016,45(11):1462-1465.

(收稿：2017-03-22)

The association between Ser187 BAG3 protein phosphorylationand occurrence and development of glioma

Han Fuxin，Hu Shijie，Yan Zhiqiang，et al.

Department of Neurosurgery，Xijing Hospital，F(xiàn)ourth Military Medical University(Xi’an 710032)

Objective: to observe the BAG3 protein expression in glioma，and its ser187 phosphorylation associated with glioma. Methods:Collected 94 glioma tissue and 56 normal brain tissue，use molecular biological technique，observe the expression of BAG3 protein in the gliomas tissue and effects of the BAG3 protein ser187 phosphorylation on cell invasion. Results:① The expression level of BAG3 in IV glioma group is significantly higher than normal brain tissue and Ⅰ,Ⅱ grade glioma tissues(P<0.05). ②Western Blot results: the expression level of BAG3 protein in II，III，IV glioma ,which was significantly higher than that of normal brain tissue (P<0.05),the level of expression in and grade III or IV glioma ,which was significantly higher than that of grade II (P<0.05)，expressed in level III and IV grade has no significant differences (P>0.05). ③The 3-d Matrigel transwell transfer chamber experiment results，the results hint S187A - BAG3 protein overexpression of U87 cell invasion on Matrigel simulation matrix membrane of cells was significantly higher than that of U87 cells and S187D - BAG3 express U87 cells.Conclusion:The level of BAG3 protein expression in IV glioma tissues，which is significantly higher than I，II and normal brain tissue，and S187 phosphorylation sites can inhibit U87 cells invasion.

Glioma @BAG3 protein @Ser187 phosphorylation sites

*陜西省社會(huì)發(fā)展科技攻關(guān)項(xiàng)目(2015SF030)

神經(jīng)膠質(zhì)瘤 @BAG3蛋白 @ser187位點(diǎn)磷酸化

R739.41

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.08.001

△通訊作者