MSP58沉默對肺癌細胞A549細胞生物學行為的影響*

張樹天，崔 凱，徐春盛，鐘代星△

1．第四軍醫大學學員一旅四營十四連(西安710032)，2．第四軍醫大學唐都醫院胸腔外科(西安710038)3．解放軍第537醫院(寶雞721006)

MSP58沉默對肺癌細胞A549細胞生物學行為的影響*

張樹天1，崔 凱2，徐春盛3，鐘代星2△

1．第四軍醫大學學員一旅四營十四連(西安710032)，2．第四軍醫大學唐都醫院胸腔外科(西安710038)3．解放軍第537醫院(寶雞721006)

目的：探討沉默MSP58基因對肺癌細胞A549增值，細胞周期和侵襲能力的影響。方法：化學合成針對MSP58基因的siRNA，轉染肺癌細胞A549，RT-PCR和Western-blot檢測MSP58基因的mRNA和蛋白水平，利用MTT法繪制細胞生長曲線，流式細胞儀分析細胞周期，Transwell小室實驗觀察侵襲能力。結果：針對MSP58基因的siRNA轉染A549細胞48h后，與陰性對照組和空白對照組相比，siRNA組顯著降低MSP58的基因表達和蛋白表達，細胞的增值受到抑制，并隨著時間延長抑制明顯，細胞發生G1期阻滯，細胞的侵襲力下降。結論：利用特異性siRNA沉默MSP58基因的表達，可以顯著抑制肺癌A549細胞增值和侵襲能力，MSP58有可能成為肺癌治療的新靶點。

肺癌在中國是發病率最高的腫瘤之一[1]。盡管肺癌的靶向治療及其他治療取得了一定的進展，但肺癌的預后仍然很差，5年生存率只有16%左右[2]。MSP58(58-kDa microspherule protein)在細胞核及核仁中具有轉錄調節功能，與多種細胞周期相關的轉錄因子可發生相互作用，比如：轉錄因子Daxx，STRA13，Nrf1和RNA結合蛋白FMR[3-6]。前期試驗證實，MSP58在結直腸癌、肝癌、膠質瘤和胃癌中的表達明顯增加，并且與患者的預后有明顯的相關。本研究針對MSP58合成特異性siRNA，沉默該基因在肺癌細胞系A549中的表達，探討MSP58基因對肺癌細胞A549惡性表型的影響并探討其相關機制。

材料與方法

1 細胞及試劑 細胞系A549從中科院上海細胞研究所購買； RPMI-1640細胞培養；胎牛血清(杭州四季青生物工程公司)；Total RNA 提取劑Trizol，逆轉錄試劑盒 ( TaKaRa 公司)；Transwell 小室( Corning 公司)；MSP58一抗(Abnova，抗鼠，1∶500)β-actin(武漢博士德公司抗兔 1∶1000)；lipofectamine 2000(Invitrogen公司)；MTT(北京鼎國生物公司)。

2 化學合成siRNA片段 siRNA-MSP58序列：正義鏈:5`- CAGCUCAUCAUCGAACUUCdTdT-3`，反義鏈: 5`-GAAGUUCGAUGAUGAGCUGdTdT-3`。 siRNA-negative control 序列：正義鏈：5`-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3`，反義鏈：5`-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3`。siRNA 序列由上海吉瑪制藥技術有限公司合成。

3 細胞培養、轉染及分組 細胞系A549用RPMI-1640(含10%胎牛血清)常規培養。細胞于轉染前換液并鋪板，轉染方法按Lipofectamine 2000說明書完成。細胞轉染6 h后，換含10%胎牛血清的培養液繼續培養48 h。細胞分組：實驗組為轉染針對MSP58基因的特異性siRNA，陰性對照組轉染siRNA-陰性對照組，空白對照組為正常培養的A549細胞。

4 利用RT-PCR反應檢測各組細胞中MSP58 mRNA的表達量 轉染48 h后根據Trizol試劑盒說明書提取各組細胞的總RNA。RT-PCR反應根據Takara反轉錄PCR試劑盒說明書完成，上游引物： 5' -ACGCCCTGCTCTACGAT -3'，下游引物：5' -TCATGCCTGTGATGCTGTC -3'，產物長度483bp。擴增條件為：95℃預變性 5 min ；94℃ 30 s，退火 58℃30 s，延伸 72℃ 1 min，30 個循環；最后延伸 72℃7 min。反應結束后吸取10 μl產物行1%瓊脂糖凝膠電泳，并觀察目的片段。

5 利用Western-blot實驗檢測各組細胞中MSP58蛋白的表達量 轉染48 h后采集細胞并進行裂解，提取蛋白，按比例加入上樣緩沖液煮沸7 min，每孔加樣20 μl，常規電泳、轉膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入1∶500MSP58抗體或1∶1000的β-actin抗體，置入4°C冰箱過夜。1∶4000的羊抗小鼠或羊抗兔二抗室溫下孵育1 h，利用化學法發光，膠片顯色后進行結果分析。

6 利用MTT實驗檢測細胞增殖能力 取對數生長期細胞接種于96孔板中(2×103個細胞/孔)，每組細胞設置5個復孔，另設置調零對照組(不加細胞，只加培養基)，細胞貼壁后進行轉染，6 h后換成完全培養基。分別于轉染后24 h，48 h，72 h，96 h，120 h，144 h加入20 μl的MTT( 5 mg /ml) /孔，37℃溫箱孵育4 h后棄去上清，各孔加入150 μL二甲基亞砜，持續振蕩10 min，直至紫色結晶完全溶解，利用酶標儀490 nm波長檢測各孔的光密度值，重復3次，根據檢測結果繪制細胞增殖曲線。

7 利用流式細胞儀檢測細胞周期分布情況 轉染48 h后的收集細胞，用 0.9 ml PBS制成單細胞懸液，緩慢加入純乙醇2.1 ml固定細胞，置入4℃冰箱過夜。離心后棄去乙醇，PBS洗滌細胞2次。100 μl PBS充分懸浮細胞，后加入300 μl碘化丙啶染色液，充分反應15 min。利用流式細胞儀檢測細胞周期分布情況并詳細記錄。

8 利用Transwell實驗檢測細胞侵襲能力 轉染24 h后，收集細胞，用無血清培養基充分重懸細胞，調整其密度至1×105個/ml，在Transwell 小室的上室接種200 μL細胞懸液，下室放置500 μl RPMI-1460完全培養基(含10%胎牛血清)，培養24 h。4%多聚甲醛固定，結晶紫染色15 min。隨機選取膜上5個高倍鏡下視野，讀取穿膜細胞數，計算平均值。

結 果

1 siRNA對A549細胞中MSP58的mRNA和蛋白表達量影響 根據RT-PCR和Western-blot實驗檢測結果顯示，siRNA-MSP58轉染組的MSP58 基因mRNA和蛋白表達量均顯著低于陰性對照組和空白對照組(P<0.05)；而陰性對照組和空白對照組的MSP58基因mRNA與蛋白表達水平比較差異無統計學意義(P>0.05),見圖1。

A：siRNA轉染后實驗組MSP58mRNA含顯著低于對照組(*P<0.01)；B：實驗組MSP58的蛋白表達量顯著低于對照組(*P<0.01)

圖1 siRNA對A549細胞中MSP58mRNA和蛋白表達影響

2 細胞增殖曲線結果 與陰性對照組和空白對照組相比，隨著培養時間的增加，siRNA-MSP58組A549細胞數量明顯少于陰性對照組和空白對照組(P<0.01)，而兩對照組間比較差異無統計學意義(P>0.05),見圖2。

實驗組增殖能力顯著小于空白對照組，*P<0.01；實驗組增殖能力顯著小于陰性對照組，P<0.01

圖2 siRNA- MSP58對A549細胞增殖的影響

3 siRNA-MSP58對肺癌細胞系A549細胞周期分布情況的影響 流式細胞檢測的結果顯示，轉染組G0/G1期細胞比例顯著低于陰性對照組和空白對照組(P<0.01)，而兩對照組間比較差異無統計學意義(P>0.05)，見圖3。

4 siRNA- MSP58對A549細胞侵襲力的影響 Transwell侵襲實驗結果顯示，A549細胞轉染MSP58 siRNA 48 h后，siRNA-MSP58轉染組穿過小室的細胞數量明顯少于陰性對照組和空白對照組(P<0.05)，而兩對照組間比較差異無統計學意義(P>0.05)，見圖4。

轉染siRNA-MSP58后，A549細胞發生G1期阻滯，S期細胞數量顯著小于空白對照組和陰性對照組(***P<0.01)

轉染siRNA-MSP58后，A549細胞侵襲能力顯著弱于空白對照組和陰性對照組(***P<0.01)

討 論

目前研究認為，MSP58是一個癌基因。MSP58可以特異的被癌基因v-jun誘導表達，使纖維母細胞惡變，細胞的增殖能力大幅度加強，并出現非錨定依賴生長的表型[7]。抑癌基因PTEN 通過c-端區域可以抑制MSP58誘導纖維母細胞惡變[8]。同時，MSP58在結直腸癌、肝癌、膠質瘤和胃癌中的表達明顯增加，與腫瘤的淋巴轉移密切相關，MSP58表達量越高，患者的預后越差。本研究證實MSP58基因在肺癌細胞系A549中高表達，提示MSP58基因可能與A549的惡性表型相關，在肺癌中可能是一種癌基因。

RNA干涉(siRNA)作為一個有效的工具，被廣泛應用與基因功能的研究，并有潛在的臨床應用價值，包括腫瘤的治療[9]。本研究化學合成的siRNA-MSP58，可以特異性的抑制A549細胞中MSP58的表達，為進一步研究MSP58的功能提供了研究基礎。實驗證實，轉染MSP58 siRNA后，A549細胞的體外增殖能力明顯下降。研究還發現，MSP58 siRNA能夠有效的降低A549細胞的侵襲能力。這與前期的實驗結果一致。MSP58沉默后，可明顯抑制膠質瘤細胞增殖和侵襲[10]，并降低了膠質瘤細胞在裸鼠體內成瘤能力。在食管癌細胞中，MSP58 siRNA通過調節P21，CDK4 和cyclin D1分子的表達，抑制食管癌細胞在體內和體外的增殖。

多數抑制細胞增殖的因子是通過調節細胞周期而實現的。MSP58的表達依賴于細胞周期，組織分部實驗證實，在外周血的白細胞、胸腺以及睪丸等增殖旺盛的細胞和組織中MSP58的表達含量顯著升高。并且，MSP58與周期相關分子P120，STRA13以及P78可發生相互作用，調節細胞周期的改變，進而影響細胞的增殖。本實驗中，流式細胞術結果顯示：沉默MSP58基因的表達后，細胞周期發生了G0/G1阻滯，部分解釋了MSP58 siRNA抑制A549細胞增殖的原因，其分子機制及體內的功能需進一步實驗研究。

綜上所述，在肺癌細胞A549的增殖和侵襲轉移過程中，MSP58基因可能發揮著重要作用，利用RNA干擾技術能夠特異性地阻斷MSP58的表達，可有效抑制肺癌細胞的增殖和侵襲。

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(收稿：2017-06-10)

RNAi-mediated silencing of MSP58 suppressesproliferation and migration in lung cancer cells A549

Zhang Shutian, Cui Kai， Xu Chunsheng，et al.

14 Company 4 Battalion 1 Brigade, the Fourth Military Medical University(Xi’an 710032)

Objective：To determine the effect of MSP58 knockdown by RNA interference (RNAi) on the proliferation and migration in lung cancer cells A549. Methods：The siRNA targeting MSP58 gene and negative control siRNA were synthesized and transfected to lung cancer cells A549. RT-PCR and Western-blot were applied to observe the expression of mRNA and protein level of MSP58. The cell growth curve was drawn by MTT. Cell cycle was analyzed by flow cytometry. The cell migration ability was detected by Transwell assay. Results: After transfected 48h, comparing to the negative group and blank group, the expression of MSP58 mRNA and protein was down-regulated by siRNA targeting MSP58 gene. The cell proliferation of A549 in siRNA group was suppressed in a time-dependent manner, cell cycle was blocked in G1 phrase, and the ability of migration declined significantly. Conclusion: Specific siRNA targeting MSP58 efficiently inhibits the proliferation and migration in A549 cells，and the MSP58 gene is a promising anti-tumor target of lung cancer.

Lung Neoplasms @MSP58 Cell Biology

*國家自然科學基金資助項目(81402545)

肺腫瘤 @MSP58 細胞生物學

R734.2

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.08.003

△通訊作者