丹參通絡解毒湯對骨髓干細胞移植急性心肌梗死模型大鼠NF- κB介導的炎癥反應影響?

李鑫輝，李雅婧，黃淼鑫，許福麗，肖 青，郭晨鶴

(湖南中醫藥大學中醫學院，長沙 410208)

【實驗研究】

丹參通絡解毒湯對骨髓干細胞移植急性心肌梗死模型大鼠NF- κB介導的炎癥反應影響?

李鑫輝，李雅婧，黃淼鑫，許福麗，肖 青，郭晨鶴

(湖南中醫藥大學中醫學院，長沙 410208)

目的： 探討丹參通絡解毒湯對骨髓干細胞(BMSCs)移植急性心肌梗死(AMI)模型大鼠核因子- κB(NF- κB)介導炎癥反應的影響。方法：80只大鼠按隨機數字表法分為SH組(假手術組)、AMI組(模型組)、BMSCs組(BMSCs移植組)、DSTLJD組(丹參通絡解毒湯組)、 DSTLJD+ BMSCs組(丹參通絡解毒湯+ BMSCs移植)各10只，BMSCs細胞懸液直接注入梗死區邊緣心肌組織，給予中藥或生理鹽水灌胃，4周后采用酶聯免疫吸附法(ELISA)測定各組大鼠血清腫瘤壞死因子- α(TNF- α)、白細胞介素- 6(IL- 6)的含量，免疫組化法觀察心肌核因子- κB(NF- κB)蛋白表達，并用HE染色觀察心肌組織形態病理變化。結果：與AMI組比較，BMSCs組、DSTLJD組、DSTLJD+ BMSCs組大鼠心肌NF- κB蛋白表達明顯降低，且血清炎癥因子TNF- α和IL- 6水平明顯下降，差異有統計學意義，心肌損傷程度明顯改善；DSTLJD+ BMSCs組優于單純BMSCs組、單純DSTLJD組，差異有統計學意義。結論：BMSCs移植聯合丹參通絡解毒湯能夠改善AMI 模型大鼠的心肌損傷，減輕炎癥反應，修復缺血心肌，其機制可能與調節 NF- κB 介導的炎癥反應有關。

丹參通絡解毒湯；急性心肌梗死；核因子- κB；白細胞介素- 6；腫瘤壞死因子- α；炎癥反應

急性心肌梗死(AMI)是心血管疾病致死及致殘的主要原因，且發病率逐年上升。近年來，骨髓間充質干細胞(BMSCs)因其取材方便、體外擴增能力強、可來源于自身等優勢[1]，移植到缺血梗死部位，在心臟微環境的影響下可以分化為心肌細胞、血管內皮細胞等，進而促進心肌組織修復，調節梗死區域心肌細胞的凋亡，改善心臟功能，因而逐漸成為治療AMI的新途徑。同時有研究表明，中藥能改善干細胞移植的微環境，對干細胞的動員、歸巢、增殖和分化有優勢互補、協同增效的作用[2- 3]。本研究的目的在于探討丹參通絡解毒湯聯合BMSCs移植對AMI鼠核因子- κB介導炎癥反應的影響。

1 實驗材料

1.1 動物

4～6周幼齡SD大鼠20只用以提取骨髓間充質干細胞。SD大鼠80只，體質量200～250 g用以造AMI模型；喂養方式為普通飼料,自由飲食，12 h/12 h明暗環境交替，實驗動物購自湖南中醫藥大學實驗動物中心(許可證號SYXK(湘)2013- 0005)。

1.2 藥物和主要試劑

NF- κB免疫組化試劑盒，中杉金橋生物有限公司；TNF- α、IL- 6 酶聯免疫吸附試劑盒，武漢博士德有限公司。丹參通絡解毒湯組成：丹參15 g，當歸15 g，紅花10 g，玄參15 g，檀香10 g，水蛭6 g，黃芪30 g，川芎10 g，黃芩10 g，梔子15 g，黃連6 g等)。浸泡、去渣，水煎濃縮至藥液濃度0.35 g·ml-1(含生藥)，于4 ℃冰箱保存備用，由湖南中醫藥大學第一附屬醫院藥劑科提供。

1.3 主要儀器

動物呼吸機DW- 2000型,上海嘉鵬科技有限公司；顯微攝像系統Motic B5型，麥克奧迪實業集團公司；CO2培養箱Galaxy型，英國New Brunswick公司；多道生理信號采集處理系統RM- 6280型,成都儀器廠制造。

2 方法

2.1 BMSCs的制備和培養

采用全骨髓貼壁法結合密度梯度離心法進行分離培養。拉頸法處死,75%酒精中浸泡10～15 min,收集股骨髓腔中的細胞，加入含有15%胎牛血清的完全培養液中培養，經多次換液和消化后獲得第三代BMSCs。鑒定方法：采用流式細胞儀檢查細胞表面抗原，標準為CD34 陽性率低于5%，且CD90、CD44 陽性率高于95%，即可認為該細胞為高純度的BMSCs[4]。

2.2 造模方法

大鼠用10%水合氯醛按照體質量250 g·ml-1腹腔麻醉后固定，記錄標準II導聯心電圖。氣管切開并連接動物呼吸機，打開胸腔暴露心臟，于左心耳下左冠狀動脈前降支上1/3處穿線，在線兩段各穿一結扎環以阻斷冠脈血流。以心電圖QRS波群增高增寬、ST段抬高、心肌顏色發紺為結扎成功[5- 6]。

2.3 分組及給藥

80只大鼠按隨機數字表法分為SH組(假手術組)、AMI組(AMI模型組)、BMSCs組(BMSCs移植組)、DSTLJD組(丹參通絡解毒湯組)、 DSTLJD+ BMSCs組(丹參通絡解毒湯+ BMSCs 移植組)5組各10只。除假手術組只穿線不結扎外，其余組行AMI術，并在造模成功后30 min，于心肌梗死區邊緣心肌組織的3個位點直接注入共100 μL(含細胞數3×106)的BMSCs細胞懸液，假手術組和AMI組則注入100 μL的PBS緩沖液。術后連續14 d丹參通絡解毒湯組與參通絡解毒湯+ BMSCs 移植組分別灌胃丹參通絡解毒湯10 ml·kg-1·d-1，余各組用等量生理鹽水灌胃。

2.4 心肌組織病理改變的觀察

處死大鼠取出心臟，用冰冷的生理鹽水沖洗后，取缺血處心肌組織置于多聚甲醛中固定后，常規石蠟包埋切片，經HE染色后觀察心肌組織的病理改變。

2.5 血清TNF- α、IL- 6水平檢測

通過腹主動脈采集大鼠全血，離心后取血清用ELISA法測定，嚴格按試劑說明書進行操作。

2.6 心肌NF- κB蛋白表達檢測

大鼠處死后，取心肌梗死區制作成切片，嚴格按照免疫組化試劑說明書操作。在光學顯微鏡下400倍放大拍照，每張切片在近梗死區隨機觀察5個視野，每組共50個視野，用彩色病理圖像分析系統測量平均灰度。

2.7 統計學方法

3 結果

3.1 對心肌組織形態學觀察結果

圖1顯示，HE染色結果顯示，假手術組心肌組織未見明顯的病理形態異常改變；AMI組大鼠心肌組織可以觀察到心肌細胞變性、壞死，肌束排列不整齊，心肌間質有大量炎性細胞浸潤，細胞明顯腫脹，病理學改變較為明顯；BMSCs移植組和DSTLJD組大鼠心肌細胞有炎性細胞浸潤，細胞腫脹輕度，肌束紊亂程度較輕，且腫脹及肌束紊亂程度較AMI組明顯改善；DSTLJD+ BMSCs組肌束排列較整齊，細胞腫脹輕度，炎性細胞浸潤改善，細胞溶解情況減少。

圖1 各組大鼠心肌病理形態比較(HE染色 ×400)注：A.SH組； B.AMI組； C.BMSCs組； D. DSTLJD組； E.DSTLJD+BMSCs組

3.2 丹參通絡解毒湯對大鼠血清TNF- α、IL- 6的影響

表1顯示，與AMI組比較，BMSCs組、DSTLJD組和DSTLJD+ BMSCs組TNF- α、IL- 6水平明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)；BMSCs組與DSTLJD組比較，TNF- α、IL- 6水平比較差異無統計學意義；與BMSCs組和DSTLJD組比較,DSTLJD+ BMSCs組TNF- α、IL- 6水平明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)。研究顯示，丹參通絡解毒湯可以明顯降低TNF- α、IL- 6水平，當聯合BMSCs移植時效果更強。

表1 丹參通絡解毒湯對大鼠血清TNF- α、IL- 6水平的影響

注：與SH組比較：*P<0.05，**P<0.01；與AMI組比較：#P<0.05，##P<0.01；與BMSCs組比較：△P<0.05，△△P<0.01；與DSTLJD組比較：▲P<0.05，▲▲P<0.01

3.3 丹參通絡解毒湯對心肌NF- κB蛋白表達的影響

表2圖2顯示，與AMI組比較，BMSCs組、DSTLJD組和DSTLJD+ BMSCs組大鼠心肌NF- κBp65蛋白表達顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)；BMSCs組與DSTLJD組比較，大鼠心肌NF- κBp65蛋白表達差異無統計學意義；與BMSCs組和DSTLJD組比較, DSTLJD+ BMSCs組大鼠心肌NF- κBp65蛋白表達明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)。研究顯示，丹參通絡解毒湯可以明顯降低大鼠心肌NF- κBp65蛋白表達，當聯合BMSCs移植時效果更強。

表2 丹參通絡解毒湯對心肌NF- κB蛋白表達平均灰度比較(平均灰度

注：與SH組比較：*P<0.05，**P<0.01；與AMI組比較：#P<0.05，##P<0.01；與BMSCs組比較：△P<0.05，△△P<0.01；與DSTLJD組比較：▲P<0.05；▲▲P<0.01

圖2 各組大鼠NF- κBp65蛋白表達的免疫組化染色檢測(SP×400)注：A.SH組； B.AMI組； C.BMSCs組； D.DSTLJD組； E.DSTLJD+BMSCs組

4 討論

心肌梗死后，由于組織缺血缺氧等因素激活自身病理性免疫炎癥調節系統，誘導心肌組織細胞壞死、凋亡等梗死后效應。機體為清除壞死細胞又進一步激活炎癥反應，從而導致心肌組織損傷加重[7- 8]。BMSCs作為一種存在于骨髓組織中具有自我增殖及能分化為心肌組織細胞、血管內皮細胞潛能的多能干細胞。有研究顯示，BMSCs不僅具有獨特的免疫學特性，還能在移植后宿主體內存活并對AMI后病理性免疫反應起到一定的調節作用[9]。然而組織缺血、缺氧損傷發生后會出現相應的炎癥反應及病理變化,造成缺血損傷微環境對BMSCs存活率產生影響。有研究表明，中藥干預BMSCs可為BMSCs移植提供良好的微環境作用，可促進BMSCs的歸巢、定植以及分化，為BMSCs移植提供良好的微環境，從而提高移植后的成活率，對缺血心肌保護作用具有增強促進作用[10]。

NF- κB是介導炎癥因子釋放的關鍵性轉錄因子，正常生理狀況下，其以無活性狀態與抑制性蛋白IκB結合以同源二聚體形式存在，當多種病理因素刺激時，NF- κB與IκB解體而被磷酸化激活，進而調控靶基因轉錄，釋放相關炎癥因子，如IL- 6、TNF- α等[11]。同時TNF- α、IL- 6等物質的釋放不僅能損傷心肌細胞，還可以通過機體反饋作用維持NF- κB的活性，使心肌損傷不斷加重。本實驗結果顯示，干細胞移植和丹參通絡解毒湯都可以明顯抑制AMI炎癥反應，減少心肌NF- κB蛋白表達，降低TNF- α、IL- 6水平，改善心肌病理形態，且兩者保護作用相當；而丹參通絡解毒湯聯合干細胞移植對心肌保護作用最強，兩者具有相互促進作用。因此我們推測丹參通絡解毒湯保護心肌的重要機理之一，可能是處方改善BMSCs移植、增殖、分化的微環境，增加BMSCs歸巢量，通過細胞的旁分泌作用，促使干細胞分泌一些有益細胞因子，降低心肌NF- κB蛋白表達，從而降低血清TNF- α、IL- 6水平，抑制急性心肌梗死后炎癥反應進而保護心肌。

中醫學認為，急性心肌梗死屬于胸痹心痛、真心痛等范疇。人體感受外邪和內邪積聚體內，日久化熱化毒，形成瘀熱壅毒、毒損心營、閉阻心脈引發心肌梗死。丹參通絡解毒湯是在《溫病條辨》清營湯和《時方歌括》丹參飲基礎上，結合葉天士絡病理論及臨床實踐化裁而來。方中丹參活血化瘀、清心止痛，玄參清營養陰、瀉火解毒，二者共為君藥，臣藥有當歸、川芎、紅花、檀香行氣活血、通絡止痛。黃芩、黃連、梔子瀉火解毒，又由于冠心病病程反復發作，邪踞日久，耗氣傷正，方中佐以黃芪益氣扶正，以增加益氣活血功效。加水蛭增強活血通絡作用，借其“蠕動之物可以松透病根”而直入絡分搜剔血絡，全方具有活血通絡、清營解毒、益氣養陰的功效，臨床治療冠心病取得一定的療效[12]。范桄溥[13]采用抑制IκBα及NF- κB激活的心肌梗死模型小鼠，結果顯示IL- 6、TNF- α的生成減少，梗死后炎癥反應及心肌細胞損傷均減輕。李靜等[14]發現，玄參提取物降低炎癥細胞因子 TNF -α、IL- 6的濃度，抑制NF-kB的過量表達，從而對心肌具有明顯保護作用。

綜上所述，炎癥反應在急性心肌梗死發生發展過程中具有重要影響。通過調節AMI后免疫炎癥反應來減輕心肌組織缺血性損傷至關重要，而丹參通絡解毒湯聯合BMSCs移植，可以抑制AMI大鼠炎癥反應，保護缺血心肌，其機制可能是通過調節NF- κB實現的。

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Effects of Danshen Tongluo Jiedu Decoction on NF-kappa B Mediated Inflammatory Response in Bone Marrow Stem Cell Transplantation Rats With Acute Myocardial Infarction

LI Xin- hui， LI Ya- jing， HUANG Miao- xin, XU Fu- li, XIAO Qing, GUO Chen- he

(Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208,China)

Objective: To explore the effect of Danshen Tongluo Jiedu Decoction on the inflammatory reaction mediated by NF- κB in acute myocardial infarction (AMI) rats by Bone marrow stem cell transplantation.Methods:The whole bone marrow adherent method was adopted for BMSCs separation and culture. The AMI model was established by closing the left anterior descending coronary artery of SD rats. SD rats were randomly divided into SH (sham group), AMI group (acute myocardial infarction group), BMSCs (BMSCs transplantation group), DSTLJD group (Danshen Tongluo Jiedu group), DSTLJD + BMSCs group (Danshen Tongluo Jiedu combined with BMSCs transplantation group), 10 in each group. BMSCs cell suspension injected directly into the edge of the myocardial tissue infarction area; Chinese medicine or physiological saline were administered by gavage.4 weeks later, by using enzyme- linked immunosorbent (ELISA) measure each group rats serum TNF -α、IL- 6 content was detected. Using immunohistochemical method to observe the myocardial NF- κB protein expression, and HE staining to observe the myocardial tissue pathological changes. Results: Compared with The AMI group, BMSCs, DSTLJD group, DSTLJD + BMSCs group rats serum level of TNF- α、IL- 6 and myocardial nuclear factor NF- κB protein expression were significantly reduced, the difference has statistically significant,the degree of myocardial injury was significantly improved; DSTLJD + BMSCs group was better than that of pure stem cell transplantation, and simple DSTLJD group, the difference has statistically significant.Conclusion: Bone marrow stem cell transplantation combined with Danshen Tongluo Jiedu Decoction can improve the myocardial injury, reduced the inflammatory reaction, and repair the ischemic myocardium in AMI rats. The mechanisms may be related to regulate the inflammatory reaction mediated by NF- κB.

Danshen Tongluo Jiedu Decoction; Acute myocardial infarction; NF- κB; IL- 6; TNF- α; Inflammatory reaction

湖南省教育廳科學研究重點項目(15A143);湖南省中醫藥科研計劃項目(201559)；國家中醫藥管理局重點學科“中醫各家學說”開放基金項目(2014GJXS02)

李鑫輝(1974-)，男，山西長治人，副教授，醫學博士，碩士研究生導師，從事心血管疾病的臨床與研究。

R285.5

B

1006- 3250(2017)07- 0931- 03

2016- 12- 15