高效液相色譜-內標法測定碘硝酚原料及其注射液中碘硝酚的含量

孫婷婷，田 凱，王洪禮，楊 杰，田春蓮，劉明春，牛生吏*

(1.沈陽農業大學 畜牧獸醫學院，遼寧 沈陽 110866；2.沈陽偉嘉牧業技術有限公司，遼寧 沈陽 110027)

實驗技術

高效液相色譜-內標法測定碘硝酚原料及其注射液中碘硝酚的含量

孫婷婷1，田 凱2，王洪禮2，楊 杰1，田春蓮1，劉明春1，牛生吏1*

(1.沈陽農業大學 畜牧獸醫學院，遼寧 沈陽 110866；2.沈陽偉嘉牧業技術有限公司，遼寧 沈陽 110027)

建立了碘硝酚的高效液相色譜(HPLC)-內標法檢測方法。用甲醇將樣品配制成測試濃度后過濾，經依利特SinoChrom C18(4.6 mm×200 mm，5 μm )色譜分析柱進行色譜分離，流動相為0.02 mol/L磷酸二氫鉀溶液(pH 2.6)-甲醇(30∶70)，流速為1 mL/min，紫外檢測波長為235 nm，柱溫為30 ℃，內標物為硝氯酚，進樣量為20 μL。結果表明，碘硝酚的質量濃度在20～120 mg/L范圍內呈線性關系，相關系數(r)為0.999 6；在3個不同濃度(64、80、96 mg/L)加標水平下，平均回收率為90.4%～98.2%，相對標準偏差(RSD)為0.18%～0.72%；檢出限(LOD，S/N=3)為0.15 mg/L，定量下限(LOQ，S/N=10)為1.5 mg/L。該方法的精密度、穩定性以及重復性良好，且操作簡便，結果準確，可用于碘硝酚原料藥及注射液的含量測定。

碘硝酚；硝氯酚；含量測定；高效液相色譜法；內標法

碘硝酚(Disophenol)又名雙碘硝酚，化學名為2,6-二碘-4-硝基苯酚，為淡黃色粉末或淡黃色結晶性粉末，無臭無味，其熔點為155～159 ℃。碘硝酚首次合成于20世紀初，60年代逐漸發現其可用于驅殺動物體內外的寄生蟲，70年代初改進了合成工藝，并獲得美國食品藥品監督管理局批準可用作獸藥[1-3]。我國在20世紀末開始研究此類藥物[4-7]，1995年由農業部批準沈陽市獸藥廠生產，1996年成功仿制碘硝酚，并獲國家農業部批準為二類新獸藥，收載于《中華人民共和國獸藥典》2015年版一部[8]。碘硝酚能驅殺肝片吸蟲、動物線蟲、羊鼻蠅、牛皮蠅、蜱螨等寄生蟲，具有廣譜、長效、高效等優點，目前在國內已被廣泛用作獸用驅蟲藥[6,9-10]。

現在市場上碘硝酚獸藥僅用于牛羊寄生蟲病的治療，其在豬等其他家畜的寄生蟲病治療上仍有著廣闊應用前景，但由于對碘硝酚體內藥物動力學等的相關研究較少，缺乏藥動學參數等原始數據支撐，從而限制了其進一步應用。為了擴大碘硝酚的應用范圍并為新型獸藥研發提供新的方法，應進行碘硝酚含量的準確快速測定方法研究。目前對碘硝酚的定性定量分析方法主要有氧瓶燃燒法[11]、分光光度法[12]和高效液相色譜法[13-14]。氧瓶燃燒法操作繁瑣，耗時長；分光光度法專屬性不強，不夠準確，兩者均無法滿足快速、準確測定碘硝酚體外含量以及體內藥動學參數的需求；高效液相色譜法具有高效、快速、靈敏度高以及高自動化、色譜柱可反復使用、樣品不被破壞且易回收等優點；此外，大多數實驗室均能滿足高效液相色譜法的需求，故有較好的通用性，是藥物體內外分析的理想方法[15-17]。但采用文獻的色譜條件進行碘硝酚檢測時，存在色譜峰拖尾、分離度較差、重現性不好等問題，且多數分析方法主要集中在外標法。外標法相對簡便，但在實際應用中準確性受到進樣量重復性、標樣準確性，以及儀器穩定性等因素的影響。而內標法結合了峰面積歸一化法和外標法的優點，在加入內標物后，該方法可以消除采用外標法時由于進樣量重復性、儀器穩定性等變化所導致的誤差，定量方法相對準確，尤其適用于分析樣品含量較少的情況。對于藥物的體內分析而言，因樣品含量較少且處理過程較繁瑣，易引入誤差，而在此過程中加入內標物則可以校正誤差。因而，內標法分析的準確度和精密度相對較高，是藥物體內分析較為理想的選擇。本文通過優化色譜條件，建立了碘硝酚的高效液相色譜-內標法檢測方法，該方法靈敏，準確度、分離度和重現性較好，為碘硝酚的體外含量測定及其體內藥動學研究提供了理論基礎和依據。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

依利特P230Ⅱ型高效液相色譜儀，UV230Ⅱ紫外-可見光檢測器；Gene Company Limited DICO17型離心機(基因有限公司)；XW-80A型旋渦混勻器(上海精科實業有限公司)；FA224型電子天平(上海舜宇恒平科學儀器有限公司)；pH計(Mettler Toledo公司)；DK-8D型恒溫水浴鍋(金壇市醫療儀器廠)；KQ2200E型超聲清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)；超純水制備儀(沈陽超純科技有限公司)。

0.22 μm針式濾器、0.45 μm水系濾膜(上海安譜實驗科技股份有限公司)；甲醇(色譜純，國藥集團化學試劑有限公司，含量≥99.8%)；磷酸二氫鉀(天津市大茂化學試劑廠，含量≥99.5%)；磷酸二氫鈉(國藥集團化學試劑有限公司，含量≥99.0%)；冰醋酸(國藥集團化學試劑有限公司，含量≥99.5%)；乙酸鈉(沈陽沈一精細化學品有限公司，含量≥99.0%)；磷酸(沈陽化學試劑廠，含量≥85%)；碘硝酚標準品(實驗室自制，含量98.7%)；碘硝酚原料藥(沈陽偉嘉牧業技術有限公司，批號15112201、15112101、15111801、15112301)；碘硝酚注射液(沈陽偉嘉牧業技術有限公司，批號16080901、16052401、16022901、15082401)；硝氯酚(實驗室自制，純度99.75%)。

1.2 實驗方法

供試品溶液：精密稱定碘硝酚原料藥(粉末)10 mg，加甲醇定容于10 mL容量瓶中，再取800 μL上述溶液加甲醇定容于10 mL容量瓶，即得80 mg/L供試品溶液；精密吸取100 μL碘硝酚注射液，加甲醇定容于10 mL容量瓶中，再取400 μL上述溶液加甲醇定容于10 mL容量瓶，即得80 mg/L供試品溶液。

內標液：精密稱定硝氯酚10 mg，加甲醇定容于10 mL容量瓶中，得1 mg/mL的硝氯酚內標物儲備液。

1.2.2 色譜條件 色譜柱為依利特Sino Chrom C18(5 μm，4.6 mm×200 mm)；流動相為甲醇-0.02 mol/L磷酸二氫鉀溶液(70∶30，磷酸二氫鉀溶液pH 2.6)；進樣量為20 μL；流速為1 mL/min；檢測波長為235 nm；柱溫為30 ℃。

2 結果與討論

2.1 檢測波長的選擇

根據高效液相色譜儀的DAD檢測器進行全波長掃描，發現碘硝酚標液在235 nm處有最大吸收響應值，因此，本實驗選擇檢測波長為235 nm。

2.2 流動相的選擇

先后采用甲醇-水[14]、甲醇-5.4%冰醋酸水溶液(pH 2.3)[13]、甲醇-0.2 mol/L磷酸二氫鈉溶液(pH 5.0)、甲醇-0.15 mol/L乙酸鈉溶液(pH 4.3)、甲醇-0.02 mol/L磷酸二氫鉀溶液(pH 2.6)體系進行樣品分析。結果表明，采用甲醇-水為流動相時，無法使目標物獲得可定量分析的色譜峰形，這是由于碘硝酚結構中含有酚羥基，在鄰位兩個碘原子的作用下酸性較強，并在弱堿及中性環境中較易解離。因此在該條件下，碘硝酚不成峰形。

采用甲醇-5.4%冰醋酸水溶液為流動相時，碘硝酚的色譜峰出現拖尾；碘硝酚因呈酸性而易解離，可通過降低流動相的pH值，使其更加穩定。H+的增加可以有效抑制藥物的電離，減少其與色譜柱中游離硅羥基的作用，防止色譜峰拖尾，從而提高檢測的準確性和精密度。但在該酸性體系中，流動相經混合后形成的有機溶液中H+濃度的波動性較大，使pH值不能穩定維持在一定范圍內，從而不能有效抑制碘硝酚的電離，故峰形易出現拖尾。

企業內部控制管理是以專業管理制度為基礎，以風險防范和有效監督管理為目的，通過打造完善的過程性管控體系、流暢的管控流程來為企業經營發展保駕護航的一種規范性行為。有效的內部控制管理對實現企業的統籌性經營發展意義重大，在有效的內部控制管理約束下能夠引導各部門員工更好的落實自己的職責，確保企業財務管理信息的真實有效，將企業發展運營過程中可能遇到的財務風險控制在合理范圍內。

采用甲醇-0.2 mol/L磷酸二氫鈉溶液(pH 5.0)、甲醇-0.15 mol/L乙酸鈉溶液(pH 4.3)為流動相時碘硝酚的色譜峰均出現前延現象，且后者較易出現基線漂移；主要原因是被分析物和鍵合相硅醇基之間的離子干擾。由于一般碘硝酚溶液的pH值為4.0左右，該緩沖鹽體系pH值高于藥物，因此不能保證碘硝酚在溶液中以原型形式存在。

圖1 甲醇-0.02mol/L磷酸二氫鉀流動相條件下碘硝酚和硝氯酚的色譜圖Fig.1 Chromatogram of disophenol and nitroclofene with methanol-0.02 mol/L potassium dihydrogen phosphate mobile phase a.disophenol(碘硝酚),b.nitroclofene(硝氯酚)

而采用甲醇-0.02 mol/L磷酸二氫鉀溶液(pH 2.6)為流動相時碘硝酚與硝氯酚的分離度較好，峰形理想，符合試樣檢測要求(見圖1)。在反相色譜條件下可離解的化合物可以選擇合適的緩沖液離子強度以及穩定的pH值來保證可離解的官能團處于一種游離形式，從而使色譜峰形得到顯著改善。經綜合分析色譜條件后，最終采用甲醇-0.02 mol/L磷酸二氫鉀溶液(70∶30，pH 2.6)為流動相。

2.3 色譜柱的選擇

先后采用Dikma C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)和依利特Sino Chrom C18(5 μm，4.6 mm×200 mm)色譜柱進行測試，以考察方法的適用性，結果表明兩者的柱效、分離度均良好。綜合考慮色譜柱的洗脫體積、保留時間等因素，最終選用依利特Sino Chrom C18(5 μm，4.6 mm×200 mm)色譜柱進行后續考察。

2.4 內標物的選擇

先后采用苯甲酸和硝氯酚作為內標物，在“1.2.2”色譜條件下進樣分析。結果表明，苯甲酸色譜峰出現前延現象，且色譜峰保留時間較短(為3.8 min)。使用該內標物測定碘硝酚在體內的血藥濃度變化時，將不利于其與血漿中較大極性的基質進行分離，從而造成色譜峰相互干擾影響測定結果；而硝氯酚與碘硝酚的物理化學性質以及色譜行為和響應特征基本相似，色譜峰峰形較好，且硝氯酚的保留時間為29.0 min，與碘硝酚色譜峰的保留時間間隔約為20 min，當進行血藥濃度測定時將有利于與血漿中極性較大的基質分離，符合作為內標物的要求。綜上選用硝氯酚作為內標物。

2.5 標準曲線、檢出限與定量下限

分別精密吸取適量碘硝酚標準品儲備液于10 mL容量瓶并分別加入適量內標液，用甲醇定容至刻度，制得內標物濃度為60 mg/L，碘硝酚濃度分別為20、40、60、80、100、120 mg/L的系列標準液。按“1.2.2”色譜條件進行實驗，以碘硝酚濃度為橫坐標(x，mg/L)，碘硝酚與內標物的峰面積比為縱坐標(y)，繪制標準曲線。結果表明，碘硝酚質量濃度在20～120 mg/L范圍內呈線性，其回歸方程為：y=0.011 7x-0.015，r=0.999 6。以3倍信噪比(S/N=3)計算碘硝酚的檢出限為0.15 mg/L，10倍信噪比(S/N=10)計算碘硝酚的定量下限為1.5 mg/L。

圖2 溶劑、碘硝酚、硝氯酚以及實際樣品的色譜圖Fig.2 Chromatograms of solvent,disophenol,nitroclofene and a real sampleA.solvent,B.disophenol and nitroclofene,C.a real sample；a.disophenol,b.nitroclofene,c.impurity

2.6 專屬性與系統適應性試驗

分別精密吸取碘硝酚與硝氯酚的標準品溶液、供試品溶液以及溶劑各20 μL，按“1.2.2”色譜條件進行實驗，測得碘硝酚的保留時間為8.3 min，硝氯酚的保留時間為29.0 min，二者分離度大于1.5，分離效果較好，色譜圖見圖2。

2.7 精密度與準確度

準確稱取同一批號碘硝酚原料藥樣品3份，按“1.2.1”方法制備成80 mg/L的供試品溶液，分別加入約相當于供試品溶液中碘硝酚含量80%、100%、120%的標準品溶液，即分別加入濃度為64、80、96 mg/L的標準品溶液，并分別加入600 μL內標液，制得低、中、高3個濃度的溶液，每個濃度設6個平行，按“1.2.2”色譜條件進行實驗，用內標法計算碘硝酚低、中、高3種濃度的平均回收率分別為96.0%、98.2%、90.4%，相對標準偏差(RSD)分別為0.72%、0.18%、0.18%。結果表明該方法的精密度和準確度良好。

表1 實際樣品的含量測定結果

2.8 穩定性與重復性

準確稱取同一批號碘硝酚原料藥樣品，按“1.2.1”方法制備成供試品溶液，分別在樣品配制后的0、2、4、6、8、12 h按“1.2.2”色譜條件進行測定，用內標法計算得碘硝酚的平均含量為95.61%，RSD為0.34%。結果表明該方法的穩定性良好。

準確稱取同一批號碘硝酚原料藥樣品5份，按“1.2.1”方法制備成供試品溶液，按“1.2.2”色譜條件進行測定，重復6次，用內標法計算得碘硝酚的平均含量為95.65%，RSD為0.27%。結果表明該方法的重復性良好。

2.9 實際樣品的測定

分別取不同批次的待測樣品按“1.2.1”方法制備成供試品溶液(其中分別加入600 μL內標溶液)，按“1.2.2”色譜條件進行實驗，結果見表1。結果表明，與中華人民共和國獸藥典2015年版中的兩種檢測方法(紫外分光光度法、沉淀滴定法)相比[8]，使用本方法測定的實際樣品中碘硝酚含量均明顯降低。原因可能為碘硝酚原料藥中的有關雜質，如對硝基苯酚等與碘硝酚在紫外光譜上有著相似的最大吸收波長，傳統的紫外分光光度法無法進一步區分，故含量測試結果偏高。而高效液相色譜-內標法檢測碘硝酚的含量能排除有關雜質的干擾，分析精度相對較高，結果更加準確。

3 結 論

本文建立了高效液相色譜-內標法檢測碘硝酚的含量，方法簡便快捷，結果更加準確，可為碘硝酚質量標準的建立和優化提供參考依據，同時為碘硝酚的體內藥動學研究提供理論基礎，也將為改變劑型、給藥途徑、應用對象等方面的研究提供思路。

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Determination of Disophenol Content in Bulk Drug and Injection by High Performance Liquid Chromatography with Internal Standard Method

SUN Ting-ting1,TIAN Kai2,WANG Hong-li2,YANG Jie1,TIAN Chun-lian1,LIU Ming-chun1,NIU Sheng-li1*

(1.Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine,Shenyang Agricultural University,Shenyang 110866,China;2.Shenyang Vica Animal Husbandry Technology Limited Company,Shenyang 110027,China )

A simple and rapid method was developed for the determination of disophenol in bulk drug and injection via high performance liquid chromatography(HPLC) with the internal standard method.The sample was prepared with methanol to the test concentration,and filtrated with microfiltration membrane.Separation of analytes was achieved under isocratic elution on a C18column.The mobile phase consisted of a mixture of 0.02 mol/L potassium dihydrogen phosphate(pH 2.6) and methanol(30∶70),and was delivered at a flow rate of 1 mL/min.The UV detection was set at 235 nm,and the column temperature was maintained at 30 ℃.The internal standard was nitroclofene and the injection volume was 20 μL.Under the optimum experimental conditions,the proposed HPLC-internal standard method provided a good linearity in the range of 20-120 mg/L for disophenol with the correlation coefficients(r) of 0.999 6.The average recoveries of disophenol at three spiked concentration levels of 64,80 and 96 mg/L were in the range of 90.4%-98.2%,with relative standard deviations(RSDs) of 0.18%-0.72%.The limits of quantitation(LOQs,S/N=10) and limits of detection(LODs,S/N=3) were 1.5 mg/L and 0.15 mg/L,respectively.With good precision,stability and repeatability,the established method was simple,accurate,rapid and reliable for the determination of disophenol in bulk drug and injection.

disophenol；nitroclofene；determination；high performance liquid chromatography(HPLC)；internal standard method

2017-02-24；

2017-04-23

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.08.016

O657.72；O625.312

A

1004-4957(2017)08-1038-05

*通訊作者：牛生吏，博士，講師，研究方向：新型獸藥研發與創制，Tel：024-88487156，E-mail：niushengli1@163.com