高遷移率族蛋白B1在大鼠急性壞死性胰腺炎中的表達

蘇曉菊 董詩琦 李貌 趙九龍 滿曉華 金晶 李兆申 鄒多武 黃浩杰

·論著·

高遷移率族蛋白B1在大鼠急性壞死性胰腺炎中的表達

蘇曉菊 董詩琦 李貌 趙九龍 滿曉華 金晶 李兆申 鄒多武 黃浩杰

目的 檢測急性壞死性胰腺炎(ANP)大鼠胰腺組織高遷移率族蛋白B1(HMGB1)mRNA表達量，觀察血清HMGB1水平的變化規律。方法 采用腹腔注射20% L-精氨酸250 mg/100 g體重2次、間隔1 h的方法制備ANP大鼠模型，以腹腔注射等容積生理鹽水作為對照組。注射后6、18、24、36、48、72、96 h分批處死大鼠，取血檢測血清淀粉酶及HMGB1水平；取胰腺組織常規行病理學檢查；采用實時PCR方法檢測胰腺組織HMGB1 mRNA表達量，蛋白質印跡法檢測胰腺組織HMGB1蛋白表達。結果 血清淀粉酶水平自造模后6 h開始升高，18 h達峰值[(5 070±603)U/L]，48 h后恢復至正常水平，其中ANP 6、18 h時的淀粉酶活性顯著高于對照組的(1 844±181)U/L(P值均<0.05)。血清HMGB1水平自造模后6 h開始升高，36 h達峰值[(288.5±42.1)μg/L]，以后逐漸下降，ANP組所有時間點的HMGB1水平均顯著高于對照組的(31.6±10.1)μg/L，差異均有統計學意義(P值均<0.05)。ANP各時間點組的胰腺病理評分均顯著高于對照組的0.38±0.52，差異有統計學意義(P值均<0.05)。ANP 6、18、24、36、48、72、96 h組胰腺組織HMGB1 mRNA表達量分別為1.23±0.25、2.60±0.46、3.23±0.34、4.77±0.66、2.88±0.56、2.05±0.20、1.33±0.28，均顯著高于對照組的0.44±0.09，其中ANP 36 h組的表達量顯著高于其他各時間點組(P值均<0.05)；ANP組6、18、36、72 h胰腺組織HMGB1蛋白表達量分別為1.14±0.02、1.15±0.01、1.22±0.01、1.22±0.04，均顯著高于對照組的表達量1，其中ANP 36、72 h組的表達顯著高于其他各時間點組，差異均有統計學意義(P值均<0.05)。結論 HMGB1可能是參與ANP時全身炎癥反應的晚期炎癥因子之一。

胰腺炎，急性壞死性； 糖基化終產物； 高遷移率族蛋白B1； 炎癥； 大鼠

Fund program: Youth Science Foundation, National Natural Science Foundation of China(81300353)

近年研究表明，高遷移率族蛋白B1(high mobility group box-1, HMGB1)是一種在重癥急性胰腺炎(SAP)病程晚期發揮重要作用的促炎遞質，也是SAP治療研究的重要切入點[1]。動物實驗表明，急性壞死性胰腺炎(ANP)小鼠的血清HMGB1水平顯著高于正常小鼠[2]；臨床研究表明，SAP患者血清HMGB1水平顯著升高[3]。采用抗HMGB1抗體能有效緩解ANP的進展[4]。本研究檢測ANP大鼠血清HMGB1水平及胰腺組織HMGB1 mRNA和蛋白的表達，分析其變化規律。

材料與方法

一、實驗動物分組

64只健康雄性SD大鼠，體重200～250 g，5～6周齡，清潔級，購自第二軍醫大學實驗動物中心，動物合格證號為SCXK(滬)2007-0003。在室溫22～28℃、相對濕度40%～70%的動物房內適應性喂養1周。實驗前禁食12 h，不禁水。按完全隨機法將大鼠分為對照組及ANP 6、18、24、36、48、72、96 h組，每組8只。參考Tani等[5]報道，采用腹腔注射20% L-精氨酸(Sigma公司)250 mg/100 g體重2次、間隔1 h的方法制備ANP模型，對照組大鼠腹腔注射等容積生理鹽水。按各時間點處死大鼠，心臟取血，分離血清；取胰腺組織，部分置液氮保存，部分置4%甲醛液固定。

二、方法

1．血清淀粉酶、HMGB1水平檢測：血清淀粉酶采用HITACHI-7150型自動生物化學分析儀測定。HMGB1采用酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測，嚴格按照試劑盒(上海西唐生物技術有限公司)說明書操作。

2．胰腺組織病理學檢查： 取甲醛固定的胰腺組織，常規石蠟包埋、切片、HE染色，由病理科醫師盲法讀片，并參照Rongione等[6]的標準進行病理評分。

3．胰腺組織HMGB1 mRNA表達檢測：用Trizol試劑盒(上海晶美公司)提取胰腺組織總RNA。應用Primer5.0軟件設計引物，并由上海英駿生物技術公司合成。HMGB1引物上游序列為5′-GCTGGCTGTAATGCCTTTGCCC-3′，下游為5′-AGCGCGGAAAATTACAAGAACGCT-3′，擴增片段396 bp；內參β-actin引物上游序列為5′-CCTGTACGCCAACACAGTGC-3′，下游為5′-ATACTCCTGCTTGCTGATCC-3′，擴增片段251 bp。先行逆轉錄反應，再使用SYBR Premix Ex TagTM試劑盒在ABI 7500PCR儀(Applied Biosystems公司)上采用兩步法PCR擴增標準程序進行擴增。通過儀器自帶軟件獲取Ct值，以正常胰腺組織作為對比，采用公式2-△△Ct計算mRNA相對表達量。

4．胰腺組織HMGB1蛋白表達檢測：采用蛋白裂解液提取胰腺組織，應用BCA 蛋白質定量試劑盒(Pierce公司)定量蛋白后常規行蛋白質印跡法檢測HMGB1蛋白的表達，以GAPDH為內參。羊抗人HMGB1單克隆抗體(上海普盛生物公司)工作濃度1∶200，羊抗人抗體(上海康成生物工程有限公司)工作濃度1∶7 500，HRP標記的兔抗羊抗體(長島生物科技有限公司)工作濃度1∶1 000。最后ECL顯色，應用Fluorchem FC2熒光及凝膠成像系統掃描，以目的條帶與內參條帶的比值表示蛋白相對表達量。

三、統計學處理

結 果

一、血清淀粉酶活性及HMGB1水平的變化

血清淀粉酶水平自造模后6 h開始升高，18 h時達峰值，以后逐漸下降，48 h后恢復至正常水平，僅ANP 6、18 h時的淀粉酶活性顯著高于對照組(P值均<0.05，表1)。

血清HMGB1水平自造模后6 h開始升高，36 h達峰值，以后逐漸下降，但ANP組所有時間點的水平均顯著高于對照組，差異均有統計學意義(P值均<0.05，表1)。

組別只數淀粉酶活性(U/L)HMGB1水平(μg/L)對照組81844±18131.6±10.1ANP6h組82912±612a74.7±21.9ab 18h組85070±603a127.1±28.4ab 24h組82829±741171.1±63.2ab 36h組81833±218288.5±42.1a 48h組81701±614135.0±39.1ab 72h組81371±269116.2±37.7ab 96h組81489±25088.3±11.9ab

注：與對照組比較，aP<0.05；與ANP 36 h組比較，bP<0.05

二、大鼠胰腺組織病理改變

對照組胰腺組織結構清晰，未見異常改變。ANP 6 h組胰腺腺泡組織結構無明顯破壞，間質水腫，輕、中度的炎細胞浸潤；18 h時胰腺間質顯著水腫，大量炎細胞浸潤，輕度實質壞死和出血；24 h時胰腺腺泡細胞腫脹，灶性壞死，大量炎癥細胞浸潤，胰腺實質內大量紅細胞滲出；36 h時腺泡結構破壞較多，小葉排列紊亂，大量炎性滲出，壞死區內腺泡結構消失；48 h組腺泡結構嚴重破壞，胰腺周圍脂肪組織明顯充血，大量炎癥細胞浸潤；72 h組胰腺壞死加重，腺泡結構消失，胞核溶解，葉間隙增寬，間質微血管破裂，大量紅細胞溢出，片狀脂肪壞死形成，可見皂化斑；96 h時胰腺組織壞死達到最高程度(圖1)。ANP 6、18、24、36、48、72、96 h組的胰腺組織病理分值分別為(3.38±1.30)、(6.88±0.64)、(9.50±1.77)、(10.25±1.04)、(12.00±1.31)、(12.38±1.06)、(13.50±0.93)分，較對照組的(0.38±0.52)分顯著升高，差異均有統計學意義(P值均<0.05)。

三、胰腺組織HMGB1 mRNA及蛋白表達的變化

ANP 6、18、24、36、48、72、96 h組胰腺組織HMGB1 mRNA的表達量分別為1.23±0.25、2.60±0.46、3.23±0.34、4.77±0.66、2.88±0.56、2.05±0.20、1.33±0.28，ANP各時間點的表達量均顯著高于對照組的0.44±0.09，其中ANP 36 h組又顯著高于其他時間點組(P值均<0.05)。胰腺組織HMGB1 mRNA表達量與血清HMGB1水平變化的趨勢基本一致(圖2)。

ANP 6、18、36、72 h組胰腺組織HMGB1蛋白表達量分別為1.14±0.02、1.15±0.01、1.22±0.01、1.22±0.04，其中36、72 h組顯著高于對照組的表達量1，差異具有統計學意義(P值均<0.05，圖3)。

討 論

1973年Goodwin等[7]首次在牛胸腺中發現HMGB1，它是一種含量豐富的非組蛋白核蛋白。人與嚙齒動物的氨基酸序列同源性達到98%以上，小鼠和大鼠的氨基酸序列同源性更是高達100%，說明HMGB1氨基酸序列具有高度保守性。HMGB1由A、B、C區3個結構域組成，A區和B區是兩個同源的L型功能結構域，也稱為box A和box B，box B是HMGB1誘導細胞因子產生的部分，是HMGB1發揮致炎作用的關鍵結構[8]。

圖1 對照組(1A)及ANP 18(1B)、36(1C)、96 h(1D)組胰腺組織病理變化(HE ×200)

圖2 胰腺組織HMGB1 mRNA表達量與血清HMGB1水平的變化趨勢

圖3 對照組(1)及ANP 6(2～3)、18(4～5)、36(6～7)、72(8～9)h組胰腺組織HMGB1蛋白表達

臨床研究發現，SAP患者的血清HMGB1水平顯著升高，且與病情的嚴重程度顯著相關[1]。動物實驗研究顯示，HMGB1是一種“晚期”促炎遞質，在建模后前幾個小時無明顯變化，至12 h則升高，至48 h仍維持在較高水平[9]。楊智勇等[10]采用胰管逆行灌注人工膽汁的方法制備大鼠ANP模型，結果顯示，ANP組大鼠血清TNF-α和IL-1水平在建模后3～6 h達高峰，12 h即大幅下降，而HMGB1水平在建模后12 h明顯升高，至12～24 h仍維持在較高水平。作為一種晚期炎癥因子，HMGB1很可能對SAP的全身炎癥反應有顯著影響，而且HMGB1在血清中出現時間晚于相應受體RAGE。

本研究結果顯示，ANP大鼠胰腺組織HMGB1mRNA表達量在造模后36 h達峰值，顯著高于其他時間點的表達量，差異均有統計學意義。血清HMGB1水平在造模后6 h開始升高，36 h達峰值，以后逐漸下降，但ANP各時間點的血清HMGB1水平均顯著高于對照組，差異有統計學意義，與楊智勇等[10]的結果一致，提示HMGB1對ANP大鼠晚期炎癥反應和胰腺組織損傷有顯著影響。

[1] Yasuda T, Ueda T, Takeyama Y, et al. Significant increase of serum high-mobility group box chromosomal protein l levels in patients with severe acute pancreatitis[J]. Pancreas, 2006, 33(4):359-363.

[2] Yang ZY, Ling, Y, Yin T, et al. Delayed ethyl pyruvate therapy attenuates experimental severe acute pancreatitis via reduced serum high mobility group box 1 levels in rats[J]. World J Gastroenterol, 2008, 14(28):4546-4550.

[3] Yasuda T, Ueda T, Takeyama Y, et al. Significant increase of serum high-mobility group box chromosomal protein 1 levels in patients with severe acute pancreatitis[J]. Pancreas, 2006, 33(4):359-363.

[4] Sawa H, Ueda T, Takeyama Y, et al. Blockade of high mobility group box-1 protein attenuates experimental severe acute pancreatitis[J]. World J Gastroenterol, 2006, 12(47):7666-7670.

[5] Tani S, Itoh H, Okabayashi Y, et al. New modeI of acute necrotizing pancreatitis induced by excessive doses of arginine in rats[J]. Dig Dis Sci, 1990, 35(3): 367-374.

[6] Rongione AJ, Kusske AM, Ashley SW, et al. Interleukin 10 reduces the severity of acute pancreatitis in rats[J]. Gastroenterology, 1997, 112(3):960-967.

[7] Goodwin GH, Johns EW. Isolation and characterisation of two calf-thymus chromatin non-histone proteins with high contents of acidic and basic amino acids[J]. Eur J Biochem, 1973, 40(1):215-219.

[8] Li J, Kokkola R, Tabibzadeh S, et al. Structural basis for the proinflammatory cytokine activity of high mobility group box 1[J]. Mol Med, 2003, 9(1-2):37-45.

[9] 劉輝,姚詠明,董月青,等.內毒素刺激大鼠腹腔巨噬細胞高遷移率族蛋白Bl釋放的研究[J].中華實驗外科雜志,2005, 22(1):37-38.DOI:10.3760.j.issn.1001-9030.2005.01.014.

[10] 楊智勇,王春友,熊炯圻,等.重癥急性胰腺炎大鼠血清高遷移率族蛋白-1水平的時相變化及意義[J].華中科技大學學報(醫學版),2004,33(4):466-468.DOI:10.3870/j.issn.1672-0741.2004.04.024.

(本文編輯：冀凱宏)

The expression of HMGB in rats with acute necrotizing pancreatitis

Su Xiaoju, Dong Shiqi, Li Mao, Zhao Jiulong, Man Xiaohua, Jin Jing, Li Zhaoshen, Zou Duowu, Huang Haojie.

Department of Gastroenterology, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China

Huang Haojie, Email: peal1920@hotmail.com

Objectives To detect the expression of serum high mobility group box-1(HMGB1) and explore its changes in rats with acute necrotizing pancreatitis (ANP). Methods Intraperitoneal injection of 20%L-arginine in the dosage of 250 mg/100 g twice every 1 hour was used to establish ANP rat model. Intraperitoneal injection of normal saline solution in equal volume was performed in control rats. Rats were sacrificed at 6 h, 18 h, 24 h, 36 h, 48 h, 72 h and 96 h after injection. Blood samples were collected to detect serum amylase and HMGB1 level. Pancreatic tissue was collected for pathological examination. Real-time PCR was applied to detect the mRNA expression of HMGB1 in pancreatic tissue. Werstern blot was used to determine HMGB1 protein expression in pancreatic tissue. Results Serum amylase level began to increase at 6 h after modeling, reached the peak at 18 h [(5 070±603)U/L] and returned to normal level after 48 h. Serum amylase activity at 6 h and 18 h in ANP group was much higher than that in control group (1 844±181)U/L(P<0.05). The expression of HMGB1 began to increase at 6 h, reached to the peak at 36 h[(288.5±42.1)μg/L], and then decreased gradually. HMGB1 expressions at each time point in ANP group were significantly higher than those in control group (31.6±10.1)μg/L], and the differences were statistically significant (allP<0.05). Pathological scores in pancreatic tissues in ANP group were higher than those in control group 0.38±0.52, and the differences were statistically significant (P<0.05). HMGB1 mRNA expressions at t 6 h, 18 h, 24 h, 36 h, 48 h, 72 h and 96 h in ANP group were 1.23±0.25, 2.60±0.46, 3.23±0.34, 4.77±0.66, 2.88±0.56, 2.05±0.20, 1.33±0.28, which were significantly higher than those in control group 0.44±0.09, and the relative expression of HMGB1 in ANP group at 36 h was significantly higher than those at other time points (allP<0.05). HMGB1 protein expression in pancreatic tissue in ANP group at 6 h, 18 h, 36 h, 72 h were 1.14±0.02, 1.15±0.01, 1.22±0.01, 1.22±0.04, which obviously higher than those in control group(1.0), and HMGB1 expression in ANP group at 36 h was higher than those at other time points(allP<0.05). Conclusions HMGB1 may participate in systematic inflammation as one of the late inflammatory mediators during ANP.

Pancreatitis, acute necrotizing; Glycosylation end products; High mobility group box-1; Inflammation; Rat

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2017.04.003

200433 上海，第二軍醫大學長海醫院消化內科

黃浩杰，Email: peal1920@hotmail.com

國家自然基金青年科學基金項目(81300353)

2016-12-13)