靜脈表型分子COUP-TFⅡ表達降低對血管內皮細胞衰老的影響*

賴亞宇， 周 騏， 鄭 微， 靳 鵬， 顧文竹， 武曉靜△

(1第三軍醫大學附屬新橋醫院全軍心血管內科中心，重慶 400037； 2重慶醫科大學第二附屬醫院心內科，重慶 400010)

·論 著·

靜脈表型分子COUP-TFⅡ表達降低對血管內皮細胞衰老的影響*

賴亞宇1， 周 騏2， 鄭 微1， 靳 鵬1， 顧文竹1， 武曉靜1△

(1第三軍醫大學附屬新橋醫院全軍心血管內科中心，重慶 400037；2重慶醫科大學第二附屬醫院心內科，重慶 400010)

目的： 觀察靜脈表型分子雞卵清蛋白上游啟動子轉錄因子Ⅱ(COUP-TFⅡ)表達對血管內皮細胞衰老的影響和分子機制。方法: 通過RT-qPCR檢測比較人冠狀動脈內皮細胞(HCAEC)和人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)中COUP-TFⅡ的表達情況。使用10-5mol/L血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)誘導HUVEC衰老，通過COUP-TFⅡ特異性小干擾RNA(siCOUP-TFⅡ)轉染HUVEC使其COUP-TFⅡ的表達降低，利用β-半乳糖苷酶染色、Western blot、CCK-8、細胞計數等方法分別觀察siCOUP-TFⅡ對AngⅡ誘導的血管內皮細胞衰老及增殖的影響，通過Western blot檢測Akt信號分子的表達變化。結果: 與HCAEC相比，HUVEC中COUP-TFⅡ呈顯著高表達；用siCOUP-TFⅡ抑制HUVEC的COUP-TFⅡ表達時，能顯著促進AngⅡ誘導的內皮細胞衰老并抑制內皮細胞增殖和p-Akt蛋白水平；加入Akt激動劑SC79 (4 mg/L)能夠部分逆轉siCOUP-TFⅡ對AngⅡ誘導的HUVEC衰老和增殖的影響。結論: COUP-TFⅡ表達降低可促進血管內皮細胞衰老并抑制內皮細胞增殖，其機制可能與調節Akt信號有關。

動脈粥樣硬化; 血管內皮細胞； 細胞衰老； 細胞增殖； 雞卵清蛋白上游啟動子轉錄因子Ⅱ

動脈粥樣硬化是造成冠心病和外周血管病的重要原因，是現代社會致死、致殘、嚴重影響人類健康和生活質量的主要因素之一。動脈粥樣硬化好發于動脈，雖然靜脈與動脈同處于一個血管系統中，卻未見靜脈粥樣硬化，這其中有部分血流動力學等因素的影響。目前尚不清楚動、靜脈對粥樣硬化易感性的差異除受血流動力學等環境因素影響外，是否還與二者不同的分子表型有關。

雞卵清蛋白上游啟動子轉錄因子Ⅱ(chicken ovalbumin upstream promoter-transcription factor Ⅱ，COUP-TFⅡ)是一種孤兒受體超家族成員，在胚胎時期對血管和淋巴管的生成起著重要調節作用[1]。研究發現COUP-TFⅡ只在靜脈內皮表達，在胚胎血管形成時，其可通過抑制神經纖毛蛋白(neuropilin， NP)-1和Notch信號分子的表達來維持血管的靜脈特征，而抑制靜脈內皮COUP-TFⅡ表達后，靜脈就會逐漸呈現動脈的特征[2-3]。COUP-TFⅡ特異表達于靜脈內皮，然而目前尚不清楚其是否參與調節了血管粥樣硬化的發生過程。血管內皮細胞衰老是引起動脈粥樣硬化的重要發病機制之一[4]，為進一步研究動、靜脈本身分子表型差異與粥樣硬化發生的關系，本研究觀察了離體培養的人冠狀動脈內皮細胞(human coronary artery endothelial cells，HCAEC)和人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)中COUP-TFⅡ表達的差異，并利用特異性COUP-TFⅡ小干擾RNA(si-COUP-TFⅡ)抑制臍靜脈內皮細胞COUP-TFⅡ表達，觀察其對血管內皮細胞衰老及增殖的影響，試圖從血管表型差異的角度揭示動脈粥樣硬化的發病機制。

材 料 和 方 法

1 材料及試劑

HUVEC和HCAEC購自Promocell；胎牛血清和DMEM培養基購于Gibco；胰酶購于Hyclone；siRNA序列由上海吉瑪公司合成：COUP-TFⅡ siRNA正義鏈序列為5’-GGC CGU AUA UGG CAA UUC ATT-3’,反義鏈序列為5’-UGA AUU GCC AUA UAC GGC CTT-3’；對照 siRNA(control siRNA)正義鏈序列為5’-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3’, 反義鏈序列為5’-ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT-3’。RNA抽提試劑盒(RNAiso Kit)、逆轉錄試劑盒(PrimeScript? RT reagent Kit)和熒光定量PCR試劑盒(SYBR? Premix Ex TaqTM)均購于TaKaRa；所用引物由TaKaRa公司設計；Lipofectamine 2000轉染試劑、Opti-MEI轉染稀釋液購于Invitrogen；血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，AngⅡ)購于Sigma；β-半乳糖苷酶(β-galactosidase，β-Gal)染色試劑盒購于碧云天生物試劑公司；CCK-8試劑盒購于Dojindo；抗COUP-TFⅡ抗體購于Abcam；抗Akt和抗p-Akt抗體購于CST；抗P53抗體購于Bioworld；ECL化學顯影液購于Millipore。

2 主要方法

2.1 細胞培養 在37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下，用含10%胎牛血清的DMEM培養基傳代培養HUVEC和HCAEC。定期換液，細胞融合度達到80%～90%時，用胰酶進行消化后傳代。

2.2 細胞轉染 轉染試劑采用Lipofectamine 2000，按試劑規定操作，大致步驟如下(以6孔板為例)：用250 μL體積Opti-MEI培養基稀釋5 μL siRNA母液(最終干擾濃度為50 nmol/L)，輕輕混勻。使用前輕輕搖勻Lipofectamine 2000，然后取 5 μL Lipofectamine 2000在250 μL Opti-MEI培養基中稀釋，室溫放置5 min。將上述用Opti-MEI培養基稀釋的siRNA和Lipofectamine 2000混合，輕輕混勻，室溫放置20 min。將此混合物加入無血清DMEM中(終體積2 mL)，在37 ℃、5% CO2環境中培養4～6 h后換用新鮮含10%胎牛血清的DMEM培養基繼續培養。

2.3 RT-qPCR檢測細胞COUP-TFⅡ的mRNA表達 用RNAiso Kit提取細胞中總RNA，將1 μg總RNA逆轉錄成cDNA。用COUP-TFⅡ實時熒光定量PCR引物進行熒光定量PCR檢測。COUP-TFⅡ上游引物為5’-AAC ACA TCG AGT GCG TGG TGT-3’，下游引物為5’-TAC TGG CAC TGG TTG CGA TG-3’。采用GAPDH作為內參照，其上游引物為5’-AAC ACA TCG AGT GCG TGG TGT-3’，下游引物為5’-GTA GAG GCA GGG ATG ATG TTC T-3’。采用實時熒光定量PCR儀(StepOne Plus)擴增上述基因，其反應混合物為cDNA 2.0 μL， 2×SYBR? Premix Ex Taq Ⅱ混合物10 μL，上、下游引物各0.8 μL，ROX Reference Dye (50×) 0.4 μL，dH2O 6.0 μL。按95 ℃ 30 s、95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s的條件進行40個循環反應。采用2-ΔΔCt原理進行mRNA表達量計算。

2.4 CCK-8實驗檢測細胞活力 HUVEC培養于96孔板，每孔1×103個細胞，實驗組和對照組每種處理方式接種3～6個復孔，待細胞處于指數生長階段分別轉染COUP-TFⅡ siRNA或control siRNA，4～6 h后換液。轉染24 h后，無血清培養基培養12 h使細胞處于同步化狀態，AngⅡ(10-5mol/L)刺激48 h，加入CCK-8 試劑10 μL，37 ℃孵育4 h，酶標儀(Molecular)檢測450 nm處的吸光度。

2.5 細胞計數 將HUVEC接種于6孔板，每孔1×105個細胞，待細胞處于指數生長階段轉染COUP-TFⅡ siRNA或control siRNA，4～6 h后換液。轉染24 h后，無血清培養基培養12 h使細胞處于同步化狀態，AngⅡ(10-5mol/L)刺激48 h后，在倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況，利用胰酶消化的方法收集細胞，用1 mL細胞培養基重懸細胞，取100 μL細胞懸液加入9.9 mL培養基進行稀釋，利用細胞計數器進行細胞計數，觀察細胞增殖情況。

2.6 Western blot分析 抽提各組細胞的蛋白，定量，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。蛋白在電泳分離結束后，切下目的蛋白所處的條帶區域，置于電轉裝置的海綿上，用PVDF膜覆蓋，放入電轉液中，轉膜80 min。轉膜結束后，將PVDF膜置于培養皿，用TBST洗膜10 min×3次，之后用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。封閉結束后，將稀釋后的 I 抗孵育在PVDF膜上，置于4 ℃過夜。用TBST洗膜10 min×3次， 加入稀釋后的 Ⅱ 抗37 ℃ 孵育1 h。用TBST洗膜10 min×3次，最后將顯影液覆蓋在膜上，在成像系統下進行顯影。

2.7 β-Gal細胞染色 依據β-Gal染色試劑盒說明，吸除培養板里的液體，用PBS洗滌接種在培養板上的細胞1次，每孔用1 mL β-Gal 染色固定液，室溫固定15 min。將染色固定液棄去，加入PBS，進行洗滌(3 min×3次)。清洗后，每個孔加入1 mL按說明配置好的工作液，放入37 ℃孵箱中，在無CO2條件下過夜，并用保鮮膜將6孔板進行密封以防止蒸發。倒置顯微鏡下每組樣本任意挑選3個視野，觀察胞漿被染為藍色的情況，并計算藍色細胞在總細胞數中所占的百分比。

3 統計學處理

采用SPSS 19.0軟件進行統計學分析。計量資料以均數±標準差(mean±SD)表示，組間均數比較采用單因素方差分析或獨立樣本t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 HCAEC和HUVEC COUP-TFⅡ表達的差異

為了評估COUP-TFⅡ在離體動、靜脈內皮細胞的表達情況，我們將HUVEC和HCAEC置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下進行培養，待密度達到70%～80%時，提取其總RNA，逆轉錄，利用實時熒光定量PCR檢測，發現在HCAEC中幾乎測不到COUP-TFⅡ的mRNA表達，但在HUVEC中COUP-TFⅡ mRNA呈顯著高表達，2組之間差異有統計學顯著性(P<0.01)，見圖1。

Figure 1.The mRNA expression of COUP-TFⅡ in HCAEC and HUVEC. Mean±SD.n=6.**P<0.01vsHCAEC.

圖1 RT-qPCR檢測HCAEC和HUVEC中 COUP-TFⅡ mRNA的表達

2 COUP-TFⅡ siRNA 對HUVEC中COUP-TFⅡ mRNA和蛋白水平的影響

將siCOUP-TFⅡ及control siRNA分別轉染至 HUVEC，24 h后抽提其RNA，逆轉錄，經熒光定量PCR檢測，發現轉染24 h后siCOUP-TFⅡ組細胞的COUP-TFⅡ表達量明顯下降，mRNA表達量是對照組的45.63%，與對照組相比較，差異具有統計學顯著性(P<0.05)；轉染48 h后抽提蛋白，經 Western blot檢測發現，siCOUP-TFⅡ組細胞的COUP-TFⅡ蛋白表達水平較對照組明顯下降，蛋白表達量是對照組的43.32%，與對照組相比較，具有顯著差異(P<0.05)，見圖2。

Figure 2.Knockdown of COUP-TFⅡ expression in HUVEC by siRNA transfection. A: the relative mRNA expression of COUP-TFⅡ detected by RT-qPCR; B: the protein expression of COUP-TFⅡ determined by Western blot. Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol group.

圖2 RT-qPCR及Western blot檢測COUP-TFⅡ的表達

3 抑制HUVEC COUP-TFⅡ表達對AngⅡ誘導的血管內皮細胞衰老的影響

將siCOUP-TFⅡ及control siRNA分別轉染至HUVEC，采用AngⅡ(0 mol/L、10-5mol/L)刺激作用48 h后，利用β-Gal化學染色，染色結果顯示，AngⅡ濃度0 mol/L時，衰老相關β-Gal染色陽性率siCOUP-TFⅡ組為6.65%±1.32%，對照組為6.22%±1.92%，兩者之間的差異無統計學顯著性；AngⅡ濃度為10-5mol/L時，衰老相關β-Gal染色陽性率siCOUP-TFⅡ組為81.07%±4.52%，對照組β-Gal染色陽性率(43.90%±6.73%)明顯低于siCOUP-TFⅡ組(P<0.05)，見圖3。利用Western blot 檢測衰老分子標志物P53蛋白的表達情況，結果顯示，AngⅡ濃度為0 mol/L時，siCOUP-TFⅡ組與對照組相比較，P53蛋白表達水平的差異無統計學顯著性；AngⅡ濃度為10-5mol/L時，與對照組相比較，siCOUP-TFⅡ組P53蛋白的表達水平明顯上調(P<0.05)，見圖3。結果表明抑制COUP-TFⅡ對基礎狀態HUVEC衰老無顯著影響，但抑制其表達后能進一步促進AngⅡ誘導的血管內皮細胞衰老。

Figure 3.The senescence of AngⅡ induced-HUVEC after COUP-TFⅡ siRNA transfeetion. A: the β-Gal staining of HUVEC (×200); B: the protein expression of P53 determined by Western blot. Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol group.

圖3 抑制HUVEC的COUP-TFⅡ表達對AngⅡ誘導的內皮細胞衰老的影響

4 抑制HUVEC COUP-TFⅡ表達對AngⅡ誘導的血管內皮細胞增殖的影響

將siCOUP-TFⅡ及control siRNA分別轉染至HUVEC，AngⅡ (0 mol/L、10-5mol/L)刺激作用48 h后，利用CCK-8實驗檢測發現，AngⅡ濃度為0 mol/L時，在450 nm處的相對吸光度siCOUP-TFⅡ組為98.39%±3.15%，對照組為100.00%±2.72%，兩者之間相對吸光度的差異無統計學顯著性；而AngⅡ濃度為10-5mol/L時，在450 nm處的相對吸光度siCOUP-TFⅡ組為57.43%±5.67%，對照組為100.00%±8.08%，siCOUP-TFⅡ組的相對吸光度較對照組明顯降低，兩者之間的差異有統計學顯著性(P<0.05)，見圖4。細胞計數結果顯示，AngⅡ濃度為0 mol/L時，對照組的細胞計數較siCOUP-TFⅡ組比較，兩者之間的差異無統計學顯著性；而AngⅡ濃度為10-5mol/L時，對照組的細胞計數為顯著高于siCOUP-TFⅡ組，兩者之間的差異有統計學顯著性(P<0.05)，見圖4。結果表明抑制COUP-TFⅡ對基礎狀態的HUVEC增殖無明顯影響，但抑制COUP-TFⅡ表達后能抑制AngⅡ誘導的血管內皮細胞增殖。

Figure 4.The proliferation of AngⅡ-induced HUVEC after COUP-TFⅡ siRNA transfection. A: comparison of theAvalues by CCK-8 assay; B: the results of the cell number counting; C: the images of HUVEC under microscope (×100). Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol group.

圖4 抑制HUVEC COUP-TFⅡ表達對AngⅡ誘導內皮細胞增殖的影響

5 COUP-TFⅡ表達對HUVEC細胞衰老增殖的影響與Akt信號的關系

Akt信號是影響細胞衰老和增殖的關鍵信號通路，為了探討COUP-TFⅡ調節AngⅡ誘導的內皮細胞衰老增殖的機制，我們進一步觀察了其與Akt信號的關系。結果發現將siCOUP-TFⅡ及control siRNA分別轉染至HUVEC，在AngⅡ濃度為0 mol/L時，siCOUP-TFⅡ組與對照組相比較， Akt及p-Akt的蛋白水平并無差異。與對照組相比，在AngⅡ濃度為10-5mol/L時siCOUP-TFⅡ組的Akt蛋白水平無顯著差異，但p-Akt的蛋白水平明顯下調(P<0.05)，見圖5。

Figure 5.The protein levels of p-Akt/Akt in the AngⅡ induced-HUVEC after COUP-TFⅡ siRNA transfection determined by Western blot. Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol group.

圖5 Western blot檢測抑制COUP-TFⅡ表達對AngⅡ誘導的HUVEC中p-Akt蛋白水平的影響

為進一步闡明COUP-TFⅡ調節AngⅡ刺激血管內皮衰老和增殖與Akt信號的關系，我們加入Akt激動劑SC79(4 mg/L)，利用β-Gal染色、Western blot實驗檢測P53蛋白及用CCK-8、細胞計數的方法分別觀察HUVEC衰老及增殖情況，結果顯示加入Akt激動劑SC79后，β-Gal染色陽性率明顯較siCOUP-TFⅡ組降低(P<0.05)；Western blot檢測衰老分子標志物P53蛋白表達水平也明顯降低(P<0.05)；此外，與siCOUP-TFⅡ組比較，SC79與siCOUP-TFⅡ合用組在450 nm的相對吸光度及細胞計數值均明顯升高(P<0.05)，見圖6。這提示Akt激動劑SC79能夠部分逆轉siCOUP-TFⅡ對血管內皮細胞衰老和增殖的影響。

討 論

本研究中，我們觀察了靜脈表型分子COUP-TF Ⅱ 對血管內皮細胞衰老增殖的影響及其分子機制。我們發現COUP-TF Ⅱ 在離體HUVEC呈現顯著高表達；在無Ang Ⅱ 誘導的基礎狀態下，抑制COUP-TF Ⅱ 表達后HUVEC的衰老增殖并無顯著變化；而在Ang Ⅱ (10-5mol/L)誘導狀態下，抑制COUP-TF Ⅱ 表達可促進HUVEC衰老并抑制其增殖，其分子機制可能與其調節Akt信號有關。

Figure 6.The effects of Akt activator SC79 on senescence and proliferation of AngⅡ-indued HUVEC after transfection with siCOUP-TFⅡ. A: the protein levels of p-Akt/Akt; B: the β-Gal staining of HUVEC (×200); C: the protein expression of P53 by Western blot; D: theAvalue of CCK-8 assay; E: the cell number counting (×100). Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol；#P<0.05vssiCOUP-TFⅡ.

圖6 Akt激動劑SC79對AngⅡ誘導的低表達COUP-TFⅡ的HUVEC衰老增殖的影響

研究已經發現，在體情況下，COUP-TFⅡ只在靜脈血管內皮中表達，而在動脈血管內皮中不表達[2-3]。然而，COUP-TFⅡ不僅在胚胎發育時決定動靜脈表型，還具有調節代謝功能。已有研究表明，線粒體進行β氧化和糖代謝過程相關的幾種酶都是COUP-TFⅡ的下游靶基因，COUP-TFⅡ可通過抑制或增強它們的轉錄活性從而參與代謝的調節[5]； Weatherford等[6]研究發現，COUP-TFⅡ可以抑制腎素的表達，而腎素在破壞內皮細胞之間的連接、內皮細胞與單核細胞間的相互黏附以及在一些與血小板源性相關生長因子的生成過程中均起著重要作用，而這些都是導致動脈粥樣硬化發生的重要途徑；Okamura等[7]發現COUP-TFⅡ能通過Wnt途徑抑制過氧化物酶體增殖物激活受體γ的基因表達，從而通過影響氧化應激過程，在粥樣硬化啟動、血管壁細胞功能和斑塊的穩定性等過程中發揮重要作用。最近更有研究發現，COUP-TFⅡ表達降低后，可以上調炎癥基因的表達和下調抗血栓形成基因的表達，從而使血管內皮細胞表型表現出促動脈粥樣硬化發生的趨勢[8]。因此，上述研究提示，COUP-TFⅡ不僅對動靜脈表型的分化過程起著關鍵作用，而且還可能對動脈粥樣硬化的發生有著重要的影響。

為進一步研究COUP-TFⅡ與動脈粥樣硬化易感性差異的關系，我們先在離體情況下分別培養了HCAEC和HUVEC，檢測了COUP-TFⅡ在兩者中mRNA的水平，結果發現，COUP-TFⅡ在HUVEC中呈現出明顯的高表達，結果與在體情況下是一致的。血管內皮細胞衰老是內皮功能失調的病理生理機制之一，在許多血管性疾病的啟始過程中起著重要作用。Qin等[9]在前列腺癌研究中發現，COUP-TFⅡ的過表達能夠減弱致癌基因誘導的癌組織衰老，而在PTEN敲除小鼠模型中，COUP-TFⅡ表達的降低可以通過激活TGF-β信號誘導衰老。但是COUP-TFⅡ表達降低后血管內皮細胞的衰老情況還不清楚。以往研究已經發現，衰老相關β-Gal活性和P53蛋白表達變化是細胞衰老的標志之一[10-11]。因此，我們通過檢測細胞衰老相關β-Gal陽性率和P53蛋白表達的方法來探討了COUP-TFⅡ表達降低后與HUVEC衰老之間的關系。結果發現，通過siRNA抑制HUVEC中COUP-TFⅡ的表達后，在無AngⅡ誘導狀態下，HUVEC在siCOUP-TFⅡ組與對照組的β-Gal染色陽性率和衰老標志分子P53蛋白表達并無顯著差異；而在一定濃度AngⅡ(10-5mol/L)的誘導刺激后，與對照組相比較，siCOUP-TFⅡ組衰老血管內皮細胞比例和P53蛋白表達量明顯升高。從而表明，COUP-TFⅡ對無AngⅡ誘導的基礎狀態下的血管內皮細胞衰老并無明顯影響，但對AngⅡ誘導狀態下的血管內皮細胞的衰老起著一定保護作用，而抑制COUP-TFⅡ表達可以促進血管內皮細胞的衰老。

既往研究發現，AngⅡ在誘導血管內皮細胞發生衰老變化時，可下調處于S期細胞的比例，最終抑制細胞進入增殖周期而抑制其增殖[12]。Qin等[13]通過研究也發現，COUP-TFⅡ在控制血管生長時可以調控血管內皮細胞的增殖和遷移功能。Zheng等[14]也研究發現，在腎腫瘤細胞中用siRNA抑制COUP-TFⅡ的表達后，腎腫瘤細胞的增殖能力顯著降低，而凋亡增加。Park等[15]發現，生長分化因子15在人動脈內皮細胞過表達促進內皮細胞衰老的同時，降低其增殖能力。因此，我們進一步探索了COUP-TFⅡ表達降低后，在衰老發生的同時，血管內皮細胞的增殖變化。在本研究中，我們利用siRNA抑制HUVEC中COUP-TFⅡ的表達，在無AngⅡ誘導狀態下，HUVEC不受siCOUP-TFⅡ影響；而在一定濃度AngⅡ(10-5mol/L)的誘導刺激作用一定時間后，siCOUP-TFⅡ組細胞增殖能力明顯降低。因此，說明COUP-TFⅡ對無AngⅡ誘導的基礎狀態下的血管內皮細胞增殖并無顯著影響，但對AngⅡ誘導狀態下血管內皮細胞增殖能力有明顯調節作用。

近年來研究已表明，Akt信號轉導通路可能是調控衰老的一條重要信號途徑。在胞漿中，Akt磷酸化后可在細胞衰老、增殖的調控中表現出重要作用[16]，而Ser473位點在Akt磷酸化位點中作為最直接的位點，被廣泛用作Akt活化的標志。因此，我們用Western blot檢測了在抑制COUP-TFⅡ表達后，Akt Ser473位點磷酸化水平。結果發現，在無AngⅡ誘導的基礎狀態時，抑制COUP-TFⅡ表達后，p-Akt/Akt的蛋白水平在siCOUP-TFⅡ組和對照組之間并無發生顯著差異；但在AngⅡ(10-5mol/L)誘導一定時間后，雖然siCOUP-TFⅡ組Akt蛋白與對照組相比較并無明顯變化，但磷酸化Akt蛋白的表達量較對照組相比明顯下降，提示抑制COUP-TFⅡ表達后，HUVEC衰老增殖的變化可能與Akt信號參與有關。為了進一步驗證上述結果，我們又在抑制COUP-TFⅡ表達后，加入了Akt激動劑SC79，結果表明SC79能夠部分逆轉由于抑制COUP-TFⅡ表達而引起的HUVEC衰老和增殖變化。

綜上所述，本實驗研究結果表明靜脈表型分子COUP-TFⅡ在離體HUVEC呈現顯著高表達， COUP-TFⅡ對基礎狀態下血管內皮細胞衰老和增殖無明顯影響，但在AngⅡ誘導下，抑制靜脈表型分子COUP-TFⅡ的表達會促進HUVEC的衰老，抑制HUVEC的增殖，其作用機制可能與其調節Akt信號有關。COUP-TFⅡ是區別動、靜脈內皮細胞的重要分子標志之一，其對血管內皮細胞衰老與增殖的調節，提示其影響了動、靜脈血管對粥樣硬化發生的易感性。本研究從血管本身分子差異的角度揭示了動、靜脈粥樣硬化易感性的機制。

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(責任編輯： 林白霜， 羅 森)

Effect of venous marker COUP-TFⅡ knockdown on senescence of vascular endothelial cells

LAI Ya-yu1, ZHOU Qi2, ZHENG Wei1, JIN Peng1, GU Wen-zhu1, WU Xiao-jing1

(1CardiologyCenterofPLA,XinqiaoHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400037,China;2CardiovascularDepartmentofTheSecondAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400010,China.E-mail:xiaojingwu1992@163.com)

AIM: To investigate the effect of venous marker chicken ovalbumin upstream promoter-transcription factor Ⅱ (COUP-TFⅡ) expression on vascular endothelial cell senescence and its molecular mechanism. METHODS: The mRNA expression of COUP-TFⅡ in the human coronary artery endothelial cells (HCAEC) and human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) was detected by RT-qPCR. After transfection with a COUP-TFⅡ siRNA (siCOUP-TFⅡ) to inhibit COUP-TFⅡ expression in the HUVEC, the senescence and proliferation of endothelial cells were evaluated by β-galactosidase staining, Western blot， CCK-8 assay and cell counting after treatment with 10-5mol/L angiotensin Ⅱ (AngⅡ). The protein levels of Akt and p-Akt were determined by Western blot. RESULTS: Compared with the HCAEC, COUP-TFⅡ was significantly highly expressed in the HUVEC. Knockdown of COUP-TFⅡ via siCOUP-TFⅡ significantly induced endothelial cell senescence and inhibited endothelial cell proliferation and p-Akt level after treatment with AngⅡ at 10-5mol/L. Furthermore, an Akt activator SC79 at 4 mg/L partly reversed the effect of siCOUP-TFⅡ on AngⅡ-induced endothelial cell senescence and proliferation. CONCLUSION: Knockdown of COUP-TFⅡ promotes endothelial cell senescence and inhibits endothelial cell proliferation, which might be partly regulated by Akt signaling.

Atherosclerosis; Vascular endothelial cells; Cell senescence; Cell proliferation; Chicken ovalbumin upstream promoter-transcription factor Ⅱ

1000- 4718(2017)08- 1345- 08

2016- 12- 12

2017- 03- 02

國家自然科學基金資助項目(No. 81370404； No. 91539104)

R339.3+8; R363.2+1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.08.001

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