植物甾醇酯對大鼠主動脈衰老及相關基因表達的影響*

丁程程， 李文芳， 周 錦， 冉 鈳， 吳曉青， 榮 爽

(武漢科技大學醫學院公共衛生學院， 武漢科技大學營養與慢性病防治研究所, 湖北 武漢 430065)

植物甾醇酯對大鼠主動脈衰老及相關基因表達的影響*

丁程程， 李文芳， 周 錦， 冉 鈳， 吳曉青， 榮 爽△

(武漢科技大學醫學院公共衛生學院， 武漢科技大學營養與慢性病防治研究所, 湖北 武漢 430065)

目的： 探討植物甾醇酯延緩大鼠主動脈衰老的作用及其機制。方法: 將42只12月齡雌性SD大鼠隨機均分為對照組、模型組和植物甾醇酯干預組，分別喂食基礎飼料、高脂飼料和高脂加2% 植物甾醇酯(W/W)飼料6個月。采用HE染色法和Masson染色法對主動脈橫截面石蠟切片進行染色，觀察主動脈組織的病理學改變，對血管壁平滑肌細胞和膠原纖維的絕對面積進行圖像分析。檢測血漿脂質蛋白、晚期糖基化終末產物(AGEs)、丙二醛(MDA)的含量以及超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)的活性。分別采用real-time PCR和Western blot的方法評估主動脈組織沉默信息調節因子1(SIRT1)和過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)的mRNA和蛋白表達水平。結果: 與模型組相比，植物甾醇酯干預組的血漿總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇水平顯著降低，高密度脂蛋白膽固醇的水平相反(P<0.05)，甘油三酯的水平沒有統計學差異；主動脈內膜和中膜的增厚以及平滑肌細胞的遷移均得到改善；主動脈平滑肌細胞和膠原纖維的含量顯著下降(P<0.05)；血漿AGEs的含量顯著降低(P<0.05)；機體的抗氧化功能有所提升，血漿MDA的含量顯著減少(P<0.05)，SOD和CAT活性的差異沒有統計學意義；PPARγ的表達下調，SIRT1的表達上調(P<0.05)。結論: 植物甾醇酯能夠延緩大鼠主動脈的衰老。其機制可能與降低機體活性氧的生成有關。植物甾醇酯可能通過激活SIRT1或抑制PPARγ的表達而發揮作用。

植物甾醇酯； 主動脈衰老； 沉默信息調節因子1； 過氧化物酶體增殖物激活受體γ

隨著全球老齡化社會的不斷發展，老齡化問題日趨嚴重，年齡的增長將成為血管疾病的首位危險因素[1]。隨著年齡的增長，血管的結構和功能發生特征性改變。植物甾醇(plant sterol，PS)是一類以環戊烷全氫菲(甾核)為骨架的天然醇類化合物，存在于植物油及其脫臭餾出物中。植物甾醇酯(phytosterol ester，PSE)是PS和脂肪酸發生酯化反應生成的產物。PS的生物活性多樣，包括抗氧化、抗炎、降脂和抗癌等活性，其中降脂作用已得到許多實驗和臨床研究證實。從PS的生物學活性上，我們有理由相信PSE具有延緩血管衰老的可能。

在血管老化相關的研究中，活性氧學說是公認的學說。當活性氧水平過高時，機體將生成一些終末產物，如晚期糖基化終末產物(advanced glycosylation end products，AGEs)和脂質過氧化終產物，引起細胞功能失調進而導致衰老的發展[2-3]。另外，衰老相關基因在血管衰老的發生和發展中有著至關重要的作用。例如，過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ)已被認為是延緩內皮細胞衰老的重要作用靶點之一[4-5]。沉默信息調節因子1(silent information regulator 1, SIRT1)被認為具有抑制PPARγ的作用[6]，其抑制作用是通過結合PPARγ上的輔因子核受體，阻遏PPARγ結合到目標基因而實現的。另外，SIRT1能夠通過抑制NADPH氧化酶的激活，保護血管內皮功能[6]，具有調控血管新生過程中內皮生成的作用[7]。調節機體抗氧化水平或衰老相關基因的表達可能是PSE減緩血管衰老的機制。

細胞實驗證明氧化型膽固醇能夠誘導內皮細胞凋亡[8]，而氧化型膽固醇的其中一個來源是高脂膳食。另有研究表明，高脂飲食能夠引起大鼠動脈血管內皮細胞衰老增加，促進血管衰老[9]。

因此，本研究給予大鼠高脂膳食，加速主動脈的衰老，并用含PSE的膳食進行干預，探索PSE是否具有改善大鼠主動脈衰老的作用，從抗氧化及相關基因的表達方面探索其作用機制。

材 料 和 方 法

1 動物

健康清潔級Sprague-Dawley (SD)大鼠，12月齡，體重300～400 g，由湖北省疾病預防控制中心提供，動物合格證號為42000600002422。

2 主要試劑

植物甾醇酯由BASF提供；AGEs ELISA試劑盒購自Bio-Swamp；考馬斯亮藍蛋白定量測試盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)測試盒、丙二醛(malondialdehyde, MDA)測試盒和過氧化氫酶(catalase, CAT)測試盒購自南京建成生物工程研究所；無酶水購自TaKaRa；組織裂解液和cDNA合成試劑盒購自Thermo Fisher Scientific；所有引物購自武漢天一輝遠生物科技有限公司；BCA蛋白定量試劑盒購自碧云天生物技術研究所；抗β-actin單克隆抗體、抗PPAR-γ單克隆抗體和II抗購自Santa Cruz；抗SIRT1單克隆抗體購自Abcam；Super Signal West Durao發光液和Super Signal West Pico發光液購自GE；聚乙二烯二氟化物膜購自Millipore；Epoch酶標儀購自BioTek；CFX Manager real-time PCR儀和凝膠成像分析系統購自Bio-Rad。

3 主要方法

3.1 動物分組及取材 60只大鼠(每籠5只)在溫度為(24±1)℃、相對濕度為(55±10)%、晝夜交替(08∶00～20∶00)的環境下，自由進食進水，適應性飼養3 d。篩選實驗動物，剔除患有慢性呼吸性疾病和腫瘤的動物。將剩余的42只大鼠隨機均分為3組，分別為對照(control)組、模型(model)組和PSE干預組(PSE組)。各組飼料配方如下：(1) 對照組：基礎飼料；(2) 模型組：5%蛋黃粉、10%豬油、2%膽固醇、0.3%膽鹽、0.2%丙基硫氧嘧啶和82.5%基礎飼料；(3) PSE干預組：2% PSE和98%高脂飼料。喂養24周后，禁食12 h，采血并離心取血漿，-80 ℃冷凍保存。每組隨機選取4只大鼠用4%多聚甲醛進行心臟灌注，輕柔地分離主動脈，并浸泡于4%多聚甲醛溶液中固定。剩余大鼠快速分離主動脈，-80 ℃冷凍保存。

3.2 血漿脂質水平的檢測 嚴格按照試劑盒的說明書檢測血漿中總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)的水平。

3.3 主動脈形態學的觀察 將固定的主動脈常規脫水、透明、浸蠟、包埋，連續切片，制成厚約5 μm的切片。(1) HE染色：將切片脫蠟水化，Harris 蘇木素染色，1%鹽酸乙醇分化，返藍后，用乙醇伊紅染色，脫水，透明，中性樹膠封片，最后在顯微鏡下觀察各組大鼠血管組織形態的差異。(2) Masson 染色：將切片脫蠟水化，用地衣紅染色，Weigert 鐵蘇木精染核，磷鉬酸水溶液分化，亮綠染色后，脫水，透明，樹膠封固，顯微鏡下觀察。采用Image-Pro Plus 7.0圖像分析軟件測量血管壁中膜平滑肌細胞(smooth muscle cells，SMC)和膠原纖維(collagen fibers，CF)的絕對面積，計算不同著色面積與測試區域整體面積之比(Aa%)，反映SMC和CF在各血管壁中的相對含量。

3.4 血漿AGEs含量的測定 嚴格按照AGEs ELISA試劑盒的說明書進行操作，測量血漿中AGEs的含量。在酶標包被板上加入樣品，再加生物素標記的抗AGEs抗體，溫育，洗滌，加入酶試劑，溫育，洗滌，加入顯色劑，最后加入終止液，在450 nm波長處檢測吸光度(A)。AGEs的濃度通過標準曲線計算，單位用μg/L表示。

3.5 血漿SOD、CAT的活性及MDA的含量檢測 按照說明書的步驟，完成對血漿SOD、CAT活性以及MDA含量的檢測。

3.6 Real-time PCR實驗 以β-actin作為內參照，檢測主動脈PPARγ和SIRT1 mRNA的表達水平。用Trizol提取和分離血管組織的總mRNA，以高容量cDNA逆轉錄試劑盒將RNA轉化為cDNA。加入引物(詳細序列見表1)和Taq聚合酶，用Bio-Rad CFX Manager real-time PCR儀進行定量分析。

3.7 Western blot實驗 稱取約100 mg血管組織(按組織∶裂解液=1∶4)加入400 μL裂解液，充分勻漿，直到無法看到明顯的組織塊。冰浴25 min后，收集裂解液。4 ℃下14 000 r/min離心10 min，取上清，采用BCA法測定上清總蛋白的含量。蛋白質在12%的聚丙烯酰胺凝膠電泳上分離，用半干轉移法將蛋白轉移到聚乙二烯二氟化物膜中。將膜放入有Tween-20 的5%脫脂牛奶TBST中封閉1 h，然后放入包含抗PPARγ或SIRT1抗體的 TBST中孵育1 h，再放入稀釋的II抗中孵1 h。制備Super Signal West Durao和Super Signal West Pico(1∶1)混合發光液，加在膜上，反應30 s后，用凝膠成像分析系統對條帶進行成像和分析。

4 統計學處理

用SPSS 17.0統計軟件進行分析。數據均采用均數±標準差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 PSE對血漿脂質水平的影響

實驗結束時，模型組大鼠血漿的TC和LDL-C水平顯著高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組大鼠相比，PSE干預能夠顯著降低血漿的TC和LDL-C水平，差異有統計學意義(P<0.05)；此外，與對照組相比，模型組血漿的HDL-C水平顯著降低(P<0.05)，而給予PSE干預后血漿的HDL-C水平顯著升高(P<0.05)，且升高至與對照組的HDL-C水平相近的水平。血漿的TG水平3組大鼠之間的差異沒有統計學顯著性，見表2。

表2 PSE對血漿TC、TG、LDL-C和HDL-C水平的影響

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsmodel.

2 PSE對大鼠主動脈形態學的影響

2.1 PSE對主動脈的結構的影響 由圖1可見，對照組大鼠主動脈結構完整，內膜薄，中膜的平滑肌細胞排列整齊。模型組大鼠主動脈內膜增厚，并可見隆起，內膜下間隙變寬，出現泡沫細胞；中膜增厚，平滑肌細胞排列紊亂，部分遷移至內膜。PSE干預大鼠的主動脈結構基本完整，內膜較薄，可觀察到部分隆起；中膜未見明顯增厚，平滑肌細胞排列整齊，較少發生遷移。

Figure 1.The effect of PSE on the morphological changes of aorta in high-fat diet-fed rats (HE staining， ×400).

圖1 PSE對衰老大鼠主動脈結構的影響

2.2 PSE對衰老主動脈SMC及CF的影響 主動脈組織進行Masson染色后，SMC呈紅色，CF呈綠色，結果見圖2。與對照組相比，模型組的SMC綠染區域增加；與模型組相比較，PSE干預組的綠染區域減少。圖像分析結果顯示，與對照組相比，模型組大鼠的主動脈SMC和CF的含量均顯著增加，PSE的攝入顯著減少了SMC和CF的含量，差異均具有統計學意義(P<0.05)；比較對照組和PSE干預組之間的差異沒有統計學顯著性。

Figure 2.The effect of PSE on the SMC and CF contents of aorta in high-fat diet-fed rats (Masson staining， ×200). Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsmodel group.

圖2 PSE對衰老大鼠主動脈平滑肌細胞和膠原纖維的影響

3 PSE對血漿AGEs含量的影響

與對照組相比，模型組大鼠血漿的AGEs含量增多，差異具有統計學意義(P<0.05)；與模型組相比，PSE干預呈現出降低血漿AGEs的作用，且差異具有統計學意義(P<0.05)；PSE干預組與對照組之間的差異無統計學顯著性，見表3。

4 PSE對血漿SOD、CAT活性及MDA含量的影響

由表3可知，在血漿SOD的活性方面，PSE干預組大鼠和模型組大鼠與對照組相比下降均不明顯，PSE干預組大鼠高于模型組，差異具有統計學顯著性；在血漿CAT的活性方面，3組大鼠之間的差異均沒有統計學顯著性(P>0.05)；在血漿MDA的含量方面，模型組大鼠與對照組相比含量增加，PSE干預組大鼠與模型組相比含量減少，差異均具有統計學顯著性(P<0.05)，PSE干預組大鼠與對照組之間的差異沒有統計學顯著性。

表3 PSE對AGEs、MDA含量和SOD、CAT活性的影響

Table 3.The effect of PSE on the contents of AGEs and MDA and the activity of SOD and CAT in the plasma of high-fat diet-induced aging rats (Mean±SD.n=6)

GroupAGEs(mmol/L)SOD(×103U/L)CAT(×103U/L)MDA(μmol/g)Control170．61±55．3912．34±3．450．80±0．556．95±0．68Model252．60±42．26?10．08±2．831．37±0．49?8．24±0．96?PSE182．41±34．74#15．13±3．95#0．44±0．27#6．84±1．36#

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsmodel.

5 PSE對主動脈PPARγ和SIRT1 mRNA及蛋白表達的影響

各組大鼠主動脈組織PPARγ和SIRT1的mRNA及蛋白表達水平見圖3。與對照組相比，模型組大鼠主動脈組織的PPARγ的mRNA和蛋白表達水平顯著增加(P<0.05)；與模型組相比，PSE的攝入降低了主動脈組織PPARγ的mRNA和蛋白表達水平(P<0.05)；PSE干預組與對照組相比PPARγ的mRNA和蛋白表達水平的差異均沒有統計學顯著性。模型組大鼠SIRT1的mRNA和蛋白表達水平顯著低于對照組(P<0.05)；PSE干預組大鼠SIRT1的mRNA的表達水平與模型組相比差異沒有統計學顯著性，但在蛋白的表達上PSE干預組顯著高于模型組(P<0.05)。

Figure 3.The effect of PSE on the expression of PPARγ and SIRT1 in the aorta in high-fat diet-fed rats. The mRNA (A) and protein (B) of PPARγ and SIRT1 in the aortas of the rats were detected by real-time PCR and Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsmodel group.

圖3 PSE對衰老大鼠主動脈PPARγ和SIRT1表達的影響

討 論

本研究以高脂膳食誘導的主動脈衰老的大鼠為模型，采用PSE膳食干預，觀察PSE是否能減輕血管衰老，并對其作用機制進行了探索，發現PSE顯著降低血漿TC和LDL-C的水平，增加HDL-C的水平。觀察主動脈形態的HE染色結果顯示，模型組大鼠的主動脈壁呈現明顯的老化現象：內膜和中膜明顯增厚，平滑肌增生，SMC排列紊亂，并發生遷移，表明成功建立了衰老模型。給予PSE膳食干預的大鼠主動脈內膜和中膜未見明顯增厚，SMC排列比較整齊。分析Masson染色結果發現，模型組大鼠主動脈的SMC和CF含量顯著增加，PSE的干預改善了這一變化，且改善至與對照組相近的水平。這些結果證明，高脂膳食能夠促進大鼠主動脈的衰老，PSE具有緩解這一進程的作用。

研究表明，AGEs 隨增齡在體內不斷的積累，與膠原蛋白發生交聯，難以水解產物造成血管壁硬度增加[10]，并通過一系列的反應，加劇衰老[11]。對血漿AGEs含量的檢測結果表明，高脂膳食顯著增加了AGEs的含量，而PSE的攝入逆轉了這一改變，進一步證實了PSE具有減緩血管衰老的作用。

在作用機制方面，本研究首先對大鼠的抗氧化功能進行了評估。結果顯示，PSE減少高脂膳食誘導的MDA含量增加，即PSE呈現出良好的抗氧化能力，這可能是其緩解衰老的機制之一。其次，基因表達的調控在延緩主動脈衰老的進程中也發揮著重要作用。已知低能量狀態如營養或熱量不足能誘導SIRT1的表達[12]，而能量過剩如高脂飲食會抑制其表達[13]。分析主動脈組織SIRT1的表達水平發現，模型組大鼠的表達水平顯著低于對照組，這與之前的報道一致；PSE干預后，大鼠主動脈SIRT1的表達水平得到顯著提高，這與一項小鼠的實驗研究結果一致，其認為SIRT1能夠緩解快速老化小鼠血管的衰老[14]。在主動脈組織PPARγ的表達方面，PSE顯著下調了PPARγ的mRNA和蛋白表達水平。近年來發現PPARγ在血管內皮細胞中有表達，影響內皮功能及血管平滑肌細胞的增殖和遷移，激活巨噬細胞[15-16]，也有報道認為PPARγ信號通路的激活具有延緩衰老的作用[17-18]。關于PPARγ在血管衰老進程中扮演的角色，目前沒有確切的結論，值得進一步的探討。

綜上所訴，PSE具有延緩主動脈衰老的作用，可能是通過增強機體的抗氧化功能、調節SIRT1或PPARγ的表達來發揮作用的。

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(責任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Effects of phytosterol ester on aortic aging and expression of related genes in rats

DING Cheng-cheng, LI Wen-fang, ZHOU Jin, RAN Ke, WU Xiao-qing, RONG Shuang

(SchoolofPublicHealth,MedicalCollege,WuhanUniversityofScienceandTechnology;InstituteofNutritionandChronicDiseases,WuhanUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430065,China.E-mail:moment-88@163.com)

AIM: To explore the protective effect of phytosterol ester (PSE) on aortic aging in rats. ME-THODS: The female SD rats (12 months old,n=42) were randomly divided into control group, model group and PSE group. During the experiment, the rats in control group, model group and PSE group were treated with basic feed, high-fat diet (HFD) and HFD with 2% PSE (W/W) for 6 months， respectively. The morphological changes of the aorta were observed by HE staining and Masson staining, and the absolute area of smooth muscle cells and collagen fiber in the vascular wall were measured by image analysis. The levels of advanced glycosylation end products (AGEs), malondialdehyde (MDA), superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT) in the plasma were detected. The expression of silent information regulator 1 (SIRT1) and peroxisome proliferator-activated receptor γ (PPARγ) at mRNA and protein levels in the vascular tissue was determined by real time PCR and Western blot， respectively. RESULTS: PSE significantly lowered plasma TC and LDL-C, and increased plasma HDL-C level (P<0.05), but had no effect on plasma TG level. PSE significantly attenuated the thickening of intima and media of aging aortic, and decreased the migration of vascular smooth muscle cells (VSMC) and the amount of VSMC and collagen fiber in the aorta (P<0.05). PSE significantly reduced the contents of AGEs and MDA (P<0.05), but had no effect on the activity of SOD and CAT in the plasma. PSE also down-regulated the expression of PPARγ and up-regulated the expression of SIRT1 (P<0.05). CONCLUSION: PSE is able to attenuate the senescence process in the aorta by reducing the production of reactive oxygen species in plasma, and activating SIRT1, or inhibiting the expression of PPARγ in vascular tissues.

Phytosterol ester; Aortic aging; Silent information regulator 1; Peroxisome proliferator-activated receptor γ

1000- 4718(2017)08- 1365- 06

2016- 12- 27

2017- 03- 21

2013年BASF國際健康研究基金項目課題(亞洲)

R339.3+8； R965； R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.08.004

雜志網址： http://www.cjpp.net

△通訊作者 Tel: 18571727264; E-mail: moment-88@163.com