納米金結合恩度抑制小鼠黑色素瘤肺轉移*

李 鑫， 潘運龍， 覃 莉， 李 偉， 吳 秀， 楊文德， 潘 璠

(暨南大學附屬第一醫院胃腸外科， 廣東 廣州 510630)

納米金結合恩度抑制小鼠黑色素瘤肺轉移*

李 鑫， 潘運龍△， 覃 莉， 李 偉， 吳 秀， 楊文德， 潘 璠

(暨南大學附屬第一醫院胃腸外科， 廣東 廣州 510630)

目的： 觀察納米金結合恩度對小鼠黑色素瘤肺轉移的影響并探討其機制。方法: C57BL/6小鼠24只，構建小鼠黑色素瘤B16-F10細胞自發性肺轉移模型，隨機分為恩度組、納米金組、納米金結合恩度組和模型組。成瘤后各組小鼠均經尾靜脈注射相應藥物0.1 mL(每天1次)。9 d后麻醉小鼠并切取原位腫瘤，繼續飼養2周后處死小鼠取肺組織觀察轉移情況。HE染色觀察原位腫瘤壞死情況，免疫染色檢測腫瘤CD31、碳酸酐酶IX(CA-IX)、vimentin和閉鎖小帶蛋白1(ZO-1)的表達。結果: 與模型組相比，藥物處理組小鼠的肺轉移灶均明顯減少，其中納米金結合恩度組的肺轉移抑制率最高，腫瘤壞死明顯減少，腫瘤中CD31、CA-IX和vimentin的表達量顯著降低，ZO-1的表達量顯著升高。結論: 與單用恩度或納米金相比，納米金結合恩度可明顯抑制小鼠黑色素瘤肺轉移，其機制可能為使腫瘤新生血管減少及血管正常化，改善腫瘤缺氧，從而抑制腫瘤上皮-間充質轉化，使腫瘤細胞間緊密連接增加而侵襲性減低。

納米金； 恩度； 黑色素瘤； 腫瘤轉移； 上皮-間充質轉化

轉移是惡性腫瘤的基本生物學特征，90%以上的癌癥患者死于腫瘤轉移[1]。血管生成是腫瘤生長、轉移的必要條件，抗腫瘤血管生成治療是一種有效的治療方法[2]，但過度抗血管生成會加重腫瘤微環境的缺氧狀態，降低放化療療效[3-4]。因此Jain[5]提出了腫瘤血管正常化理論，即合理運用抗腫瘤血管生成藥物可以重新恢復促血管生成因子和血管生成抑制因子之間的平衡，使原來扭曲異常的腫瘤血管系統趨于正常，并能改善腫瘤微環境。重組人血管內皮抑制素恩度(Endostar)為抗腫瘤血管生成藥物，小劑量應用可使腫瘤血管短暫趨于正常，改善腫瘤缺氧[6-7],但恩度特異性不高且具有潛在的心臟反應、胃腸道反應等不良反應。納米金(gold nanoparticles，AuNPs)是直徑介于1～100 nm的金顆粒，具有生物相容性好、組織滲透性強、表面易于修飾等優點[8]，因此，常用來作為藥物靶向輸送的載體[9-11]。本課題組前期研究表明，AuNPs本身具有抗腫瘤血管生成、使腫瘤血管正常化作用[12-15]；將納米金與恩度結合形成復合體，可靶向輸送恩度至腫瘤組織而提高濃度，使腫瘤血管產生一個正常化時間窗(第4～12天)，改善腫瘤微環境[16]。本實驗利用小鼠黑色素瘤自發性肺轉移的動物模型研究納米金結合恩度對腫瘤血行轉移的影響，并通過免疫染色檢測腫瘤血管密度、缺氧程度及黑色素瘤細胞波形蛋白(vimentin)、閉鎖小帶蛋白1(zonula occludens-1，ZO-1)的表達，探討其影響轉移的機制。

材 料 和 方 法

1 動物

根據《導游人員管理條例》第二條，導游是指通過正規渠道獲得導游證，經旅行社派遣，在旅行過程中為游客提供旅游向導、景點講解等旅游服務的人員。作為典型的邊界跨越者，導游在理解、過濾和解讀往來于旅行社及其外部游客間的信息和資源的過程中擔任關鍵角色。該職業具有以下工作特征：（1）高度的獨立性。旅游過程中的絕大部分事務都需要導游全權負責；（2）腦力與體力高度結合。旅途中，導游既需要不斷地思考，還需要健康強壯的身體支撐一系列體力活動；（3）面對復雜多樣的事物。包括復雜的服務對象、多元的游客需求、復雜的人際交往等；（4）文化傳播的載體。導游肩負著傳播文化的任務，需要在不同民族、不同地域文化中構建溝通的橋梁。

SPF級C57BL/6小鼠24只，雌雄不限，8周齡，23～25 g，由暨南大學實驗動物中心提供。小鼠黑色素瘤B16-F10細胞購自中國科學院上海生命科學研究院細胞庫。

2 主要試劑

4 統計學處理

3.5 免疫染色檢測原位腫瘤中血管密度、缺氧和腫瘤轉移相關分子的表達 原位腫瘤石蠟切片，按福州邁新生物技術開發公司提供的SP法進行免疫組化的檢測。抗 CD31標記血管內皮細胞，觀察腫瘤組織血管密度。抗 CA-IX檢測腫瘤組織缺氧情況。抗 ZO-1標記腫瘤細胞間的緊密連接蛋白。抗 vimentin標記惡性黑色素瘤的細胞骨架蛋白。應用ImageJ圖像處理軟件對圖片中的陽性表達進行量化分析。

3 主要方法

3.1 配制納米金-恩度復合體溶液 參考本課題組前期發表文獻[16]中的方法制備納米金-恩度復合體(AuNPs-Endostar)溶液：按照溶液體積AuNPs∶Endostar=4∶1取Endostar加入AuNPs溶液中振蕩混勻，放入4℃冰箱避光孵育12 h，期間每隔2 h振蕩混勻。然后加入等體積的甲氧基聚乙二醇硫醇振蕩混勻，繼續避光孵育4 h，然后以12 000 r/min的轉速離心15 min，棄去上清液，底部的聚沉物即為納米金-恩度復合體，以適量生理鹽水震蕩溶解后用于動物實驗。

3.2 構建小鼠黑色素瘤自發性肺轉移模型 消化收集對數生長期B16-F10細胞，重懸于PBS中(5×109～1×1010/L)，接種于C57BL/6小鼠后肢足墊(皮下注射50 μL)。將荷瘤小鼠隨機分為4組，每組6只，按以下方案給予處理：納米金結合恩度組用AuNPs-Endostar復合體溶液；恩度組用等體積Endostar溶液；納米金組用AuNPs溶液；模型組用生理鹽水。腫瘤生長至120 mm3左右開始給藥，按照恩度5 mg/kg的劑量稀釋相應溶液為0.1 mL，尾靜脈注射(1次/d)。9 d后用戊巴比妥麻醉小鼠，切除后肢，分離原位腫瘤以多聚甲醛固定。2周后給予小鼠安樂死，取肺組織多聚甲醛固定。

在俄羅斯，因主觀條件致婚姻無效的，受害的一方可以提起婚姻無效之訴。在我國，受脅迫的一方可以提起婚姻撤銷之訴。但是，撤銷婚姻可由法院為之，也可由婚姻登記機關為之。不管是婚姻被宣告無效還是被撤銷，都產生自始無效的后果。當事人之間的身份關系消滅，但不影響與其子女之間的身份關系。

（一）活動推廣。中醫學上有一句話，叫“動則生陽”。其中“陽”字指“陽氣”。筆者在此望文生義，將其“曲解”變通一下，變為“太陽”，而這里的“太陽”又類似于《三字經》中泛指一切給人帶來溫暖的事物。“溫暖”取其不過炎，亦不過寒，感覺舒適之意。而活動恰恰起到如是作用。尤其對青少年，或者對少年兒童來說。筆者從事管理工作的都江堰市圖書館，正是通過一系列的活動，如“動物繪畫展”“科技知識展”等，喚醒孩子們“讀”的欲望。“欲”字取其內心想要，既然發乎于心的想要閱讀，那“讀”的過程自然是一種愉悅身心的樂事，成為閱讀通道。

3.3 肺轉移的觀察 在解剖顯微鏡下計數肺表面轉移瘤結節數，并測量結節的最長徑，對結節進行分級(Ⅰ級：直徑<0.5 mm；Ⅱ級：直徑0.5～1 mm；Ⅲ級：直徑1～2 mm；Ⅳ級：直徑>2 mm)，并按照以下公式計算總轉移數：總轉移數=Ⅰ級(結節數)×1+Ⅱ級×2+Ⅲ級×3+Ⅳ級×4；肺轉移抑制率(%)=(1-實驗組肺轉移數/對照組肺轉移數)×100%。同時行肺組織石蠟包埋、切片，HE染色后鏡下觀察肺內轉移。

恩度由中國先聲藥業集團有限公司提供。AuNPs溶液購自上海捷寧生物科技有限公司。DMEM培養基和優質胎牛血清購自Gibco。兔抗鼠CD31、碳酸酐酶IX(carbonic anhydrase-IX，CA-IX)、上皮型鈣黏蛋白(epithelial cadherin，E-cadherin)、vimentin和ZO-1單抗購自Abcam。SP試劑盒(通用型)購自福州邁新生物技術開發有限公司。

山地式農村的海拔高差大于100 m，山坡坡度較大，地形地貌極為復雜，是地質災害頻發區。土地資源利用受自然條件影響極大，導致生態功能用地布局散亂，也意味著細碎化程度高。老居民住宅零散，多分布于道路兩側及兩側山坡相對平緩處，道路一般沿等高線修建。該類鄉村受地形地貌等影響，區內經濟水平普遍較低，與此相反的是該區域的生態系統保持較好，具有較高的生態功能，在規劃過程中僅需考慮水土流失及改善居民生活條件就可以實現生態網絡的建立。

（3）混合感染率。調查的80只羊中多為混合感染，其中沒有感染球蟲的感染率為16.25%（13/80），感染1種球蟲的為12.50%（10/80），混合感染2種球蟲的為12.50%（10/80），混合感染3種球蟲的為26.25%（21/80），混合感染4種球蟲的為12.50%（10/80），混合感染5種球蟲的為11.25%（9/80），混合感染6種球蟲的為6.25%（5/80），混合感染7種球蟲的為1.25%（1/80），混合感染8種球蟲的為1.25%（1/80）[3]。

3.4 HE染色觀察原位腫瘤的組織學變化 各組原位腫瘤經多聚甲醛固定后，脫水、石蠟包埋、切片，行HE染色觀察腫瘤組織壞死情況。

用SPSS 16.0統計軟件進行分析。數據均采用均數±標準差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Bonferroni檢驗， 以P<0.05為差異具有統計學意義。

結 果

3 HE染色觀察原位腫瘤的壞死情況

①心理行為小組確立:為患者在進行護理時,需確立心理行為護理小組,小組當中包括有一名主治醫生,一名責任護士和三名護理人員。責任護士擔任組長,護理前需邀請專業的心理行為干預專家進行培訓,主要內容需圍繞心理干預方法、溝通的技巧、干預的內容等逐漸提高護理人員的綜合能力,幫助護理人員深化服務意識。做好對于患者的、生理和心理狀態的評估,了解患者的護理干預的需求,并在此基礎之上,根據患者的實際狀況,為患者制定針對性的干預方案,主動為患者進行詳細的解釋,提高患者護理的依從性。

如表1所示，與模型組相比，各處理組小鼠肺轉移灶數量明顯降低(P<0.01)；與AuNPs組和Endostar組相比，AuNPs-Endostar組肺轉移灶明顯減少(P<0.05),提示AuNPs和Endostar均可抑制小鼠黑色素瘤的轉移，AuNPs-Endostar較單獨用藥可顯著提高轉移抑制率。圖1為各組小鼠肺組織大體圖片，圖2為肺組織HE染色圖片，可見AuNPs-Endostar組肺表面及肺內轉移灶均明顯減少。此研究結果表明，納米金-恩度復合溶液可顯著抑制小鼠黑色素瘤肺轉移。

表1 各組小鼠肺轉移性結節數量和肺轉移抑制率

Table 1.The number of lung metastatic nodules and the inhibition rate of lung metastasis in each group (Mean±SD.n=6)

GroupNumberofnodulesInhibitoryrate(%)Model193．8±25．30AuNPs94．0±17．4??51．5Endostar79．5±17．7??59．0AuNPs?Endostar32．3±15．3??##△83．3

**P<0.01vsmodel group;##P<0.01vsAuNPs group;△P<0.05vsEndostar group.

Figure 1.The lung metastasis in each group. Black dots indicated metastatic nodules.

圖1 各組小鼠肺組織的腫瘤轉移情況

Figure 2.Hematoxylin and eosin staining of lung sections (×40). Arrows showed metastatic tumors.

圖2 HE染色觀察腫瘤的肺內轉移

2 免疫熒光染色檢測原位腫瘤中CD31和CA-IX的表達

與模型組相比，各處理組小鼠原位腫瘤CD31和CA-IX表達均明顯減少，AuNPs-Endostar組減少最明顯，與模型組比較差異有統計學意義(P<0.01)，與AuNPs組和Endostar組比較差異也有統計學意義(P<0.05)。模型組血管密度高，但血管雜亂，為異常的腫瘤血管，腫瘤組織缺氧嚴重，實驗組腫瘤血管減少，但缺氧明顯改善，見圖3。此研究結果表明，納米金結合恩度使腫瘤血管正常化，異常血管減少，缺氧改善。

1 小鼠黑色素瘤肺轉移情況

如圖4所示，與模型組相比，各處理組小鼠原位腫瘤壞死均明顯減少，AuNPs-Endostar組腫瘤壞死最少。此研究結果表明，納米金結合恩度使腫瘤血管正常化后，缺氧改善，腫瘤壞死減少。

Figure 3.Immunostaining of tumor sections for CD31 and CA-IX (A, ×40) and quantitative analysis (B) measured by ImageJ software. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vsAuNPs-Endostar group.

圖3 免疫熒光檢測原位腫瘤中CD31和CA-IX的表達

Figure 4.Necrotic areas in B16-F10 tumors (hematoxylin and eosin staining, ×40). Arrows indicated necrotic areas.

圖4 HE染色觀察原位腫瘤的壞死情況

4 免疫組化染色檢測原位腫瘤中vimentin和ZO-1的表達情況

著名的“圖靈測試”（Turing Test）主張，如果人類測試者在與計算機進行交流時無法分辨其交流對象是人還是計算機，則認為計算機擁有了智能。［10］馬克·瑞德爾在圖靈測試的基礎上提出了“拉芙萊斯測試”（Lovelace Test），如果人類測試者無法將計算機創作的文學藝術作品與自然人創作的文學藝術作品分辨開來，則可以認為計算機具有了人的創作能力。［11］這類主張根據外在特征對人工智能的創作能力進行判斷的測試雖然未必能夠判斷出計算機是否真正擁有人的創造力，但基本上可以測試出人工智能創作是否可以達到版權法意義上相對較低的外在的獨創性標準。［11］

與模型組相比，各處理組小鼠原位腫瘤的vi-mentin表達明顯減少，ZO-1表達明顯增加。AuNPs-Endostar組與對照組比較差異有統計學意義(P<0.01)，與AuNPs組和Endostar組比較差異也有統計學意義(P<0.05)，見圖5。此研究結果表明，納米金結合恩度可顯著減少黑色素瘤的細胞骨架蛋白vimentin的表達，增加細胞間的緊密連接蛋白ZO-1的表達。

Figure 5.Immunostaining for vimentin and ZO-1 expression in the B16-F10 tumors (A, ×100) and the quantitative analysis (B) was showed. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vsAuNPs-Endostar group.

圖5 免疫組化檢測原位腫瘤中vimentin和ZO-1的表達

討 論

腫瘤血管生成誘發的腫瘤微環境變化在腫瘤進展過程中起到至關重要的作用[17]。與正常血管相比，腫瘤血管結構紊亂，表現為形態扭曲、管壁擴張、動靜脈異常吻合、缺乏完整的周細胞覆蓋、基膜不完整及通透性增高，導致腫瘤缺氧、酸中毒和高組織間液壓(interstitial fluid pressure, IFP)的微環境[5, 17-18]。這種惡性微環境可轉變腫瘤細胞的固有特性，使其易于通過血管裂隙轉移，促進腫瘤細胞和基質細胞分泌促血管生成因子，加重血管異常，并通過影響腫瘤細胞的增殖、調節轉移相關基因的表達水平、促進細胞外基質的降解來促進轉移的發生[19-21]。納米金和恩度均具有抗血管生成作用，本課題組前期研究表明，小劑量的納米金或恩度可使腫瘤血管暫時正常化，時間窗約為用藥的第4～12天；且納米金作為藥物載體具有腫瘤靶向性，結合恩度并靶向輸送至腫瘤組織，二者共同發揮促腫瘤血管正常化作用，改善腫瘤的惡性微環境[15-16]。本實驗旨在探究納米金結合恩度使腫瘤血管正常化對腫瘤轉移的影響。

上皮-間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)在腫瘤轉移過程中起重要作用，主要特征為細胞黏附分子表達的減少、細胞角蛋白細胞骨架轉化為vimentin為主的細胞骨架及形態上具有間充質細胞的特征等[22]。通過EMT，上皮細胞失去極性，失去與基底膜的連接(如緊密連接蛋白ZO-1)，獲得了較高的遷移與侵襲、抗凋亡和降解細胞外基質的能力[23]。Vimentin不僅是EMT的標志，且與黑色素瘤的轉移密切相關，高表達的vimentin是黑色素瘤血道轉移的預測因素之一[24]，故本研究選用vimentin和ZO-1作為檢測黑色素瘤侵襲轉移性的指標，實驗結果證明納米金結合恩度使原位腫瘤中CA-IX的表達明顯減少，改善了黑色素瘤缺氧的內環境，使vimentin表達明顯減少，抑制EMT的發生，腫瘤細胞侵襲、轉移能力明顯下降，ZO-1表達明顯增加，腫瘤細胞間連接變得緊密，腫瘤細胞不易通過血管裂隙轉移，從而減少腫瘤的血行轉移。

本實驗成功構建了B16-F10小鼠黑色素瘤自發性肺轉移模型，經分組藥物處理后，實驗結果表明經AuNPs-Endostar復合體處理后，與對照組和單藥組相比,黑色素瘤肺轉移顯著減少，腫瘤血管密度(CD31)減少，缺氧指標CA-IX表達減少，腫瘤壞死明顯減少，腫瘤EMT指標vimentin表達顯著減少，細胞間緊密連接ZO-1表達顯著升高。這證明了納米金結合恩度使黑色素瘤異常血管減少、血管正常化后，可以改善缺氧的腫瘤微環境，抑制上皮間質轉化，使細胞間緊密連接增加，從而降低黑色素瘤的侵襲和轉移能力，抑制其血行轉移，且與單用恩度或納米金相比，納米金結合恩度可明顯提高抑制轉移的效果。

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(責任編輯： 盧 萍， 羅 森)

Inhibitory effect of AuNPs-Endostar on melanoma lung metastasis in mice

LI Xin, PAN Yun-long, QIN Li, LI Wei, WU Xiu, YANG Wen-de, PAN Fan

(DepartmentofGastrointestinalSurgery,TheFirstAffiliatedHospitalofJinanUniversity,Guangzhou510630,China.E-mail:tpanyl@jnu.edu.cn)

AIM: To observe the influence of gold nanoparticles combined with Endostar (AuNPs-Endostar) on the melanoma lung metastasis of mice and the underlying mechanism. METHODS: C57BL/6 mice (n=24) were selected for constructing the model of spontaneous lung metastasis of melanoma B16-F10 cells. Subsequently, the mice were randomly divided into Endostar group, AuNPs group, AuNPs-Endostar group and model group. After the formation of melanoma, the mice in each group were injected with different drugs through tail vein for 0.1 mL daily. After 9 d, the mice were narcotized for cutting the tumorsinsitu. After the operation, they were raised for 2 weeks before killed for obtaining the lung tissues to observe the situation of the metastasis. HE staining was utilized for observing the necrosis status of the tumorsinsitu, while immunostaining was applied for testing the expression of CD31, carbonic anhydrase-IX (CA-IX), vimentin and zonula occludens-1 (ZO-1) in the tumors. RESULTS: Compared with model group, the pulmonary metastasis in the groups with medical treatment was obviously reduced. In AuNPs-Endostar group, the metastasis inhibition rate was the highest, and the tumor necrosis was also decreased obviously, with the significant reduction of CD31, CA-IX and vimentin expression in the tumors and significant increase in ZO-1 expression. CONCLUSION: Compared with using Endostar or AuNPs alone, the combination of AuNPs with Endostar significantly improves the curative effect of inhibiting the pulmonary metastasis of melanoma in the mice. The mechanism may be related to reducing the tumor angiogenesis, norma-lizing the blood vessels and improving tumor hypoxia, thus inhibiting the tumor epithelial-mesenchymal transition， increasing the tight junctions between tumor cells and decreasing the invasiveness.

Gold nanoparticles; Endostar; Melanoma; Neoplasm metastasis; Epithelial-mesenchymal transition

1000- 4718(2017)08- 1393- 06

2016- 11- 10

2017- 05- 08

國家自然科學基金資助項目(No. 81472849)； 廣東省自然科學基金資助項目(No. 2014A030313383； No. 2014A030313382)

R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.08.008

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△通訊作者 Tel: 020-38688859； E-mail: tpanyl@jnu.edu.cn