格列本脲對膠質母細胞瘤活性及細胞內酸堿平衡的影響*

郭 玲， 盛華均， 劉 茜， 楊清華， 朱淑娟

(重慶醫科大學基礎醫學院人體解剖教研室， 重慶 400016)

格列本脲對膠質母細胞瘤活性及細胞內酸堿平衡的影響*

郭 玲， 盛華均， 劉 茜， 楊清華， 朱淑娟△

(重慶醫科大學基礎醫學院人體解剖教研室， 重慶 400016)

目的： 探討格列本脲對膠質母細胞瘤活性及細胞內酸堿變化的影響。方法: 使用不同濃度的格列本脲(Glib)處理人膠質瘤細胞株U251和U87，通過CCK-8法篩選有效劑量；隨后將實驗分成對照組和藥物處理組，劃痕實驗檢測細胞遷移情況，細胞pH指示熒光探針檢測細胞內pH變化，Western blot測定內向整流鉀離子通道4.1(Kir4.1)和單羧酸轉運蛋白1(MCT1)的表達情況。結果: CCK-8法檢測結果顯示，Glib作用于U251細胞和 U87細胞48 h的半數抑制濃度(IC50)分別為400.20 μmol/L和553.70 μmol/L，且在100～1 600 μmol/L的濃度區間范圍內，Glib抑制U251細胞活力，在50～1 600 μmol/L的濃度區間范圍內，Glib抑制U87細胞活力，兩者均呈濃度依賴性(P<0.05)；與對照組相比較，Glib不僅能夠抑制細胞遷移(P<0.05)，抑制作用與藥物濃度呈正相關(P<0.05)，而且使實驗組細胞內熒光強度減弱(P<0.05)，提示隨著藥物濃度的增高，細胞內pH值逐漸下降(P<0.05)；實驗組細胞的Kir4.1和MCT1蛋白含量明顯降低，均有濃度依賴性(P<0.05)。結論: Glib在一定劑量范圍內通過下調Kir4.1和MCT1表達誘導細胞內環境酸化，抑制膠質瘤細胞生長。

格列本脲； 膠質母細胞瘤； 細胞活性

膠質瘤是中樞神經系統最常見的顱內原發腫瘤[1]，發生發展機制至今仍不完全清楚。世界衛生組織根據其病理特點將其劃分為4個病理級別，即Ⅰ～Ⅳ級，其中Ⅰ～Ⅱ級屬低級別，Ⅲ～Ⅳ級屬高級別，也是惡性膠質瘤[2]。惡性膠質瘤其侵襲性強、術后復發率高，目前治療效果不理想[3-4]。因此，探尋其機制及其防治迫在眉睫。

細胞內堿化與細胞增殖密切相關。研究表明內向整流鉀離子通道4.1(inwardly-rectifying potassium channel 4.1，Kir4.1)和單羧酸轉運蛋白(monocarbo-xylate transport proteins，MCT)的亞型MCT1均高表達于腦膠質瘤中，參與調節細胞增殖生長[5-10]。Kir4.1對K+具有強大的內向整流作用[11-12]，MCT1主要參與乳酸及單羧酸的跨膜運輸[10]，二者均在維持胞內外酸堿平衡的過程中發揮重要作用[12]。研究還指出格列本脲(glibenclamide，Glib)可抑制膠質瘤U87細胞增殖和遷移[13]，但具體機制不明。為此，本研究以膠質瘤U251細胞和U87細胞為研究對象，將從酸堿度的角度探討Glib對膠質瘤細胞活性的作用及機制。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 細胞系與藥物 U251細胞來自復旦IBS細胞資源中心，U87細胞來自重慶醫科大學神經科學研究中心凍存；格列本脲(純度>95%)購于Sigma，用二甲基亞砜溶解至稀釋濃度為2×105μmol/L，0.22 μm過濾器超濾除菌后，分裝后于-20 ℃儲存，使用時用DMEM培養基稀釋。

1.2 試劑與器材 DMEM培養基、青-鏈霉素和L-谷氨酰胺(HyClone)；基礎胎牛血清(博全生物科技有限公司)；MCT1抗體(Abcam)；Kir4.1抗體(博奧森公司)；DAPI、0.25%EDTA胰蛋白酶、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、PVDF轉移膜(0.22 μm)及細胞pH指示熒光探針BCECF-AM(重慶鼎國生物技術有限公司)；RIPA裂解液(強)、BCA蛋白定量試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(H+L)和辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG(H+L)均購自重慶碧云天科技有限公司。

2 方法

2.1 細胞培養 U251細胞和U87細胞加入含 10% 胎牛血清的DMEM培養基置于培養瓶中，放入37 ℃、5% CO2的飽和濕度培養箱中培養，2～3 d 傳代，取對數生長期的細胞用于實驗。

2.2 CCK-8實驗檢測細胞活力抑制率 取對數生長的U251和U87細胞，調整細胞數至5×108/L，以每孔100 μL接種至96孔板內，設空白組、對照組和不同藥物濃度實驗組，每組設置6個復孔，細胞貼壁后加不同濃度的Glib(12.5、25、50、100、200、400、600、800和1 600 μmol/L)，在恒溫培養箱內共培養48 h后每孔加入10 μL CCK-8溶液，2.5 h后用酶標儀檢測吸光度(A)值，計算Glib對細胞的活力抑制率，實驗重復3次，篩選出最適濃度。采用直線回歸方法計算藥物的半數抑制濃度(IC50)，通過公式計算出Glib對細胞的活力抑制率。細胞活力抑制率(%)=(對照組A值-實驗組A值)/(對照組A值-空白組A值)×100%。

2.3 劃痕實驗檢測細胞遷移能力 制備細胞懸浮液濃度為1×107/L，估計細胞在48 h后可鋪滿整個6孔板，將細胞接種于6孔板內，6孔板于實驗前用標記筆在6孔板背面劃5條橫線，不同濃度的Glib處理U251細胞和U87細胞，細胞貼壁后用200 μL槍頭垂直于背面的橫線劃痕并清洗掉下的細胞，放入37 ℃、5% CO2的飽和濕度培養箱中培養，在0 h和48 h取樣并拍照。實驗重復3次，計算細胞遷移寬度比率=(各組0 h細胞間劃痕寬度-48 h細胞間劃痕寬度)/各組0 h細胞間劃痕寬度×100%。

2.4 pH指示熒光探針檢測細胞內pH變化 制備細胞懸浮液濃度為1×109/L，不同濃度Glib處理U251和U87細胞，按體積比1∶1將濃度為3 μmol/L 的BCECF-AM加入細胞懸浮液中，37 ℃孵育60 min，共聚焦檢測光密度，參考熒光探針BCECF-AM在不同pH條件下的發射光譜，進行pH校準。

2.5 Western blot法檢測Kir4.1通道和MCT1的蛋白表達 取對數生長期的細胞，分別加入Glib共培養48 h，分組情況同“2.3”，收集細胞，RIPA裂解液提取細胞總蛋白。BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度并定量，取上樣量50 μg， SDS-PAGE分離蛋白，以濕轉方式常規轉膜至0.22 μm PVDF膜。封閉液37 ℃封閉2 h，分別加入 I 抗Kir4.1(1∶500)、MCT1(1∶1 000)和GAPDH/β-actin(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜， PBST洗膜后分別加入 II 抗孵育液(1∶6 000)37 ℃孵育30 min， PBST洗膜后ECL顯影曝光。用Image Lab軟件轉換后測定灰度值，用目的蛋白灰度值與GAPDH或β-actin的灰度值的比值作為統計值分析。

3 統計學處理

所有數據均采用SPSS 19.0軟件包進行數據分析，實驗數據均以均數±標準差(mean±SD)表示，兩組均數比較采用獨立樣本t檢驗，多組均數相互比較采用單因素方差分析，以P<0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1 CCK-8檢測結果

Glib作用細胞48 h后，對U251細胞和U87細胞的IC50分別為400.20 μmol/L和553.70 μmol/L；與對照組相比，實驗組細胞活力受到抑制，U251細胞和U87細胞的有效濃度范圍分別為100 μmol/L～1 600 μmol/L和50 μmol/L～1 600 μmol/L，且抑制率與Glib濃度呈正相關(P<0.05)。后續實驗組將分別采用100 μmol/L、300 μmol/L和500 μmol/L的Glib處理U251細胞，200 μmol/L、400 μmol/L和600 μmol/L的Glib處理U87細胞，見圖1。

Figure 1.The concentration-dependent effect of Glib on U251 and U87 cell proliferation.

圖1 Glib抑制U251和U87細胞增殖的量效關系

2 劃痕實驗檢測結果

使用100、300和500 μmol/L Glib與U251細胞共培養48 h，200、400和600 μmol/L Glib與U87細胞共培養48 h后，對照組細胞劃痕后相對遷移寬度明顯小于藥物處理組(P<0.05)，且藥物濃度越高，這種趨勢越明顯(P<0.05)，表明隨著Glib濃度增高，抑制細胞遷移能力逐漸加強，見圖2。

3 pH熒光探針檢測結果

圖3是在激發波長為488 nm的熒光強度圖，結果顯示U251和U87細胞熒光強度均隨著Glib濃度的增加而逐漸減弱(P<0.05)。據文獻[13]介紹的熒光探針BCECF-AM在不同pH條件下的發射光譜參考顯示，激發波長為488 nm可對應不同的pH值，且熒光強度越強，pH值越高，提示U251和U87細胞內pH值隨著Glib濃度的升高而下降，有濃度依賴性。

4 Western blot 實驗結果

不同濃度Glib分別處理2種細胞48 h后，Wes-tern blot結果顯示：實驗組各組Kir4.1蛋白和MCT1蛋白表達均低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；并且Kir4.1蛋白和MCT1蛋白表達與Glib濃度呈負相關(P<0.05)；實驗組兩兩之間比較，差異亦有統計學意義(P<0.05)，見圖4。

討 論

細胞內外酸堿度變化與細胞增殖生長息息相關。Parks等[14]和Koltai[15]提出在腫瘤細胞生存發展過程中，增強細胞內酸性微環境能夠促使細胞趨向死亡，而細胞外堿性環境增強則能夠誘導細胞遷移、侵襲，反過來即細胞內的堿性狀態更利于細胞增殖[16-17]。自1984年Chandy等[18]首先報道鉀離子通道是T淋巴細胞增殖的主要通道以來，大量研究顯示其與腫瘤細胞增殖密切相關，且相關實驗基本停留在其對腫瘤細胞形態學的影響方面，進一步研究甚少。本實驗利用鉀離子通道阻斷劑Glib作用于2種細胞系，一方面顯示Glib在有效濃度范圍內對膠質瘤U251細胞和U87細胞的活力具有明顯抑制作用，且隨著藥物濃度的增高，抑制作用越強；另一方面，Glib可抑制膠質瘤細胞遷移，且具有濃度依賴性；這表明Glib可以抑制膠質瘤細胞的增殖生長和遷移。實驗結果還表明Glib作用于2種細胞系后，胞內pH值下降，亦有濃度依賴性，呈負相關。這提示Glib可能影響了細胞內環境酸堿度變化從而影響膠質瘤細胞增殖生長。

細胞內酸堿度調節與眾多因素有關，細胞膜上離子流動平衡至關重要。在哺乳動物中樞神經系統中，星形細胞作為最豐富的細胞類型，對細胞膜離子和水分子的平衡進行精確調控。如果細胞膜上這些調控蛋白在細胞膜上的表達和極化方式被打亂之后，將會破壞離子和細胞容積的平衡，將進一步影響細胞的酸堿度變化和細胞增殖[19]。Kir4.1對K+具有強大的內向整流作用[9]，可誘導細胞外K+跨膜轉運至細胞內[7]，調節細胞內外離子平衡。課題組前期結果表明，與正常腦組織相比，Kir4.1高表達于膠質瘤組織[9,11-12]，且表達與其惡性程度呈正相關。在膠質瘤細胞增殖過程中，細胞膜上的Kir4.1通道開放，促使細胞外K+進入細胞內，從而激活Na+，K+-ATP酶，[Na+]i降低，這使得Na+/H+交換體1(Na+/H+exchanger-1，NHE-1)開放，調節胞外Na+進入細胞內，同時將相應的H+轉運至細胞外，從而維持新的細胞內、外電解質平衡和細胞內堿化狀態[20-21]。若抑制Kir4.1通道，抑制K+進入細胞內，促使NHE-1減弱，胞內H+增多，細胞內呈現酸性環境，發揮抑制細胞增殖作用。本實驗Western blot和pH實驗結果與上述推測吻合，提示Glib可能通過上述途徑參與抑制腫瘤細胞內堿化趨勢。

Figure 2.Effects of Glib at different concentrations on the migration of U251 cells and U87 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05，**P<0.01vs0 μmol/L group；##P<0.01vs100 μmol/L group；▲P<0.05vs300 μmol/L group；$P<0.05，$$P<0.01vs200 μmol/L group；△P<0.05vs400 μmol/L group.

圖2 不同濃度Glib對U251和U87細胞遷移的影響

此外，能量亦是腫瘤細胞增殖生長過程中的必須元素，糖酵解是其提供能量的主要方式之一。糖酵解過程產生大量的乳酸和CO2等酸性代謝產物，使細胞內呈現酸性環境[22-23]，這與細胞內酸堿度的維持亦密切相關。實驗證明腫瘤細胞外pH值低于細胞內[24]，提示細胞內及細胞膜上有相應的調控機制將其酸性物質排出體外，維持其堿性環境，利于細胞增殖。MCT家族作為腫瘤細胞中轉運乳酸和清除H+的重要跨膜蛋白[10,17]，參與維持細胞內、外電解質平衡。MCT1是MCT家族成員之一，主要參與乳酸及單羧酸的跨膜運輸[10]。本課題組發現星形細胞瘤中的MCT1表達與正常腦組織相比明顯增強，且惡性程度越高，MCT1表達越強烈[10]。腫瘤細胞在增殖生長過程中需要消耗大量的能量，而糖酵解之后，細胞膜上的MCT1需將細胞內過多的乳酸和H+轉運至細胞外，維持細胞內外離子和酸堿平衡，促進腫瘤細胞增殖[20]。本實驗Western blot實驗結果表明，通過使用Glib作用于U251和U87細胞系后，MCT1蛋白表達下調。Glib亦可能通過抑制MCT1的表達，打亂了細胞膜內外有機物和無機物的轉運平衡，從而參與抑制腫瘤細胞內堿化趨勢的形成。

Figure 3.Effects of Glib at different concentrations on the intracellular pH values of U251 cells (A) and U87 cells (B).Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L group；#P<0.05,##P<0.01vs100 μmol/L group；▲P<0.05vs300 μmol/L group；$P<0.05，$$P<0.01vs200 μmol/L group；△P<0.05vs400 μmol/L group.

圖3 不同濃度格列本脲對U251和U87細胞內pH的影響

Figure 4.Effects of Glib at different concentrations on the protein expression of Kir4.1 and MCT1 in U251 cells (A) and U87 cells (B). Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L group;##P<0.01vs100 μmol/L group;▲P<0.05vs300 μmol/L group;$P<0.05,$$P<0.01vs200 μmol/L group;△P<0.05vs400 μmol/L group.

圖4 不同濃度格列本脲對U251和U87細胞中Kir4.1和MCT1蛋白表達的影響

綜上所述，本實驗使用鉀離子通道阻滯劑Glib作用于2個細胞系，從細胞酸堿度角度闡釋Glib對U251和U87細胞活力的抑制作用及其可能的機制，為臨床實驗提供實驗數據。然而，細胞內代謝機制復雜，抑制機制路徑眾多，尚需進一步的實驗研究方能給出清晰明確的結論。

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(責任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Effect of glibenclamide on viability and acid-base equilibrium of glioblastoma cells

GUO Ling, SHENG Hua-jun, LIU Qian, YANG Qing-hua, ZHU Shu-juan

(TeachingandResearchSectionofHumanAnatomy,CollegeofBasicMedicine,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China.E-mail:zhushujuan75@126.com)

AIM: To investigate the effect of glibenclamide (Glib) on the viability and acid-base equilibrium of glioblastoma cells. METHODS: U251 cells and U87 cells were treated with Glib at different concentrations. The inhibitory rates were detected by CCK-8 assay. The effective dose was screened and the experiment was divided into control group and drug treatment groups. The migration ability was monitored by wound healing assay, and intracellular pH was detected by pH indicator fluorescent probe. The protein expression levels of inwardly-rectifying potassium channel 4.1 (Kir4.1) and monocarboxylate transport protein 1 (MCT1) were determined by Western blot. RESULTS: The half maximal inhibitory concentrations (IC50) of Glib for 48 h exposure of U251 cells and U87 cells were 400.20 μmol/L and 553.70 μmol/L， respectively. The effective inhibition doses of Glib for U251 cells were from the ranges of 100 μmol/L to 1 600 μmol/L， and those for U87 cells were from 50 μmol/L to 1 600 μmol/L in a concentration-dependent manner (P<0.05). Glib not only inhibited the migration (P<0.05) of U251 cells and U87 cells, which was negatively correlated with drug concentration (P<0.05), but also reduced the intracellular fluorescence intensity in experimental group (P<0.05), suggesting that with the increase in drug concentration, the intracellular pH decreased gradually (P<0.05). The protein expression of Kir4.1 and MCT1 was down-regulated by treatment with Glib, and was negatively correlated with concentration of Glib. CONCLUSION: Glib, a kind of potassium channel blocker, induces intracellular acidification via down-regulating the expression of Kir4.1 and MCT1, thus inhibiting the growth of glioblastoma in a certain dose range.

Glibenclamide; Glioblastoma; Cell viability

1000- 4718(2017)08- 1405- 06

2017- 01- 06

2017- 04- 24

國家自然科學基金資助項目(No. 81502161)；重慶市科委基礎與前沿資助項目(No. cstc2014jcyjA10028)；重慶醫科大學基礎醫學院資助項目(No. 2013-5)

R739.41； R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.08.010

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