KLF15在人肺腺癌中表達的臨床意義*

劉曉妍， 周利能， 張 蕾， 蔡興東

(暨南大學附屬第一醫院呼吸內科， 廣東 廣州 510630)

KLF15在人肺腺癌中表達的臨床意義*

劉曉妍△， 周利能， 張 蕾， 蔡興東

(暨南大學附屬第一醫院呼吸內科， 廣東 廣州 510630)

目的： Krüppel樣因子15(Krüppel-like factor 15，KLF15)參與腫瘤的增殖、侵襲和轉移，但在肺腺癌中的表達和作用尚不明確。本研究探索KLF15蛋白在肺腺癌患者中的表達及其臨床意義。方法: 收集我院4例肺腺癌組織及匹配的癌旁組織，Western blot分析這些組織中KLF15蛋白表達的差異。同時收集我院72例肺腺癌患者的腫瘤組織標本及臨床資料，免疫組織化學染色分析患者肺癌標本中KLF15蛋白的表達，分析其表達與患者臨床特征包括預后的關系。另外，采用質粒轉染的方法上調肺腺癌A549細胞中KLF15的表達，CCK-8法分析KLF15蛋白對肺腺癌細胞增殖能力的影響。結果: 在4例肺腺癌及匹配的癌旁組織中，肺腺癌組織中KLF15蛋白表明顯低于癌旁組織。在72例肺腺癌病理標本中，KLF15蛋白低表達或不表達者53例，占73.6%，KLF15高表達者19例，占26.4%。KLF15蛋白高表達的患者，其5年生存率明顯優于KLF15低表達的患者(P<0.01)；KLF15蛋白表達與肺腺癌患者的病理分期(P<0.01)及T分期明顯相關(P<0.01)，KLF15蛋白低表達是肺腺癌患者不良預后的重要危險因素。上調肺腺癌細胞中KLF15蛋白的表達可明顯抑制肺腺癌細胞的生長。 結論: KLF15抑制肺腺癌細胞的生長，有望成為肺腺癌患者的治療靶點和預后分子標志物。

肺腺癌； Krüppel 樣因子15； 細胞增殖； 預后

Krüppel樣因子(Krüppel-like factors, KLFs) 是Sp1/KLFs家族中的一個亞家族，通過與富含GC序列元件的基因的啟動子區結合而發揮調節作用，在細胞生長、分化、凋亡、死亡等生理過程中發揮重要的調節作用，并參與細胞的基因重編程。2000年，Uchida等[1]利用酵母單雜交試驗，用來篩選人類腎臟cDNA文庫，鑒定出一個GA位點結合蛋白，一個新的Cys2-His2 鋅指基因，命名為腎臟富含的Krüppel樣因子，后命名為KLF15。KLF15參與人類脂肪形成及代謝[2-3]、糖代謝[4-5]、心肌肥大的調控[6]和軟骨成骨調控[7]等。研究發現，KLF15能夠抑制KRAS驅動基因介導的細胞生長[8]，抑制乳腺癌細胞的增殖能力且與乳腺癌患者的預后相關[9]，然而KLF15在人肺腺癌中表達狀況和臨床意義如何？國內外尚無文獻報道。因此，本研究通過分析KLF15在人肺腺癌中表達及其與患者臨床特征(包括預后的關系)以及上調KLF15對肺腺癌細胞生長的影響，為探索KLF15能否作為肺腺癌的治療靶點和預后分子標志物提供科學依據。

材 料 和 方 法

1 患者資料、病理標本收集和隨訪

收集暨南大學附屬第一醫院2009年1月～2012年12月病理確診的肺腺癌組織石蠟標本72例并對患者進行4～6年的隨訪。收集患者年齡、性別、TNM分期(T： tumor，腫瘤大小及局部浸潤范圍； N： node，淋巴結受累情況； M： metastasis，遠處轉移)[10]等臨床病理資料，以免疫組織化學染色分析患者確診時石蠟包埋病理切片中KLF15蛋白的表達；收集我院4例肺腺癌患者新鮮腫瘤組織和匹配的癌旁組織，Western blot檢測肺腺癌組織中KLF15蛋白表達。4例患者均為男性，2例為Ib期，2例為IIa期，術后病理確診為肺低分化腺癌，取腫瘤組織大小約1 cm為癌組織，距腫瘤外緣3 cm外肺組織為癌旁組織。收集患者腫瘤組織前獲得患者知情并簽署知情同意書。統計肺腺癌腫瘤組織中KLF15蛋白表達與臨床病理特征的關系。肺腺癌患者的臨床病理特征資料見表1。

2 免疫組織化學染色和分析

肺腺癌患者石蠟包埋組織中KLF15蛋白檢測采用鏈霉親和素-過氧化物酶(streptavidin-peroxidase，SP)法染色分析，以KLF15抗體(Sigma，8 mg/L)檢測標本中KLF15蛋白的表達，按康為世紀SP試劑盒提供說明進行檢測。KLF15蛋白在肺腺癌切片中表達強度參考文獻[11]評定，染色強度評分如下：0分(無染色)，1分(輕度染色：淺黃色)，2分(中度染色：黃棕色)，3分(重度染色：棕色)。染色陽性細胞數評分如下：0分(無染色陽性細胞)，1分(<10%陽性細胞)，2分(10%～50%陽性細胞)，3分(>50%陽性細胞)。KLF15蛋白表達強度以染色指數=染色陽性細胞數×染色強度來評價。以log-rank檢驗結果判定KLF15蛋白表達最佳截斷值，其中染色指數≤4為低表達，>4為高表達。

表1 72例肺腺癌患者臨床病理特征

Table 1.Clinicopathologic characteristics of 72 cases of patients with lung adenocarcinoma

CharacteristicsData[n(%)]Age(year) ≤6528(38．9) >6544(61．1)Sex Male32(44．4) Female40(55．6)Differentiation Poor30(41．7) Moderate28(38．9) Well14(19．4)Pathologicalstage ⅠA14(19．4) ⅠB25(34．6) ⅡA4(5．6) ⅡB13(18．1) ⅢA10(13．9) ⅢB2(2．8) Ⅳ4(5．6)Tclassification T117(23．6) T247(65．3) T33(4．2) T45(6．9)Nclassification N039(54．2) N117(23．6) N212(16．6) N34(5．6)Mclassification M068(83．3) M14(16．7)Smoking Yes41(56．9) No31(43．1)KLF15expression Low53(73．6) High19(26．4)Vitalstatus Death28(38．9) Alive44(61．1)

3 肺腺癌組織及腺癌細胞總蛋白提取及Western blot檢測

4例新鮮肺腺癌組織及匹配的癌旁組織及A549細胞中總蛋白的提取采用BestBio快速蛋白提取試劑盒提取。 KLF15蛋白表達采用Western blot檢測，蛋白分離以十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠(10%)電泳后轉印于PVDF膜(Millipore)上。以5%的脫脂牛奶封閉，后以兔抗KLF15抗體(1∶200； Sigma)和兔抗GAPDH抗體(1∶2 500；康為世紀)4 ℃孵育過夜，然后以含0.1% 吐溫20的PBS(PBST)洗膜3～5次，每次5 min。 繼之以辣根過氧化物酶交聯的山羊抗兔II抗(1∶3 000； 康為世紀)室溫孵育1 h，PBST洗膜3～5次后以ECL發光液(康為世紀)進行顯色，凝膠電泳成像儀拍照保存進行分析。

4 細胞培養、質粒轉染及CCK-8檢測

人肺腺癌細胞株A549購于中國科學院上海細胞庫。細胞株培養用含有10%胎牛血清(Gibco BRL)、1×105U/L青霉素及100 mg/L鏈霉素的DMEM(Gibco BRL)完全培養基，并置于37 ℃、含5% CO2的培養箱中培養。重組人全長KLF15(NM_031918)cDNA質粒pcDNA3.1(+)-KLF15及對照空質粒pcDNA3.1(+)均購自GeneCopoeia。上述質粒通過PolyJetTM轉染試劑轉染至A549細胞，轉染步驟參考PolyJet說明書。轉染72 h后提取細胞總蛋白，Western blot檢測KLF15表達成功后，以每孔8×104接種于96孔板中繼續培養，分別于0、12、24、48和72 h加入CCK-8(Dojindo)，酶標儀檢測吸光度(A)并統計其差異。

5 統計學處理

以SPSS 16.0軟件進行數據統計分析。KLF15蛋白表達不同組預后的差異以Kaplan-Meier法和log-rank 檢驗分析；單因素和多因素Cox回歸模型分析肺腺癌患者不良預后的危險因素。腫瘤最大徑在KLF15蛋白表達不同組間差異采用Student’st檢驗；Mann-WhitneyU檢驗分析KLF15蛋白表達與患者臨床特征的關系；單因素方差分析統計KLF15上調前后各組細胞不同時點A值的差異。組間計量資料以均數±標準差(mean±SD)表示。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 KLF15蛋白在肺腺癌和癌旁組織中的表達

免疫組織化學染色分析顯示，在72例臨床資料完整的肺腺癌腫瘤組織標本中，KLF15蛋白低表達或不表達者53例，占73.6%，KLF15高表達者19例，占26.4%，而KLF15表達主要定位于腫瘤細胞包漿中，以細胞核周圍最明顯。在4例肺腺癌患者新鮮腫瘤組織及匹配的癌旁組織中，Western blot分析顯示，癌旁組織中KLF15蛋白表達明顯高于其在癌組織中的表達，見圖1。

Figure 1.The expression of KLF15 protein in lung adenocarcinoma and adjacent tissues. A： representative images from 72 cases of lung adenocarcinoma with negative, moderate and strong immunostaining of KLF15 protein detected by immunohistochemistry； B： Western blot analysis of KLF15 protein expression in lung adenocarcionoma tissues (T: tumor) and its matched adiacent tissues (N: normal).

圖1 KLF15在肺腺癌組織中及匹配的癌旁組織中的表達對比

2 KLF15表達與肺腺癌患者的預后

Log-rank檢驗結果顯示，KLF15蛋白高表達組5年累積生存率明顯優于KLF15蛋白低表達組(P<0.05)。Kaplan-Meier法分析結果顯示，KLF15蛋白高表達組患者，其5年累積生存率為53.54% (95% CI:0.486～0.873)，而KLF15蛋白低表達組，其5年累積生存率為37.68% (95% CI: 0.325～0.474)，見圖2。

Figure 2.The correlation between KLF15 protein expression and the overall survival time of the patients with lung adenocarcinoma.

圖2 KLF15蛋白的表達與肺腺癌患者總體生存時間的關系

3 肺腺癌患者預后不良的主要危險因素回歸分析

對患者的臨床資料，包括年齡、性別、吸煙、腫瘤大小、病理分期、分化程度、TNM分期以及KLF15蛋白表達高低進行回歸分析，單因素Cox回歸分析顯示： KLF15蛋白表達、肺腺癌的分化程度、病理分期及TNM分期均為影響患者預后的危險因素，其中以KLF15蛋白表達及腫瘤遠處轉移尤為明顯(P<0.01)；多因素Cox回歸分析顯示，KLF15蛋白低表達和遠處轉移是導致肺腺癌患者預后不良的主要危險因素，見表2。

4 KLF15表達與肺腺癌患者的病理分期、T分期及腫瘤大小相關性分析

通過Mann-WhitneyU檢驗分析KLF15蛋白表達高低與患者年齡、性別、分化程度、病理分期和TNM分期的相關性，結果顯示KLF15蛋白表達高低與肺腺癌患者的病理分期和T分期明顯相關(表3)。通過分析不同KLF15蛋白表達組腫瘤最大徑的差異，顯示KLF15蛋白高表達組患者腫瘤最大徑為(2.870±0.408) cm，低表達KLF15的患者腫瘤最大徑為(5.165±2.173) cm，見圖3。

5 上調KLF15蛋白的表達對A549細胞增殖能力的影響

通過瞬時過表達質粒轉染技術，在A549肺腺癌細胞中上調KLF15蛋白的表達，結果發現：上調KLF15蛋白表達明顯抑制了A549細胞的增殖能力，見圖4。

表2 Cox回歸模型單因素和多因素分析肺腺癌患者不良預后的危險因素

表3 肺腺癌患者臨床特征與KLF15表達的相關性分析

Table 3.The correlation between KLF15 protein expression and clinical characteristics of patients with lung adenocarcinoma

CharacteristicsKLF15expressionP(Mann?WhitneyUtest)LowornoneHighAge(year) ≤652170．832 >653212Sex Male21110．172 Female328Smoking No2650．678 Yes2714Differentiation Noneorpoor2280．964 Moderateorwell3111Pathologicalstage Ⅰ2712<0．01 Ⅱ125 Ⅲ102 Ⅳ31Tstage T1116<0．001 T2407 T321 T450Nstage N027120．363 N1?3267Mstage M060180．959 M131

Figure 3.The difference of maximum tumor dimension between KLF15 high and low expression groups in patients with lung adenocarcinoma. Mean±SD.**P<0.01vsKLF15 high expression.

圖3 肺腺癌患者腫瘤最大徑在KLF15蛋白高低表達組的差異

Figure 4.The effects of up-regulation of KLF15 on the proliferation of A549 cells. A： Western blot analysis showed up-regulation of KLF15 in A549 cells by transfection with pcDNA3.1(+) and pcDNA3.1(+)-KLF15 vector, which named mock and KLF15 cDNA, respectively； B： CCK-8 assay showed that enhanced expression of KLF15 significantly inhibited the proliferation of A549 cells compared with the cells transfected with mock vector. Mean±SD.n=3.

圖4 上調KLF15蛋白的表達對A549細胞增殖能力的影響

討 論

Krüppel樣因子參與細胞的多種生物學過程。Wade等[12]在T47D乳腺癌細胞中，通過人工合成孕酮R5020刺激細胞富集孕酮受體靶基因，發現KLF15能夠被孕酮受體誘導產生，并能夠結合于E2F1富含GC的啟動子區，提示KLF15可作為轉錄因子發揮作用。KLF15能夠抑制子宮內膜癌Ishikawa細胞增殖，在子宮上皮細胞的黃體酮細胞周期中作為重要下游抑制性生理調節因子[13]。Yoda等[9]研究發現，在54例侵潤性乳腺導管癌中，KLF17可表達于癌癥細胞的胞漿及細胞核內，KLF15核表達的患者預后較好。在乳腺癌細胞中，KLF15在胞漿中低表達；上調KLF15的表達后，導致KLF15在乳腺癌細胞核內集聚，并抑制細胞的增殖能力，誘導細胞G0/G1細胞周期阻滯。該研究進一步發現，KLF15核表達誘導細胞周期蛋白P21表達增加，提示KLF15可能通過上調P21蛋白進而導致細胞周期阻滯在G0/G1期。本研究結果顯示，KLF15主要表達于肺腺癌細胞的胞漿中，以核周圍明顯，核內表達不明顯，與Yoda等[9]的研究結果不同。這可能是由于KLF15被癌基因表達的蛋白結合致體積增大或是KLF15蛋白修飾發生不利于通過核膜上微孔轉運，導致KLF15蛋白在核膜周圍聚集。此外，也可能是由于KLFs家族成員的功能不是固定不變的，在不同的細胞類型、不同組織中分布不同，功能不盡相同，且轉錄后調控也不同所致[14]。

本研究結果表明KLF15在肺腺癌中低表達，低表達KLF15的肺腺癌患者，其5年累積生存率明顯低于KLF15蛋白高表達組患者，提示KLF15在肺腺癌中作為抑癌基因起作用。通過Cox多因素回歸分析發現KLF15低表達是肺腺癌患者預后不良的主要危險因素；KLF15蛋白低表達的患者死亡風險較高表達KLF15患者增加4.154倍。這些研究結果表明KLF15是肺腺癌重要的抑癌基因，可作為肺腺癌患者預后的分子標志物。

MicroRNA-4262負性調控KLF15 mRNA的表達，進而促進乳腺癌細胞的增殖和侵襲能力[15]，而在卵巢中，microRNA-376a通過靶向抑制KLF15的表達促進卵巢癌細胞增殖和轉移能力[16]，這些結果提示KLF15可能抑制腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移能力。通過統計分析肺腺癌患者腫瘤組織中KLF15蛋白表達與臨床特征的關系，本實驗結果發現KLF15蛋白表達與患者的病理分期及T分期相關，進一步分析KLF15蛋白表達與患者腫瘤最大直徑的差異，結果顯示KLF15蛋白低表達的肺腺癌患者，其腫瘤最大徑明顯高于KLF15蛋白高表達的肺腺癌患者，提示KLF15抑制肺腺癌細胞的增殖。為了體外驗證KLF15蛋白的功能，本實驗通過質粒轉染技術和CCK-8法，檢測上調KLF15前后A549細胞增殖能力的差異，結果顯示上調KLF15蛋白表達后明顯抑制了細胞的增殖能力，結合臨床統計數據結果，我們的研究表明KLF15抑制了肺腺癌細胞的增殖能力。

總之，本研究顯示，KLF15蛋白在肺腺癌患者中表達明顯下調，KLF15蛋白低表達的患者預后不良，而且KLF15蛋白低表達是肺腺癌患者預后不良的重要預測因子。KLF15蛋白表達與腫瘤患者的臨床病理分期和T分期相關，高表達KLF15蛋白明顯抑制肺腺癌細胞的增殖。本研究為KLF15作為肺腺癌調控靶點和預后分子標志物提供了理論依據。

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(責任編輯： 林白霜， 羅 森)

Clinical significance of KLF15 expression in human lung adenocarcinoma

LIU Xiao-yan, ZHOU Li-neng, ZHANG Lei， CAI Xing-dong

(DepartmentofRespiratoryMedicine,TheFirstAffiliatedHospitalofJinanUniversity,Guangzhou510630,China.E-mail: 2514437568@qq.com)

AIM: To explore the clinical significance of Krüpple-like factor 15 (KLF15) protein expression in the patients with lung adenocarcinoma for exploring the therapeutic and prognositic biomarkers of lung cancer. ME-THODS: Four cases of lung adenocarcinoma tissues and matched adjacent tissues were collected from our hospital, and the expression of KLF15 protein in these tissues was analyzed by Western blot. At the same time, 72 cases of archived paraffin-embedded samples and clinical data of the patients with lung adenocarcinoma were also collected. The KLF15 protein expression in the archived paraffin-embedded lung adenocarcinoma samples was detected by immunohistochemical staining. The correlations between KLF15 protein expression and clinical characteristics of the patients including prognosis were also analyzed. In addition, the KLF15 protein was up-regulated in A549 cells, and then the effects of KLF15 protein on the viability of the cells were measured by CCK-8 assay. RESULTS: The protein expression of KLF15 in the 4 cases of lung adenocarcinoma tissues was significantly lower than that in matched paracancerous tissues. Fifty-three cases of lung adenocarcinoma specimens showed low expression or no expression of KLF15 protein in total 72 cases (73.6%). The 5-year survival rate of the patients with high expression of KLF15 protein in their specimens was higher than that of the patients with the low expression of KLF15 protein (P<0.01), and the expression of KLF15 protein was significantly correlated with the pathological staging (P<0.01) and T stage (P<0.01) of the patients with lung adenocarcinoma. Furthermore, the low expression of KLF15 protein was an important poor prognostic indicator of the patients. Up-regulation of KLF15 protein in the A549 cells significantly inhibited the growth of the cells. CONCLUSION: KLF15 inhibits the growth of lung adenocarcinoma cells. It could be used as a therapeutic target and a prognostic biomarker for the patients with lung adenocarcinoma.

Lung adenocarcinoma; Krüppel-like factor 15; Cell proliferation; Prognosis

1000- 4718(2017)08- 1411- 06

2017- 01- 16

2017- 03- 15

國家自然科學基金青年基金資助項目(No.81302030)

R730.23； R734.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.08.011

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