山柰酚通過Wnt/β-catenin信號通路抑制HBx-HepG2細胞增殖、侵襲及遷移*

黃茂莘， 陳 玲， 韓鵬定， 林詩可

(海南省農墾總醫院藥學部， 海南 海口 570311)

山柰酚通過Wnt/β-catenin信號通路抑制HBx-HepG2細胞增殖、侵襲及遷移*

黃茂莘△， 陳 玲， 韓鵬定， 林詩可

(海南省農墾總醫院藥學部， 海南 海口 570311)

目的： 探討山柰酚對HBx-HepG2 細胞增殖、侵襲及遷移的影響，并研究其潛在分子作用機制。方法： 利用實時熒光定量PCR檢測相關基因的表達水平，利用蛋白印跡實驗檢測相關蛋白的水平，流式細胞術檢測細胞的凋亡率，MTT實驗和平板集落形成實驗檢測細胞的增殖，Transwell侵襲實驗和劃痕愈合實驗檢測細胞的侵襲和轉移。結果： 山柰酚(10～200 μmol/L)能夠劑量和時間依賴性地抑制HBx-HepG2 細胞的增殖。山柰酚(100 μmol/L)能顯著抑制HBx-HepG2細胞的集落形成數量、細胞侵襲能力以及細胞愈合率，誘導HBx-HepG2細胞凋亡，引起cleaved caspase-3、cleaved caspase-9及Bax蛋白水平上升，Bcl-2蛋白水平下降，降低β-catenin、c-Myc 和 cyclin D1 mRNA及蛋白的表達水平。山柰酚(100 μmol/L)同時能夠降低p-GSK-3β蛋白水平以及細胞質和細胞核中的β-catenin蛋白水平，對GSK-3β蛋白水平沒有影響。 LiCl處理能夠反轉山柰酚(100 μmol/L)對HBx-HepG2細胞的增殖、侵襲以及遷移抑制作用。結論： 山柰酚對HBx-HepG2 細胞的增殖、侵襲及轉移有顯著的抑制作用，這種抑制作用很有可能是通過抑制Wnt/β-catenin 信號通路的活性來實現的。

HBx-HepG2細胞; 山柰酚; 細胞增殖; 細胞侵襲; 細胞遷移; Wnt/β-catenin信號通路

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是我國最常見的惡性腫瘤之一，研究發現慢性乙肝病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是肝細胞癌發病的重要原因之一[1]。HBV編碼的HBx 蛋白與HCC的發展有著密切的聯系[2]。山柰酚(kaempferol)是屬于黃酮類的一種化合物，主要來源包括姜科植物山柰及小檗科植物窩兒七的莖和根[3]。現有的研究發現山柰酚可以通過不同分子機制抑制不同種類的腫瘤細胞增殖并且可以誘導腫瘤細胞的凋亡[4]，但未有山柰酚對HBx-HepG2細胞影響的報道。本研究首次探討了山柰酚對HBx-HepG2細胞增殖、侵襲及遷移的影響，并研究其潛在的分子機制。

材 料 和 方 法

1 主要材料

山柰酚購于Sigma；HBx-HepG2細胞購于上海中科院細胞庫；胎牛血清和RPMI-1640培養液購自HyClone；各種基因qRT-PCR的引物購自上海吉瑪生物科技有限公司；TRIzol試劑購于Invitrogen；細胞核蛋白與細胞漿蛋白抽取試劑盒購于Beyotime;蛋白印跡實驗所用的 I 抗和 II 抗均購于Cell Signaling Technology。

2 主要方法

2.1 細胞培養 利用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養液培養HBx-HepG2 細胞，培養條件為5% CO2、37 ℃細胞培養箱內常規培養，消化傳代。于6孔板里每孔接種2×105個細胞，利用不含雙抗的含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養液培養24 h，當細胞融合率達到80%時，將細胞用不同濃度的山柰酚處理，用于后面各項實驗。

2.2 實時熒光定量PCR檢測山柰酚處理后細胞的不同基因的表達水平 利用山柰酚(100 μmol/L)或正常培養液處理HBx-HepG2 細胞48 h后，用TRIzol溶劑提取mRNA, 提取的mRNA逆轉錄成cDNA, 采用熒光定量PCR儀器擴增β-catenin、c-myc以及cyclin D1目的片段。這些基因的表達水平以GAPDH為內參照，采用2-ΔΔCt方法計算，每組設3個復孔，實驗重復3次。

2.3 MTT法檢測HBx-HepG2的細胞活力 利用不同濃度山柰酚(10～200 μmol/L)或正常細胞培養液分別處理HBx-HepG2細胞24 h、48 h 及72 h后，將處理的HBx-HepG2細胞每孔加入20 μL MTT溶液繼續孵育4 h后，吸棄孔內培養上清夜，然后于每孔加入150 μL DMSO，利用酶聯免疫標記分析儀測量每孔在570 nm波長的吸光度來計算細胞活力。

2.4 平板集落形成實驗 (colony formation assay) 利用山柰酚(100 μmol/L)、正常培養液或100 μmol/L山柰酚+1 mmol/L LiCl(Wnt/β-catenin 信號通路的激活劑)處理HBx-HepG2 細胞48 h后，將HBx-HepG2于每孔2 mL接種于6孔培養板，常規培養10 d, 每組設3個復孔，實驗重復3次。每隔3 d更換新鮮培養液繼續培養，培養10 d 后，棄掉培養液后利用生理鹽水洗滌3次，常溫空氣中干燥后利用75%乙醇固定細胞15 min, 然后利用0.5%結晶紫染色2 h，將染色的細胞在顯微鏡下觀察拍照，計算形成的集落數量。

2.5 Transwell侵襲實驗 將Matrigel 按每孔40 μL 均勻鋪在 Transwell 小室膜上。將用山柰酚(100 μmol/L)、正常培養液或山柰酚(100 μmol/L)+ LiCl(1 mmol/L)處理48 h后的HBx-HepG2 細胞用無血清RPMI-1640培養基重懸，吸取100 μL懸液加到小室的上層，下層加入500 μL含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養液，5% CO2、37 ℃細胞培養箱內常規培養24 h后，將不鋪膠的小室取出，利用PBS洗滌3次后再利用4%的多聚甲醛固定20 min, 然后利用結晶紫染色30 min，揭下Transwell小室膜反貼在載玻片上。在顯微鏡下計數每膜上下左右中5個隨機不同視野的穿膜細胞數，每組設3個孔，實驗重復3次。

2.6 劃痕愈合實驗 利用山柰酚(100 μmol/L)、正常培養液或山柰酚(100 μmol/L)+LiCl(1 mmol/L)處理HBx-HepG2 細胞48 h后，將細胞接種于6孔板中，24 h常規培養后吸棄培養基，用PBS洗滌3次，用20 μL 槍頭在每孔細胞中均勻劃3條橫線(每隔1 cm劃1條)，橫穿過孔。然后在含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養液，5% CO2、37 ℃細胞培養箱內常規培養48 h 分別進行顯微鏡觀察和拍照，計算融合率。劃痕融合率(%)=(Area0 h-Area48 h)/Area0 h×100%, Area 表示未愈合面積。

2.7 流式細胞術檢測細胞凋亡 利用山柰酚(100 μmol/L)或者正常培養液處理HBx-HepG2 細胞48 h后，將細胞利用PBS洗滌3次，然后加入70%冷乙醇固定后收集細胞，將收集的細胞利用PBS洗滌去除固定液，然后加入RNA酶,反應過夜，再利用Annexin V-FITC/PI 對細胞進行雙染色，然后利用流式細胞儀對細胞凋亡率進行分析。

2.8 蛋白印跡實驗 利用山柰酚(100 μmol/L)或者正常培養液處理HBx-HepG2 細胞48 h后，利用含有蛋白酶抑制劑的RIPA緩沖液裂解細胞提取蛋白,用細胞核蛋白與細胞漿蛋白抽提試劑盒分離細胞核和細胞漿蛋白。取25 μg等量蛋白上樣，利用10% SDS-PAGE，將電泳后的蛋白轉移至醋酸纖維素膜，用含有5%脫脂奶粉的TBST溶液于室溫封閉1 h,然后用TBST 洗滌5 min,洗滌3次。然后將醋酸纖維素膜分別與不同的 I 抗(抗cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、Bcl-2、Bax、β-catenin、c-Myc、cyclin D1、p-GSK-3β、GSK-3β、α-tubulin、lamin A及β-actin抗體)4 ℃孵育過夜。將I抗孵育后的抗體利用TBST洗滌3次，再跟辣根過氧化物酶標記的II抗于室溫孵育1 h。醋酸纖維素膜進行曝光顯影，利用凝膠成像儀器對各顯色條帶的灰度值進行測量，以β-actin為內參照計算各個目的蛋白的相對表達水平。

3 統計學處理

采用GraphPad Prism 6.0軟件進行數據分析。所有數據以均數±標準差(mean±SD)表示，組與組之間的比較采用Studentt檢驗分析。以P<0.05為差異有統計學顯著性。

結 果

1 山柰酚對HBx-HepG2 細胞活力的影響

用不同濃度的山柰酚分別處理HBx-HepG2 細胞24 h、48 h 及72 h，然后利用MTT實驗檢測了HBx-HepG2細胞的活力。MTT結果顯示山柰酚可抑制HBx-HepG2細胞活力，并呈劑量依賴性及時間依賴性，24 h、48 h及72 h處理后的IC50分別為101.8 μmol/L、98.3 μmol/L和73.5 μmol/L,見圖1。

2 山柰酚對HBx-HepG2細胞生長、侵襲及遷移的影響

山柰酚(100 μmol/L)處理HBx-HepG2 細胞48 h后，分別利用集落形成實驗、細胞侵襲實驗及愈合實驗檢測HBx-HepG2細胞的生長、侵襲及遷移。集落形成實驗結果顯示，與對照組相比，山柰酚處理HBx-HepG2 細胞48 h 后能夠顯著抑制集落形成的數量(P<0.01)；細胞侵襲實驗結果顯示，山柰酚處理HBx-HepG2 細胞48 h后能夠減少侵襲細胞的數量，與對照組相比差異有統計學顯著性(P<0.05);細胞愈合實驗結果顯示山柰酚處理HBx-HepG2 細胞48 h后能夠降低愈合率，并且與對照組相比差異有統計學顯著性(P<0.05),見圖2。

Figure 1.The effect of kaempferol on the viability of the HBx-HepG2 cells. The viability of the HBx-HepG2 cells treated with kaempferol (10～200 μmol/L) for 24 h， 48 h and 72 h was measured by MTT assay. Mean±SD.n=3.

圖1 山柰酚對HBx-HepG2 細胞活力的影響

Figure 2.The effect of kaempferol on the growth, invasion and migration of HBx-HepG2 cells. A: the growth of HBx-HepG2 cells after kaempferol (100 μmol/L) or vehicle treatment for 48 h was measured by colony formation assay; B: the invasion ability of HBx-HepG2 cells after kaempferol (100 μmol/L) or vehicle treatment for 48 h was measured by Transwell invasion assay; C: the migration ability of HBx-HepG2 cells after kaempferol (100 μmol/L) or vehicle treatment for 48 h was measured by wound healing assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vskaempferol (0 μmol/L) group.

圖2 山柰酚對HBx-HepG2 細胞生長、侵襲及遷移的影響

3 山柰酚對HBx-HepG2細胞凋亡的影響

用山柰酚(100 μmol/L)處理HBx-HepG2 細胞48 h后，用流式細胞術檢測HBx-HepG2細胞的凋亡率。與對照組相比，山柰酚處理HBx-HepG2 細胞48 h 后能顯著增加細胞的凋亡率(P<0.05)。進一步的蛋白印跡實驗檢測了凋亡通路相關蛋白，包括cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、Bcl-2及Bax,與對照組相比，山柰酚處理HBx-HepG2 細胞48 h后能夠顯著增加cleaved caspase-3、cleaved caspase-9和Bax蛋白的水平，同時降低Bcl-2蛋白的表達水平 (P<0.05),見圖3。

Figure 3.The effect of kaempferol on the apoptosis of the HBx-HepG2 cells. A: the apoptosis of HBx-HepG2 cells after kaempferol (100 μmol/L) or vehicle treatment for 48 h was analyzed by flow cytometry; B: the expression levels of apoptosis-related proteins， cleaved caspase-3, cleaved caspase-9, Bcl-2 and Bax， in the HBx-HepG2 cells after kaempferol (100 μmol/L) or vehicle treatment for 48 h was measured by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vskaempferol (0 μmol/L) group.

圖3 山柰酚對HBx-HepG2細胞凋亡的影響

4 山柰酚對HBx-HepG2細胞Wnt/β-catenin信號通路的影響

用山柰酚(100 μmol/L)處理HBx-HepG2 細胞48 h后，RT-qPCR 和蛋白印跡實驗分別檢測Wnt/β-catenin信號通路相關基因的mRNA及蛋白表達水平。與對照組相比，山柰酚處理HBx-HepG2 細胞48 h后能夠顯著降低β-catenin、c-Myc 和 cyclin D1 mRNA及蛋白的表達水平(P<0.05)，進一步的實驗發現山柰酚處理HBx-HepG2 細胞48 h后能夠顯著降低p-GSK-3β的蛋白水平 (P<0.05)，對GSK-3β的蛋白水平沒有影響。山柰酚能夠降低細胞質中β-catenin蛋白水平,同時對細胞核中的β-catenin蛋白水平的降低更為明顯，見圖4。

5 山柰酚對LiCl處理的HBx-HepG2細胞生長、侵襲以及遷移的影響

用山柰酚(100 μmol/L)或山柰酚(100 μmol/L)+ LiCl(1 mmol/L)處理HBx-HepG2 細胞48 h后, 分別利用集落形成實驗、細胞侵襲實驗及愈合實驗檢測HBx-HepG2細胞的生長、侵襲及遷移。100 μmol/L山柰酚+1 mmol/L LiCl處理HBx-HepG2 細胞48 h后能夠顯著促進細胞的生長、侵襲及遷移，與100 μmol/L山柰酚組相比差異有統計學顯著性(P<0.05)，見圖5。

討 論

肝癌是中國最常見的腫瘤之一，研究發現HBx基因是HBV基因組中最小的開放讀碼框，其所編碼的HBx蛋白在肝細胞的惡性轉化以及癌變起著重要的作用[2]。HBx蛋白可以作為一種反式激活因子激活多種信號通路，這些信用通路包括MAPK、PI3K-Akt、Ras、Notch/Jagged和Src等，從而影響細胞周期、細胞凋亡以及細胞增殖等[5]。

最近的研究發現山柰酚在不同類型的腫瘤細胞中通過不同的機制抑制細胞的增殖。山柰酚可以通過抑制上皮間質轉化從而抑制乳腺癌細胞的遷移[6]。Lee等[7]發現山柰酚可以通過阻斷EGFR相關的信號通路來抑制胰腺癌細胞的增殖和遷移。Cho等[8]研究發現山柰酚通過引起G1和G2/M 細胞周期阻滯，從而抑制大腸癌細胞增殖。本研究發現山柰酚能夠抑制HBx-HepG2 細胞的增殖、侵襲以及遷移。進一步的流式細胞實驗發現山柰酚能夠誘導細胞凋亡，而誘導細胞凋亡的機制可能是通過增加cleaved caspase-3、cleaved caspase-9和Bax蛋白水平，同時降低Bcl-2蛋白表水平誘導細胞凋亡。這些結果提示山柰酚很有可能通過誘導細胞凋亡從而抑制HBx-HepG2細胞的增殖。本研究的結果與Song等[9]的研究結果一致，該研究發現山柰酚可以通過增加cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、Bax 蛋白水平同時降低Bcl-2蛋白水平來誘導胃癌細胞凋亡，并且山柰酚可以導致胃癌細胞在G2/M期阻滯，從而影響細胞的增殖。本研究將來可能也有必要去進一步探討山柰酚對HBx-HepG2 細胞周期的影響，從而進一步確定其中潛在的機制。

Figure 4.The effect of kaempferol on Wnt/β-catenin signaling pathway in the HBx-HepG2 cells. A: the mRNA expression levels of β-catenin, c-Myc and cyclin D1 in the HBx-HepG2 cells after kaempferol (100 μmol/L) or vehicle treatment for 48 h was detected by RT-qPCR; B: the protein expression levels of β-catenin, c-Myc and cyclin D1 in HBx-HepG2 cells after kaempferol (100 μmol/L) or vehicle treatment for 48 h was determined by Western blot； C: the protein expression levels of p-GSK-3β and GSK-3β in HBx-HepG2 cells after kaempferol (100 μmol/L) or vehicle treatment for 48 h was measured by Western blot； D: the protein expression levels of β-catenin in the cytoplasm and nucleus in HBx-HepG2 cells after kaempfe-rol (100 μmol/L) or vehicle treatment for 48 h was measured by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vskaempferol (0 μmol/L) group.

圖4 山柰酚對HBx-HepG2細胞Wnt/β-catenin信號通路的影響

Figure 5.The effect of kaempferol on the growth, invasion and migration of LiCl-treated HBx-HepG2 cells. A: the colony formation ability of the HBx-HepG2 cells treated with kaempferol or kaempferol+LiCl for 48 h was measured by colony formation assay; B: the cell invasion ability of the HBx-HepG2 cells treated with kaempferol or kaempferol+LiCl for 48 h was measured by Transwell invasion assay; C: the cell migration ability of the HBx-HepG2 cells treated with kaempferol or kaempferol+LiCl for 48 h was measured by wound healing assay. a: kaempferol (100 μmol/L); b: kaempferol (100 μmol/L)+LiCl (1 mmol/L). Mean±SD.n=3.*P<0.05vsa group.

圖5 山柰酚對LiCl處理的HBx-HepG2細胞生長、侵襲及遷移的影響

Wnt信號途徑由Wnt蛋白、受體以及調節蛋白等組成了復雜的信號通路, 調節細胞的分化、增殖、遷移以及哺乳動物生殖系統發育的多個重要環節[10-12]。近年來發現很多腫瘤的發生與Wnt信號的異常相關[13-14]，在HCC的發生發展中也不乏Wnt信號通路異常的報道[15]。最近的研究發現HBx 蛋白對于肝癌細胞Wnt/β-catenin信號通路的激活起到關鍵的作用[16]。Chen等[17]研究發現HBx蛋白能夠促進Wnt/β-catenin 信號通路從而增加肝癌細胞的遷移。本研究首次發現山柰酚能夠抑制β-catenin、c-myc 和 cyclin D1的mRNA以及蛋白的水平。同時發現山柰酚能夠抑制p-GSK-3β 的蛋白水平，而山柰酚對于Wnt/β-catenin信號通路的抑制可能是通過抑制β-catenin從細胞質向細胞核轉移。進一步的實驗發現Wnt/β-catenin 信號通路的激活劑LiCl可以阻斷山柰酚對HBx-HepG2細胞的增殖、侵襲以及轉移抑制作用。這些結果提示山柰酚很有可能是通過抑制Wnt/β-catenin 信號通路活性來抑制HBx-HepG2細胞的增殖、侵襲以及轉移。

本研究發現山柰酚對HBx-HepG2 細胞的增殖、侵襲以及遷移有顯著性的抑制作用，這種抑制作用很有可能是通過抑制Wnt/β-catenin 信號通路的活性來實現的。本研究的不足之處在于缺少相應的體內動物實驗來進一步確定山柰酚對HBx-HepG2的抑制作用。

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(責任編輯： 盧 萍， 羅 森)

Kaempferol inhibits cell proliferation, invasion and migration via Wnt/β-catenin signaling in HBx-HepG2 cells

HUANG Mao-xin, CHEN Ling, HAN Peng-ding, LIN Shi-ke

(DepartmentofPharmacy,HainanNongkenHospital,Haikou570311,China.E-mail:huang_maoxin@126.com)

AIM: To explore the effects of kaempferol on the proliferation, invasion and migration abilities of HBx-HepG2 cells and to examine the underlying molecular mechanisms. METHODS: The expression levels of related genes at mRNA and protein levels were determined by RT-qPCR and Western blot. The cell apoptotic rate was analyzed by flow cytometry. The cell proliferation, growth, invasion and migration abilities were measured by MTT assay, colony formation assay, Transwell invasion assay and wound healing assay, respectively. RESULTS: Kaemferol inhibited HBx-HepG2 cell proliferation in a concentration- and time-dependent manner. Kaempferol at 100 μmol/L significantly inhibited the colony formation, invasion and migration abilities of the HBx-HepG2 cells. Kaemferol at 100 μmol/L also increased cell apoptotic rate, increased the protein levels of cleaved caspase-3, cleaved caspase-9 and Bax, and decreased the expression level of Bcl-2. In addition, kaemferol at 100 μmol/L suppressed the mRNA and protein expression levels of β-catenin, c-Myc and cyclin D1 in the HBx-HepG2 cells. Kaemferol at 100 μmol/L also suppressed the protein level of p-GSK-3β and the β-catenin protein levels in both cytoplasm and nucleus. LiCl treatment reversed the inhibitory effect of kaempferol on the growth, invasion and migration of the HBx-HepG2 cells. CONCLUSION: Kaempferol inhibits cell proliferation, invasion and migration via activating Wnt/β-catenin signaling in HBx-HepG2 cells.

HBx-HepG2 cells; Kaempferol; Cell proliferation; Cell invasion; Cell migration; Wnt/β-catenin signaling pathway

1000- 4718(2017)08- 1417- 06

2016- 12- 14

2017- 04- 12

海南省衛計委普通醫學科研(No. 14A210221)

R735.7； R965

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.08.012

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