Dickkopf-1沉默通過下調β-catenin水平抑制胃癌細胞侵襲及上皮-間充質轉化*

孫 杰， 付立芳

(1山東醫學高等專科學校中醫學教研室， 2臨沂市中醫醫院呼吸內科， 山東 臨沂 276000)

Dickkopf-1沉默通過下調β-catenin水平抑制胃癌細胞侵襲及上皮-間充質轉化*

孫 杰1△， 付立芳2

(1山東醫學高等專科學校中醫學教研室，2臨沂市中醫醫院呼吸內科， 山東 臨沂 276000)

目的： 探討分泌蛋白Dickkopf-1 (DKK1)在人胃癌細胞中的表達及其對胃癌細胞侵襲能力的影響。方法: 以real-time PCR和Western blot法檢測DKK1在人胃黏膜細胞(GES-1)和胃癌細胞(MKN-45和SGC-7901)中的表達水平；以RNA干擾法沉默DKK1，沉默效果以real-time PCR、Western blot及ELISA法驗證；Transwell實驗檢測細胞侵襲能力，以絲裂霉素C抑制細胞增殖；real-time PCR及Western blot法檢測細胞E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、N-鈣黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(vimentin)及β-連環蛋白(β-catenin)水平。結果: DKK1在MKN-45和SGC-7901細胞中的表達明顯高于GES-1細胞，表明DKK1在胃癌細胞中表達顯著升高；DKK1在MKN-45和SGC-7901細胞中被成功沉默后，細胞侵襲能力顯著下降，并具有時間依賴性，同時伴隨E-cadherin表達增高及N-cadhe-rin和vimentin表達下降，表明DKK1沉默能夠顯著抑制胃癌細胞侵襲和上皮-間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)；經外源性重組DKK1(rDKK1)轉染腫瘤細胞后，進一步證實DKK1具有促胃癌細胞侵襲的作用，并可促進EMT進程；DKK1沉默通過下調β-catenin水平來實現其對胃癌細胞侵襲及EMT的抑制作用。結論: DKK1在人胃癌細胞中表達顯著增高，且DKK1沉默能夠通過下調β-catenin水平抑制胃癌細胞侵襲及EMT過程。

Dickkopf-1； 胃癌； 上皮-間充質轉化； 細胞侵襲； β-連環蛋白

胃癌是全球最常見的消化道惡性腫瘤之一，具有較高的發病率和死亡率[1-2]。基于胃癌早期低診斷率的特點，越來越多的研究致力于尋找胃癌特異性血清腫瘤標志分子[3]。Dickkopf (DKK)是一組分泌型糖蛋白，通常由225～350個氨基酸殘基組成，能夠負性調控Wnt信號通路下游基因活性從而發揮促癌或抑癌作用[4-5]。目前，DKK1是DKK家族中被研究最多的蛋白，其被報道廣泛參與調控多種癌癥的侵襲和轉移[4]。研究表明，DKK1在肝癌、肺癌、食管癌及膽管癌中發揮促侵襲作用，但在口腔鱗狀細胞癌及黑色素瘤中作用則相反[4, 6]。近年研究發現，DKK1在胃癌患者血清及組織中顯著高表達[7-8]，但其對胃癌細胞侵襲的影響尚不明確。本研究旨在探討人胃癌細胞中DKK1的表達，及其對胃癌細胞侵襲的影響及作用機制。

材 料 和 方 法

1 細胞和主要試劑

人胃黏膜上皮細胞株GES-1購自ATCC；人胃癌細胞株SGC-7901和MKN-45購自中國科學院上海細胞研究所。

DMEM培養基、RPMI-1640培養基、胎牛血清、青霉素、鏈霉素、RIPA裂解液、BCA試劑盒、PVDF膜、胰蛋白酶、LipofectamineTM2000、絲裂霉素C(mi-tomycin C，MMC)及結晶紫均購自Sigma；Trizol試劑盒購自Invitrogen；ECL顯色試劑購自上海西唐生物科技有限公司；Transwell小室購自Corning；DKK1-siRNA及相應scramble-siRNA、β-catenin-siRNA及相應scramble-siRNA購自Thermo；重組人DKK1蛋白(recombinant DKK1，rDKK1)及其ELISA檢測試劑盒購自R&D。

2 方法

2.1 細胞培養 GES-1細胞常規培養于DMEM培養基中，內含10%胎牛血清、1.5×105U/L青霉素及50 mg/L鏈霉素[9]。MKN-45細胞培養于RPMI-1640培養基中，內含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素及100 mg/L鏈霉素[10]。SGC-7901細胞培養于DMEM培養基中，內含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素及100 mg/L鏈霉素[11-12]。所有細胞均置于37 ℃、5% CO2相對飽和濕度的孵育箱中培養，取對數生長期的細胞進行實驗。

2.2 Real-time PCR實驗 細胞總RNA以Trizol試劑盒進行提取，操作按照說明書進行。以反轉錄試劑將5 μg RNA轉錄為cDNA，以cDNA為模板進行PCR擴增反應，β-actin為內參照。擴增條件為94 ℃ 5 min； 94 ℃ 30 s， 56 ℃ 45 s， 72 ℃ 50 s，循環40次[13]。反應結果以ABI 7500系統檢測，并采用2-ΔΔCt法進行定量。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，詳細序列見表1。

表1 實時定量PCR引物序列

2.3 Western blot實驗 以RIPA裂解液裂解細胞，提取總蛋白。蛋白濃度以BCA法測定。取40 μg總蛋白并以10% 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE)分離，將分離的蛋白質電轉移至PVDF膜[14]。PVDF膜經PBS清洗后，與目的蛋白 I 抗于4 ℃孵育過夜，清洗后，繼續與辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標記的IgG II 抗孵育1.5 h，ECL顯影液顯影，β-actin為內參照[15]。抗體為兔抗人DKK1多克隆抗體(稀釋度：1∶2 000)、兔抗人E-鈣黏蛋白(E-cadherin)單克隆抗體(稀釋度：1∶2 500)、兔抗人N-鈣黏蛋白(N-cadherin)多克隆抗體(稀釋度：1∶1 500)、兔抗人波形蛋白(vimentin)單克隆抗體(稀釋度：1∶2 000)、兔抗人β-連環蛋白(β-catenin)單克隆抗體(稀釋度：1∶1 500)、兔抗人β-肌動蛋白(β-actin)多克隆抗體(稀釋度：1∶2 500)，及HRP標記的山羊抗兔IgG II 抗(稀釋度：1∶4 000)。所有抗體均購自Abcam。利用Gel-Pro 4.0軟件對Western blot的條帶進行量化分析。

2.4 RNA干擾法沉默DKK1表達 選取處于對數生長期的MKN-45細胞和SGC-7901細胞，以0.25%胰蛋白酶進行消化，并制備成細胞懸液。將細胞以每孔1×106個接種于6孔板后，置于37 ℃、5% CO2環境下培養至細胞融合達80%。2 nmol/L DKK1-siRNA和scramble-siRNA分別以LipofectamineTM2000轉染至上述細胞中，并設置相應空白對照組。轉染48 h后，分別以real-time PCR法和Western blot法驗證DKK1基因沉默效果，Transwell實驗檢測細胞侵襲能力。繼續培養48 h后，real-time PCR法和Western blot法檢測目的基因及蛋白水平。

2.5 Transwell侵襲實驗 收集各組細胞，分別重懸于無血清培養基中。選取24孔板(濾膜直徑6.5 mm, 孔徑8.0 μm)的Transwell小室進行細胞侵襲實驗。小室上層以1 g/L Matrigel預包被后，接種5×104個細胞(約800 μL)，加入MMC抑制細胞增殖。下層加入600 μL DMEM或RPMI-1640全培養液。常規培養24、48及72 h后，以棉拭子擦掉上層未侵襲細胞，侵襲細胞以0.1% 結晶紫染色30 min，PBS漂洗3次，于倒置顯微鏡下觀察并計數侵襲細胞[16-17]。

為了驗證DKK1對胃癌細胞侵襲的促進作用，將終濃度為0、20、40和60 μg/L 的人rDKK1蛋白依次分別加入內含MKN-45細胞和SGC-7901細胞的Transwell小室或6孔板中。rDKK1處理48 h后，檢測細胞侵襲能力。

β-catenin-siRNA及其scramble-siRNA分別以LipofectamineTM2000轉染至2種胃癌細胞中，轉染48 h后驗證β-catenin基因沉默效果。收集細胞進行Transwell實驗，加入終濃度為60 μg/L的人rDKK1蛋白處理48 h，同時設置相應對照組，并檢測細胞侵襲能力。

3 統計學處理

本研究實驗均獨立重復3次，數據以均數±標準差(mean±SD)表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較應用Bonferroni校正的t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 DKK1在人胃癌細胞中表達顯著升高

Real-time PCR實驗結果表明，DKK1在低分化胃癌細胞MKN-45和中分化胃癌細胞SGC-7901中的相對mRNA水平均顯著高于GES-1細胞(P<0.05)。Western blot結果表明，DKK1在MKN-45細胞和SGC-7901細胞中的相對蛋白水平同樣均顯著高于GES-1細胞(P<0.05)。此外，DKK1在SGC-7901細胞中的mRNA和蛋白水平明顯高于MKN-45細胞 (P<0.05)。本部分結果證實，DKK1在人胃癌細胞中的表達顯著升高，并隨癌細胞分化而加強，見圖1。

Figure 1.The mRNA (A) and protein (B) levels of DKK1 in human gastric carcinoma cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05，**P<0.01vsGES-1;#P<0.05vsMKN-45.

圖1 DKK1在人胃癌細胞中的水平

2DKK1基因沉默效果的驗證

驗證結果表明，DKK1的mRNA水平在DKK1-siRNA組中顯著低于scramble-siRNA組和空白對照組，類似結果也體現于其蛋白表達水平上(P<0.05)。收集細胞培養上清液，以ELISA試劑盒檢測DKK1蛋白水平，結果與DKK1 mRNA及 Western blot結果一致。本部分結果表明，2種胃癌細胞中DKK1基因沉默效果良好，能夠滿足后續實驗要求，見圖2。

3DKK1基因沉默抑制胃癌細胞侵襲

2種DKK1沉默細胞(DKK1-siRNA組)的侵襲力均顯著低于DKK1未沉默細胞(scramble-siRNA組和空白對照組)，且具有時間依賴性。72 h時，不同組MKN-45細胞和SGC-7901細胞侵襲的原始圖片見圖3。本部分結果顯示，DKK1水平下調能夠顯著抑制胃癌細胞的侵襲，反映出其具有促胃癌細胞侵襲的作用。

Figure 2.The expression of DKK1 at mRNA and protein levels. A: the relative mRNA level of DKK1 in the cells; B: the relative protein level of DKK1 in the cells; C: the protein concentration of DKK1 in the cell supernatant. Mean±SD.n=3.*P<0.05，**P<0.01vsscramble-siRNA group.

圖2 DKK1 mRNA及蛋白水平

4DKK1基因沉默調節細胞EMT過程

Real-time PCR實驗結果發現，DKK1沉默后，2種胃癌細胞中E-cadherin的mRNA水平顯著升高，N-cadherin及vimentin的mRNA水平顯著下降。類似變化也出現在相應分子蛋白表達水平上。本部分結果證實，DKK1基因沉默能夠顯著抑制細胞的EMT過程，見圖4。

5 外源性DKK1促進胃癌細胞侵襲及EMT過程

MKN-45和SGC-7901細胞侵襲力隨rDKK1劑量增加而增強；同時，伴隨劑量依賴性的E-cadherin的mRNA水平下降，及N-cadherin和vimentin的mRNA水平上升。此外，SGC-7901細胞在40 μg/L rDKK1和60 μg/L rDKK1作用下侵襲力顯著強于MKN-45細胞(P<0.05)。以不同濃度rDKK1處理兩種細胞48 h后，MKN-45細胞和SGC-7901細胞侵襲的圖片見圖5。本部分結果驗證，DKK1具有促進胃癌細胞侵襲及EMT轉化的作用。

6DKK1沉默通過降低β-catenin水平發揮抑制侵襲作用

為了探討DKK1沉默是否通過下調β-catenin水平影響了胃癌細胞的侵襲力，本研究繼續檢測了MKN-45細胞和SGC-7901細胞中β-catenin水平。DKK1沉默后，β-catenin的mRNA及蛋白水平在2種細胞中均顯著下調(P<0.05)，表明DKK1沉默抑制了胃癌細胞中β-catenin的表達。

另外，β-catenin沉默后MKN-45細胞和SGC-7901細胞的侵襲力顯著低于未沉默組(P<0.05)；同時在60 μg/L rDKK1作用下細胞侵襲力在β-catenin沉默的細胞中顯著低于β-catenin未沉默的細胞(P<0.05)。類似結果也體現于EMT過程中。以上結果表明，DKK1沉默是通過下調β-catenin水平抑制了胃癌細胞的侵襲及EMT過程，見圖6。

Figure 3.The cell invasion ability detected by Transwell assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05，**P<0.01vsscramber-siRNA group.

圖3 Transwell實驗檢測細胞侵襲力

Figure 4.The changes of the mRNA (A) and protein (B) levels of EMT-related molecules. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsscramble-siRNA group.

圖4 EMT相關分子mRNA及蛋白水平

Figure 5.The influences of human rDKK1 on the invasion (A) and EMT (B) of gastric carcinoma cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05，**P<0.01vs0 μg/L rDKK1；#P<0.05，##P<0.01vsSGC-7901.

圖5 人重組DKK1對胃癌細胞侵襲及EMT轉化的影響

討 論

DKK1是一種有力的經典Wnt/β-catenin信號通路的抑制劑，其一方面能在細胞外與Wnt競爭性結合LRP5/LRP6輔助受體抑制Wnt信號[6]，另一方面能與LRP5/LRP6、Kremen 1/2聚合為三聚體，通過快速誘導細胞內吞以減少胞膜上的LRP5/LRP而阻斷Wnt信號向胞內傳遞[7]。Wnt信號通路在癌癥發生發展過程中發揮重要作用，因此DKK1與癌癥的發生發展密切相關。研究表明，DKK1 在多數癌癥如肝癌、肺癌及食管癌中發揮促侵襲作用，但在口腔鱗狀細胞癌及黑色素瘤中則發揮相反作用[4]，然而其在胃癌侵襲中的作用尚不明確。

Lee等[18]評估了153例胃癌患者和173例健康志愿者血清中DKK1的濃度，發現其在胃癌患者血清中的濃度顯著高于健康志愿者。本研究表明，胃癌細胞中DKK1表達水平顯著高于胃正常細胞，與其在血清中的檢測結果一致，這也預示著DKK1可能與胃癌的發展進程有一定的相關性。深入研究發現，DKK1沉默顯著抑制了胃癌細胞侵襲及EMT過程，表明DKK1能夠促進胃癌的侵襲，在胃癌的發展中具有重要的調控作用。

在腫瘤侵襲過程中，EMT是除腫瘤轉移基因、血管生成及細胞外基質降解外的另一重要影響因素[19]。該過程新形成的細胞具有間質細胞的形態學和轉移特性，能夠誘使細胞發生轉移和侵襲[20]。本文研究發現， 外源性DKK1促進胃癌細胞侵襲的作用與EMT過程密切相關。Yao[21]等研究發現非小細胞肺癌(non-small cell lung carcinoma，NSCLC)中，DKK1促進的血管生成擬態也與EMT過程有緊密關聯。

β-catenin是由位于染色體3p21-22的CTNNB1基因編碼的，具有介導細胞間黏附及信號轉導等多重功能的重要分子[22]。β-catenin在多種癌癥細胞的增殖、凋亡及侵襲轉移中扮演重要角色，例如其能削弱骨肉瘤細胞的侵襲能力[23]，加強肺癌細胞的增殖能力等[24]。報道指出，β-catenin基因沉默的胃癌細胞表現出較弱的侵襲能力[25]。研究發現，DKK1和β-catenin在胃癌組織中表達呈正相關[26-27]，但兩者在胃癌中是否存在調控關系尚不明確。本研究檢測發現，β-catenin在DKK1沉默的胃癌細胞中表達顯著下調，明確了DKK1對β-catenin的正調控作用。應用β-catenin-siRNA或/和rDKK1聯合處理細胞發現，rDKK1誘導的胃癌細胞侵襲力的增強并未在β-catenin沉默的細胞中檢測到，表明DKK1是通過調控β-catenin表達影響了胃癌細胞的侵襲力。此外，本研究也檢測到β-catenin沉默胃癌細胞侵襲力的整體下降，與潘安萍[25]的研究結果一致。

Figure 6.Influences of human rDKK1 on the invasion and EMT of β-catenin-silencing gastric carcinoma cells. A: the mRNA and protein levels of β-catenin inDKK1-silencing cells; B: the protein level of β-catenin in β-catenin-silencing cells; C: the effects of rDKK1 (60 μg/L) on invasive ability of MKN-45 and SGC-7901 cells; D: the effects of rDKK1 on the mRNA levels of EMT-related genes in the MKN-45 cells; E: the effects of rDKK1 on the mRNA levels of EMT-related genes in the SGC-7901 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05，**P<0.01vsscramble-siRNA;△P<0.05vsscramble-siRNA+rDKK1.

圖6 人重組DKK1對β-catenin沉默胃癌細胞侵襲及EMT的影響

E-cadherin與EMT過程密切相關，是上皮細胞黏連的主要分子，其通過α-catenin、β-catenin及γ-catenin組成的復合物錨定在細胞骨架；當β-catenin積聚轉入核內后，E-cadherin會失去錨定而活動到其它區域，使細胞間失去相互黏附而移動力增強，發生侵襲及EMT過程[28]。因此，rDKK1對胃癌細胞的促侵襲作用，除了與rDKK1對E-cadherin表達的負調控有關，還與DKK1對β-catenin表達的正調控有關，可能表現為DKK1使β-catenin水平增加并積聚而入核，導致E-cadherin失去錨定復合物，致使細胞間黏附減弱，加速了細胞侵襲及EMT過程。

綜上所述，本研究發現DKK1在胃癌細胞中表達顯著上升。DKK1沉默能夠通過下調β-catenin表達水平來抑制胃癌細胞侵襲及EMT過程。

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(責任編輯： 林白霜， 羅 森)

Dickkopf-1 silencing inhibits invasion and epithelial-mesenchymal transition in gastric carcinoma cells by down-regulating β-catenin

SUN Jie1, FU Li-fang2

(1DepartmentofTraditionalChineseMedicine,ShandongMedicalCollege，2DepartmentofRespiratoryMedicine,ChineseMedicineHospitalinLinyiCity,Linyi276000,China.E-mail:jsunsd@163.com)

AIM: To explore the expression of Dickkopf-1 (DKK1) in human gastric carcinoma cells, and the influences ofDKK1 gene silencing on cell invasion. METHODS: The levels of DKK1 in the human gastric mucosa cell line GES-1 and gastric carcinoma cell lines MKN-45 and SGC-7901 were detected by real-time PCR and Western blot.DKK1 gene was silenced by RNA interference, which was verified by real-time PCR, Western blot and ELISA. The cell invasion ability was determined by Transwell assay, and the cell proliferation was inhibited by mitomycin C. The levels of E-cadherin, N-cadherin, vimentin and β-catenin were determined by real-time PCR and Western blot. RESULTS: The expression of DKK1 was significantly higher in MKN-45 cells and SGC-7901 cells than that in GES-1 cells, indicating that DKK1 expression was obviously increased in gastric carcinoma cells. After successful silencing ofDKK1 gene in the MKN-45 cells and SGC-7901 cells, the cell invasion ability was markedly decreased in a time-dependent pattern with increased expression of E-cadherin and decreased expression of N-cadherin and vimentin, indicating thatDKK1 silencing dramatically inhibited gastric carcinoma cell invasion and epithelial-mesenchymal transition (EMT). The introduction of exogenous recombinant DKK1 (rDKK1) demonstrated the promoting effect of DKK1 on gastric carcinoma cell invasion and EMT. In addition, the inhibitory effects ofDKK1 silencing on gastric carcinoma cell invasion and EMT were fulfilled by down-regulating β-catenin. CONCLUSION: The expression of DKK1 is significantly increased in human gastric carcinoma cells. Silencing ofDKK1 markedly inhibits gastric carcinoma cell invasion and EMT by down-regulating β-catenin.

Dickkopf-1; Gastric carcinoma; Epithelial-mesenchymal transition; Cell invasion; β-catenin

1000- 4718(2017)08- 1428- 08

2016- 09- 30

2017- 05- 31

山東省教育廳課題(No. J13LK56)；臨沂市科技發展計劃項目(No. 20151505)

R730.23； R735.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.08.014

雜志網址： http://www.cjpp.net

△通訊作者 Tel: 0539-8052575； E-mail: jsunsd@163.com