西格列汀對AGEs作用下系膜細胞自噬的影響*

江穎娟， 蔣作鋒， 吳小蘭， 黃 珮， 吳文法， 余慧文

(暨南大學醫學院附屬廣州紅十字會醫院全科醫學科， 廣東 廣州 510220)

西格列汀對AGEs作用下系膜細胞自噬的影響*

江穎娟， 蔣作鋒， 吳小蘭， 黃 珮， 吳文法， 余慧文△

(暨南大學醫學院附屬廣州紅十字會醫院全科醫學科， 廣東 廣州 510220)

目的： 探討西格列汀對晚期糖基化終末產物(advanced glycation end products，AGEs)作用下系膜細胞細胞外基質和自噬相關蛋白表達的影響。方法: 培養大鼠腎小球系膜細胞，共分5組，分別為正常對照(control)組、AGE組和不同濃度(5 、10和20 μmol/L)西格列汀組。培養48 h后采用MTT法測定細胞活力，采用ELISA法檢測細胞培養上清膠原蛋白Ⅳ(collagen IV， Col IV)含量的變化。采用Western blot檢測自噬相關蛋白beclin-1、腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK)、 p-AMPK、p70S6K和p-p70S6K的蛋白水平。結果: 與control組比較，AGEs可明顯引起系膜細胞活力和Col IV表達增加，不同濃度的西格列汀均可明顯抑制AGEs誘導的系膜細胞活力和Col IV表達的增加；與control組比較，AGEs可引起系膜細胞自噬相關蛋白beclin-1表達和AMPK磷酸化水平下降，p70S6K磷酸化水平增加；不同濃度的西格列汀均可促進系膜細胞自噬相關蛋白beclin-1表達及AMPK磷酸化，抑制p70S6K磷酸化，并呈一定的濃度依賴性。結論: 西格列汀可能通過引起系膜細胞的自噬發揮腎臟保護作用。

西格列汀； 自噬； 系膜細胞； 糖尿病腎病； Beclin-1； 腺苷酸活化蛋白激酶

糖尿病腎病是糖尿病的主要并發癥之一，其發病率逐年上升，是終末腎病的主要病因，已經嚴重威脅人類健康，但目前尚無有效的治療方法，因此迫切需要對糖尿病腎病發病機制進行深入的研究，尋求新的治療糖尿病腎病的藥物。有研究表明，自噬在糖尿病腎病的發病機制中發揮著重要的作用[1]，因此自噬有望成為糖尿病腎病治療新的藥理作用靶點。

西格列汀(sitagliptin)是一種二肽基肽酶4(dipeptidyl peptidase 4，DPP-4)抑制劑，能夠迅速滅活腸促胰島素胰高血糖素樣肽1和糖依賴性胰島素釋放肽等多種激素，增強人體自身的控制血糖能力，是目前臨床治療2型糖尿病的常用藥物之一[2]。但研究發現西格列汀除了控制血糖等生理作用外，還可減少糖尿病大鼠腎臟的氧化應激及TNF-α、TGF-β的分泌，抑制結締組織生長因子的表達，減少尿蛋白的產生[3-4]。以上研究表明，西格列汀可能還對腎臟具有一定的保護作用，但具體機制尚不清楚。近期有研究表明DPP-4抑制劑可通過誘導細胞發生自噬而保護心肌的功能及減輕動脈粥樣硬化的程度[5-6]，但西格列汀是否通過自噬發揮腎臟保護作用，目前少見報道。因此，本研究以系膜細胞為模型，初步探討了西格列汀對晚期糖基化終末產物(advanced glycation end products，AGEs)作用下大鼠系膜細胞細胞自噬相關指標的影響，為西格列汀臨床治療糖尿病腎病提供理論基礎及依據。

材 料 和 方 法

1 試劑和儀器

西格列汀、DMSO、MTT和大鼠TNF-α購自Sigma-Aldrich；胎牛血清購自PPA；DMEM低糖培養基和青、鏈霉素溶液(100×)購自杭州吉諾生物醫藥技術有限公司；胰蛋白酶購自廣州威佳科技有限公司；PBS粉劑購自武漢博士德生物工程有限公司；MTT試劑盒購自碧云天生物技術公司；IV型膠原(collagen Ⅳ，Col Ⅳ)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；抗beclin-1、p70S6K和p-p70S6K抗體購自Abcam；小鼠抗大鼠腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK)、p-AMPK、β-actin 單克隆抗體和羊抗小鼠 IgG購自凱基公司；ECL 顯色劑購自Pierce；細胞培養瓶、離心管和細胞培養板均購自Corning。3K15低溫離心機購自Sigma；TDL-50B低速臺式離心機購自上海安亭科學儀器廠。

2 方法

2.1 細胞培養 HBZY-1細胞購自上海艾研科技有限公司。將HBZY-1細胞接種于含10%胎牛血清、1×105U/L 青霉素和100 mg/L 鏈霉素的DMEM低糖培養基中，于37 ℃、5% CO2培養箱中培養。

2.2 實驗分組 實驗分為以下5組：對照(control)組：普通DMEM(含糖5.6 mmol/L)完全培養基；AGEs(5%的牛血清白蛋白和0.5%葡萄糖一起溶解于0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液中，過濾除菌后置于37 ℃的培養箱中8周，最后用透析方法析出AGEs，除菌后備用)處理組：采用0.25 g/L AGEs處理細胞，簡稱AGE組；藥物處理組：在加AGEs處理的系膜細胞中，分別用不同濃度(5 μmol/L、10 μmol/L和20 μmol/L)的西格列汀處理(簡稱AGE+S5組、AGE+S10組和AGE+S20組)。

2.3 MTT法檢測細胞活力 收集對數期細胞，置于96孔板，每孔5 000個細胞，37 ℃、5% CO2溫箱培養使細胞貼壁，培養6～24 h。采用無血清培養基同步化24 h，然后按照細胞分組加入不同濃度的藥物，繼續培養48 h。吸去上清，加入90 μL新鮮培養液，再加入10 μL MTT溶液，繼續培養4 h。然后吸掉上清，每孔加入110 μL二甲基亞砜，振蕩10 min。在酶聯免疫檢測儀490 nm處測量各孔的吸光值。每組設定6個復孔。

2.4 ELISA法測定細胞培養上清Col IV的含量 從冰箱取出試劑盒，室溫復溫平衡30 min。配置標準品加標準品和待測樣本，37 ℃恒溫箱溫育120 min。棄去液體，洗滌液洗板4次。加入工作液100 μL，37 ℃恒溫箱溫育60 min。洗板5次。依序每孔加入底物溶液90 μL，37 ℃避光顯色15 min。每孔加終止液50 μL，終止反應。用450 nm波長測量各孔的吸光值。

2.5 Western blot 檢測 beclin-1、AMPK、p-AMPK、p70S6K和p-p70S6K的蛋白水平 細胞加 200 μL預冷的 RIPA 裂解液(含50 mmol/L Tris， pH 7.5， 150 mmol/L NaCl， 1% NP-40， 0.1% SDS， 10 mmol/L EDTA， 1 mmol/L PMSF， 2 mg/L aprotinin, 2 mg/L leupeptin)，4 ℃ 12 000 r/min 離心 25 min， 吸取上層液體經BCA 蛋白定量試劑盒測蛋白濃度。調整蛋白濃度后，取 150 μg 細胞總蛋白進行10%SDS-PAGE 分離，蛋白轉印至硝酸纖維素膜，5%脫脂牛奶封閉 4 h， 加I 抗 4 ℃過夜， 加II 抗室溫孵育 1 h，TBST 清洗后用Odyssey 凝膠成像系統掃描成像，所得結果以 β-actin 為內參照。各組實驗至少重復3次。

3 統計學處理

統計分析采用SPSS 16.0軟件。計量資料用均數±標準差(mean±SD)表示。各組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)和SNK-q檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 西格列汀 對AGEs作用下大鼠系膜細胞活力的影響

培養48 h，AGE組系膜細胞活力明顯高于control組(P<0.01)。不同濃度(5 μmol/L、10 μmol/L和20 μmol/L)的西格列汀均可明顯抑制AGEs誘導的系膜細胞的活力(P<0.01)，并呈一定的濃度依賴性，見圖1。

Figure 1.The changes of the viability of the mesangial cells with different treatments. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol;△△P<0.01vsAGE;#P<0.05vsAGE+SIT (5 μmol/L).

圖1 各組系膜細胞活力的比較

2 西格列汀對AGEs作用下系膜細胞培養上清液Col IV含量的影響

與control組比較，AGE組系膜細胞上清液中Col IV的含量明顯增加(P<0.01)，不同濃度(5 μmol/L、10 μmol/L和20 μmol/L)的西格列汀可明顯降低AGEs誘導下系膜細胞上清液中Col IV的含量，差異具有統計學意義(P<0.05)，見圖2。

Figure 2.The effects of sitagliptin (SIT) on the content of Col IV in the cell culture supernatant induced by AGEs. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol;△P<0.05vsAGE;#P<0.05vsAGE+SIT (5 μmol/L);▲P<0.05vsAGE+SIT (10 μmol/L).

圖2 西格列汀對AGEs條件下系膜細胞分泌Col IV的影響

3 西格列汀對AGEs作用下大鼠系膜細胞自噬相關蛋白beclin-1表達的影響

與對照組相比，AGEs可抑制系膜細胞beclin-1的表達(P<0.01)；與AGE組相比，不同濃度(5 μmol/L、10 μnmol/L和20 μmol/L)的西格列汀均可明顯促進AGEs條件下系膜細胞beclin-1的表達(P<0.01)，且隨著西格列汀濃度的增加，其促進系膜細胞beclin-1的表達作用增強，呈一定的濃度依賴性，見圖3。

Figure 3.The effects of sitagliptin (SIT) on the protein expression of beclin-1 in the mesangial cells induced by AGEs. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol;△△P<0.01vsAGE;#P<0.05vsAGE+SIT (5 μmol/L).

圖3 西格列汀對AGEs條件下大鼠系膜細胞beclin-1表達的影響

4 西格列汀對AGEs作用下大鼠系膜細胞TORC1活性的影響

p70S6K 是已知的哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合體1(mammalian target of rapamycin complex 1，mTORC1)的底物蛋白，其磷酸化水平反映mTORC1的活性。培養48 h，與對照組相比，AGEs可明顯促進系膜細胞p70S6K的磷酸化(P<0.01)，不同濃度(5 μmol/L、10 μmol/L和20 μmol/L)的西格列汀可明顯抑制AGEs作用下系膜細胞p70S6K的磷酸化(P<0.01)，且隨著西格列汀濃度的增加，其抑制p70S6K磷酸化的作用更加明顯，具有一定的濃度依賴性，見圖4。

5 西格列汀對AGEs作用下大鼠系膜細胞AMPK磷酸化的影響

與對照組相比，AGEs可明顯抑制系膜細胞AMPK的磷酸化(P<0.01)；與AGE組相比，不同濃度(5 μmol/L、10 μnmol/L和20 μmol/L)的西格列汀可明顯增加AGEs作用下系膜細胞AMPK的磷酸化(P<0.01)，且隨著西格列汀濃度的增加，其促進系膜細胞AMPK磷酸化的作用增加，呈一定的濃度依賴性，見圖5。

Figure 4.The effects of sitagliptin (SIT) on the expression of p-p70S6K in mesangial cells induced by AGEs. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol;△△P<0.01vsAGE;#P<0.05vsAGE+SIT (5 μmol/L).

圖4 西格列汀對AGEs條件下大鼠系膜細胞p70S6K磷酸化的影響

Figure 5.The effects of sitagliptin (SIT) on the protein level of p-AMPK in the mesangial cells induced by AGEs. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol;△△P<0.01vsAGE;#P<0.05vsAGE+SIT (5 μmol/L).

圖5 西格列汀對AGEs條件下大鼠系膜細胞AMPK磷酸化的影響

討 論

自噬是胞漿大分子物質和細胞器在膜包囊泡中降解的生物學過程，主要通過對受損細胞器和老化蛋白質等大分子物質進行降解，為合成新的蛋白質和更新細胞器提供所需的原料，維持蛋白代謝平衡及細胞內環境穩定[7]。自噬異常能導致腫瘤、神經退變、糖尿病等多種疾病的發生。糖尿病腎病進展過程的腎小球基底膜增厚、系膜及基質增生聚集、蛋白尿等一系列病理過程與自噬關系密切[8]。研究表明抑制自噬可引起糖尿病腎病患者腎小球濾過率下降，增加TGF-β1和結締組織生長因子的表達[9]。此外，Munehiro等[10]研究發現，恢復了腎小管的自噬，可改善了糖尿病腎病腎臟的損傷。還有研究指出適度的自噬對糖尿病腎病具有保護作用，能夠抑制糖尿病腎病的發生和發展[11]。因此，我們推測通過干預自噬可能可以達到保護腎臟、延緩腎臟疾病進展的目的。

Beclin-1是酵母自噬基因在哺乳細胞中的同源蛋白，參與自噬體的形成，其表達強度與自噬活性緊密相關[7]。本研究證實西格列汀能夠抑制AGEs作用下大鼠系膜細胞的活力以及細胞外基質的分泌，初步證實了西格列汀可能具有一定的腎臟保護作用，這與以往的研究具有一致性。同時本研究還證實AGEs可明顯抑制系膜細胞beclin-1的表達，這一結果初步表明AGEs可能通過抑制細胞自噬引起糖尿病腎病的發生，而西格列汀可能通過誘導自噬的發生發揮腎臟保護作用。

mTORC1是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，參與自噬小體的誘導及形成，負性調控細胞自噬。有研究指出，抑制mTORC1信號通路可以起到保護腎臟的作用，并減緩糖尿病腎病的發展[12-13]。AMPK是一種異源三聚體蛋白，由α、β和γ亞單位組成，對分解代謝起到關鍵的作用，是機體能量代謝平衡的總開關。有研究指出糖尿病腎病中激活AMPK不僅可以通過對mTORC1的抑制達到對自噬作用的調控，且可以通過對ULK1激酶調節beclin-1的表達實現對自噬的直接調控作用，減輕細胞外基質的分泌和腎臟的纖維化[14-15]。因此推測AMPK對腎臟的保護作用可能是通過對自噬作用的激活實現的。本研究證實西格列汀可抑制AGEs條件下系膜細胞mTORC1底物蛋白p70S6K的磷酸化，顯示西格列汀可抑制AGEs條件下系膜細胞mTORC1的活性。此外，西格列汀還可促進AGEs條件下系膜細胞AMPK的磷酸化。由此可推測西格列汀可能通過促進AMPK的磷酸化及抑制mTORC1的活性進而上調自噬相關蛋白beclin-1表達，從而誘導細胞自噬的發生，發揮腎臟保護作用，但其具體機制仍需進一步研究。

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(責任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Effect of sitagliptin on autopaghy in mesangial cells induced by AGEs

JIANG Ying-juan, JIANG Zuo-feng, WU Xiao-lan, HUANG Pei, WU Weng-fa, Yu Hui-wen

(DepartmentofGeneralMedicine,GuangzhouRedCrossHospital,SchoolofMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510220,China.E-mail:yuhwgz@163.com)

AIM: To investigate the effect of sitagliptin on the autopaghy and the expression of extracellular matrix in mesangial cells induced by advanced glycation end products (AGEs). METHODS: The cells were divided into 5 groups: control group, AGE group, and sitagliptin (5, 10 and 20 μmol/L) groups. After 48 h, the cell viability was measured by MTT assay, and the content of collagen (Col) Ⅳ in the supernatant of the cell culture was detected by ELISA. The protein levels of beclin-1, adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK)， p-AMPK， p70S6K and p-p70S6K were determined by Western blot. RESULTS: Compared with control group, the viability and the expression of Col IV induced by AGEs in the cultured mesangial cells were significantly increased (P<0.01). Sitagliptin decreased the viability and the expression of Col IV induced by AGEs in the mesangial cells in a dose-dependent manner. AGEs significantly inhibited the protein levels of beclin-1 and p-AMPK, but significantly increased the protein level of p-p70S6K. Compared with AGE group, sitagliptin significantly reversed the above results in a dose-dependent manner. CONCLUSION: Autophagy may mediate the protective effect of sitagliptin on mesangial cells induced by AGEs.

Sitagliptin; Autophagy; Mesangial cells; Diabetic nephropathy; Beclin-1; Adenosine monophosphate-activated protein kinase

1000- 4718(2017)08- 1455- 05

2017- 01- 19

2017- 05- 17

廣州市衛生和計劃生育科技一般引導項目(No. 20161A011020)

R363.2+1； R587.1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.08.018

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