內皮祖細胞培養上清對高氧暴露新生大鼠肺結構的改善作用*

李 志， 陸愛珍， 張小媚， 錢莉玲

(復旦大學附屬兒科醫院， 上海 201102)

內皮祖細胞培養上清對高氧暴露新生大鼠肺結構的改善作用*

李 志， 陸愛珍， 張小媚， 錢莉玲△

(復旦大學附屬兒科醫院， 上海 201102)

目的： 研究內皮祖細胞培養上清(endothelial progenitor cell-conditioned medium，EPC-CM)對高氧暴露新生大鼠肺損傷時肺泡結構的改善作用及其機制。方法: 從新生SD大鼠骨髓中獲取內皮祖細胞并鑒定，收集第3代細胞的培養上清備用。另取新生SD大鼠40只隨機分為4組，即空氣組：仔鼠在空氣(21% O2)中喂養21天；高氧組：仔鼠在85% O2中喂養21天；內皮細胞基礎培養基 (endothelial cell basal medium， EBM)干預組：仔鼠在85% O2中喂養至第14天時，經氣道給予100 μL EBM，然后喂養至第21天；EPC-CM干預組：仔鼠在85% O2中喂養至第14天，經氣道給予100 μL EPC-CM，喂養至第21天。第21天處死小鼠，左肺用4%多聚甲醛固定，留作石蠟切片，隨后HE染色進行肺組織病理形態學觀察，并做輻射狀肺泡計數(radical alveolar count，RAC)及肺泡平均線性截距(mean linear intercept，MLI)測量；免疫組織化學方法對血管內皮細胞FVIII染色，計數肺組織微血管密度；右肺留作實時熒光定量PCR檢測肺組織KGF、VEGF、SP-A和SP-C的mRNA表達。結果: 培養所得細胞具有典型的EPCs形態改變，能結合異硫氰酸熒光素標記的荊豆凝集素1并攝取DiI熒光標記的乙酰化低密度脂蛋白。高氧組及EBM干預組的仔鼠體重、RAC、MLI和微血管密度較空氣組顯著降低(P<0.05)，EPC-CM干預組的RAC和微血管密度較高氧組和EBM干預組明顯增加(P<0.05)，而體重和MLI的變化無明顯差異，但有增高的趨勢。高氧組和EBM干預組肺組織KGF、VEGF、SP-A和SP-C的mRNA表達較空氣組顯著降低(P<0.05)，EPC-CM干預組的表達顯著高于高氧組和EBM干預組(P<0.05)。結論: EPC-CM可改善高氧暴露新生大鼠的肺泡化和肺血管發育，可能與促進肺內KGF和VEGF mRNA的表達相關。

高氧； 內皮祖細胞； 肺損傷； 旁分泌

支氣管肺發育不良(bronchopulmonary dysplasia，BPD)是一種好發于早產兒的常見慢性肺部疾病，主要是由于囊泡期肺組織發育異常所致[1]，病理表現為肺血管異常和肺泡簡化。目前對于BPD的治療仍無有效的措施。BPD發病機制的研究顯示在肺組織發育過程中，肺泡管的發生與肺組織血管網的形成是同步的[2]，抑制肺組織內血管形成可導致肺泡發育簡化[3-4]，因此基于通過促進肺組織內血管網的形成來同步改善肺組織的肺泡化成為治療BPD的新思路。內皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPCs)是內皮細胞的前體細胞，具有很強的自我更新和高度增殖能力，并能分化為血管內皮細胞參與血管生成。臨床研究和動物實驗均發現EPCs的數量和功能與BPD發生相關[5-7]。然而，有實驗表明內皮細胞前體祖細胞并未直接通過分化為內皮細胞參與血管的形成[8]，動物研究顯示移植EPCs定植于損傷的肺組織數量極少，EPCs旁分泌因子能促進血管形成，維持血管內皮結構的完整，促進肺泡發育[9]。因此，本實驗主要研究EPCs培養上清對新生鼠高氧肺損傷的治療作用及其可能的機制。

材 料 和 方 法

1 EPCs的分離、培養與鑒定[10-11]

用10%水合氯醛麻醉出生5～7 d清潔級SD大鼠，75%酒精消毒四肢，分離出股骨、脛骨和肱骨，在超凈臺中用D-PBS沖洗骨髓腔，收集骨髓沖洗液，應用Ficoll淋巴細胞分離液(Sigma-Aldrich)密度梯度離心分離出骨髓中的單個核細胞，用添加hEGF、Hydrocortisone、VEGF、hFGF-B、R3-IGF-1、Ascorbic acid、FBS等成分的EBM培養基，即EGM-2MV完全培養基(LONZA)重懸，以每孔2×106的密度接種于纖連蛋白(Sigma-Aldrich)包被過夜的6孔板中培養3 d，去除未貼壁細胞，每3 d換液，待細胞融合度達70%時進行傳代。倒置顯微鏡下觀察記錄細胞的生長特點。

培養所得的爬片細胞與DiI-ac-LDL(Biomedical Technologie, 終濃度 10 mg/L) 37 ℃避光孵育4 h，D-PBS洗3遍，4%多聚甲醛固定20 min，D-PBS洗3遍，再與FITC-UEA-1(Sigma；終濃度為10 mg/L)孵育1 h，熒光顯微鏡下觀察雙染細胞即為EPCs。

2 實驗方法

2.1 EPCs培養上清的收集 培養的第3代EPCs用PBS清洗后，加入不含生長因子的內皮細胞基礎培養基(endothelial cell basal medium， EBM；購自LONZA)，培養24 h后收集上清，移入Amicon? ultra-4，10 kD超濾管(Millipore)內，4 ℃ 3 000×g離心35 min，收集濃縮后上清備用。Bradford法測蛋白濃度，調整蛋白濃度至50 μg/100 μL， -80 ℃保存備用。

2.2 實驗對象分組 清潔級健康SD孕鼠(復旦大學上海醫學院動物中心)，待其自然分娩，選擇1日齡新生鼠作為研究對象，雌雄不限。隨機分為空氣組(control組)、高氧(hyperoxia，H)組、EBM干預組和內皮祖細胞培養上清(endothelial progenitor cell-conditioned medium， EPC-CM)干預組，每組10只。各組處理如下：空氣組：仔鼠在空氣(21% O2)中飼養21 d；高氧組：仔鼠在85% O2中飼養21 d；EBM干預組：仔鼠在85% O2中飼養21 d，在第14天時經氣管給予每只仔鼠100 μL EBM 1次；EPC-CM干預組：仔鼠在85% O2中飼養21 d，在第14天時經氣管給予每只仔鼠100 μL EPC-CM(含50 μg 蛋白)。

2.3 高氧BPD模型的建立[11]訂制塑料高氧箱52 cm×40 cm×31 cm,在容器上設立3個不同的孔區，一個作為進氣孔，一個用作出氣孔，第3孔區與測氧儀相連，箱內放溫度濕度計監測箱內溫度和濕度，使箱內溫度控制在25 ℃～26 ℃，同時濕度控制在60%～70%。高氧組將1日齡SD新生鼠置于氧箱中，不間斷輸入氧氣，測氧儀每日3次監測箱內氧氣濃度，使氧濃度維持在85%左右，每天定時開箱30 min添加水及飼料，更換墊料和干燥劑，并與正常對照組交換母鼠以避免母鼠因氧中毒致喂養能力下降。正常對照組置于同一室內空氣中。EBM干預組和EPC-CM干預組在第14天，用異氟烷麻醉仔鼠，在頸部切開一小口，分離尋找到氣管，用100 μL微量注射器分別給予100 μL EBM或100 μL EPC-CM。第21天腹腔注射10%水合氯醛(8 mL/kg)處死小鼠，打開胸腔，結扎右側肺門，取出右肺，用于mRNA的檢測； 0.9%生理鹽水持續灌流沖洗肺循環以去除循環細胞，經氣管注入4%多聚甲醛固定左肺組織，完整取出后置于4%多聚甲醛中固定24 h，石蠟包埋，制備常規5 μm切片，留做病理檢測。所有動物實驗均通過我院動物實驗倫理委員會批準。

2.4 檢測指標及方法 (1)肺發育形態學觀察: 常規制備5 μm切片，經HE染色后，于光鏡下(×100)觀察肺組織形態變化；(2)肺組織輻射狀肺泡計數(radical alveolar count，RAC)測量：從呼吸性細支氣管中心至最近纖維隔(或胸膜)作垂線，計數垂線經過的肺泡數，每只仔鼠取4張切片，每張切片隨機選取10個非重復視野計數，取平均值；(3)肺組織肺泡平均線性截距(mean linear intercept，MLI)測量：利用Image-Pro Plus軟件，每只仔鼠取5張切片，每張切片在光鏡(×200)下選取至少10個視野，十字交叉法測量經十字線的肺泡間隔(NS)數目，同時測量十字線的總長(L)，根據公式MLI=L/NS計算；(4)微血管密度(microvascular density)測定：FVIII存在于血管內皮細胞胞漿內，免疫組織化學方法檢測FVIII在肺組織的表達，參考Weidner血管計數法[12]，在低倍鏡(×100)下尋找血管密度較高的區域，然后在高倍鏡(×200)下計數血管密度，每只仔鼠取3張切片，每張切片取10個非重復視野，計數VIII因子染色陽性的血管數；(5)肺組織角質細胞生長因子(keratinocyte growth factor，KGF)、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、表面活性蛋白A(surfactant protein A，SP-A)和表面活性蛋白C(surfactant protein C，SP-C) mRNA表達的檢測：利用Trizol (Invitrogen)提取肺組織總RNA,將1 mg的RNA用PrimeScript? RT試劑盒(TaKaRa)逆轉錄成cDNA。每個生物學指標用2 μL 的cDNA 采用SYBR? Premix Ex TaqTMII試劑盒(TaKaRa)進行實時熒光PCR分析。反應條件為： 95 ℃ 30 s； 95 ℃ 5 s， 60 ℃ 30 s， 40個循環；生成熔解曲線。GAPDH 作為內參照。各生物學指標的引物見表1。檢驗目的基因和內參基因擴增效率是否一致，如果一致，采用2-ΔΔCt方法進行相對定量分析。

3 統計學處理

表1 引物序列

應用SPSS 19.0統計軟件進行統計學處理。數據均以均數±標準差(mean±SD)表示。多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Bonferroni法，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 EPCs的培養與鑒定

倒置顯微鏡下觀察收集的骨髓單個核細胞，第3天可見貼壁細胞大部分為小圓形，部分細胞呈短梭形，培養至第5～7天可見細胞呈典型鋪路石樣集落生長(圖1)。貼壁細胞用DiI-acLDL和FITC-UEA-1行熒光化學染色鑒定，EPCs胞漿攝取DiI-acLDL呈紅色；細胞膜結合FITC-UEA-1呈綠色，雙染色陽性為橙色，表明是正在分化的EPCs，見圖2。

Figure 1.The morphological observation of endothelial progenitor cells (×100). On the 3rd day, the cells were small and round; on the 6th day, typical cobblestone-like colony appeared.

圖1 內皮祖細胞形態學特點

2 動物體重的變化

空氣組、高氧組、EBM干預組及EPC-CM干預組新生大鼠在第 1天體重間差異無統計學顯著性，至第21天，4組體重的差異具有統計學意義(P<0.05)，高氧組和EBM干預組較空氣組體重顯著下降(P<0.05)，EPC-CM干預組與空氣組體重間的差異無統計學顯著性，見表2。

Figure 2.The abilities of EPCs to uptake DiI-ac-LDL and bind to FITC-UEA-1 (×100). EPCs uptaking DiI-ac-LDL appeared red under fluorescence microscope, and EPCs binding to FITC-UEA-1 appeared green. The double staining was orange, suggesting the differentiating EPCs. The nucleus was blue with DAPI.

圖2 EPC攝取DiI-ac-LDL和結合FITC-UEA-1的熒光圖像

表2 各組大鼠體重的變化

Table 2.The changes of the body weight of the rats with different treatments (g.Mean±SD.n=10)

Age(d)AirgroupHyperoxiagroupHyperoxia+EBMgroupHyperoxia+EPC?CMgroup16．44±0．666．34±0．816．31±0．906．45±0．872142．79±5．5631．68±7．42?30．93±7．68?35．34±7．93

*P<0.05vsair group.

3 肺泡化的觀察

光鏡下觀察HE染色肺組織顯示，空氣組肺泡結構規整，肺泡大小均一，肺泡間隔較薄；高氧組與EBM干預組肺泡數量減少，肺泡腔增大出現肺泡簡化，同時可見局部肺泡間隔增厚；EPC-CM干預組肺泡腔增大程度較高氧組和EBM干預組改善，見圖3。

Figure 3.HE staining of lung tissue under light microscope. The scale bar=200 μm. Control: air group; H: hyperoxia group; H-EBM: hyperoxia+EBM group; H-EPC-CM: hyperoxia+EPC-CM group.

圖3 光鏡下肺組織HE染色觀察

4組仔鼠肺組織RAC計數分別為：空氣組(9.02±0.30)個，高氧組(3.67±0.51)個，EBM干預組(3.81±0.11)個，EPC-CM干預組(6.97±0.36)個。4組間RAC計數差異有統計學意義(P<0.05)，高氧組、EBM干預組及EPC-CM干預組的RAC計數較空氣組明顯降低(P<0.05),高氧組及EBM干預組較EPC-CM干預組明顯降低(P<0.05)，見圖4。

4組仔鼠肺組織MLI測量分別為：空氣組為(37.18±3.44) μm，高氧組為(43.31±3.33) μm，EBM干預組為(42.81±2.66) μm，EPC-CM干預組為(40.02±3.86) μm。4組間MLI的差異有統計學意義(P<0.05)，高氧組、EBM干預組的MLI較空氣組顯著增寬(P<0.05)，EPC-CM干預組與空氣組相比MLI的差異無統計學顯著性，EPC-CM干預組和高氧組、EBM干預組的MLI比較差異無統計學顯著性，但可見降低的趨勢，見圖4。

Figure 4.The radical alveolar count (RAC; A) and the alveolar mean linear intercept (MLI; B) in each group. Control: air group; H: hyperoxia group; H-EBM: hyperoxia+EBM group; H-EPC-CM: hyperoxia+EPC-CM group. Mean±SD.n=10.*P<0.05vscontrol；#P<0.05vsH-EPC-CM.

圖4 各組間輻射狀肺泡計數和肺泡平均線性截距

4 肺微血管密度的測量

各組肺組織VIII因子的免疫組化染色顯示肺組織血管密度，胞漿黃棕色顆粒為陽性染色，陽性分布為圍繞血管內皮細胞的棕黃色染色(圖5)。4組間微血管密度的差異存在統計學顯著性(P<0.05)，高氧組和EBM干預組的微血管密度較空氣組顯著降低(P<0.05)，高氧組和EBM干預組的微血管密度較EPC-CM干預組顯著降低(P<0.05)，而EPC-CM干預組的微血管密度與空氣組相比差異無統計學顯著性，見圖6。

Figure 5.Factor VIII staining for microvascular density (×200). The scale bar=100 μm. Control: air group; H: hyperoxia group; H-EBM: hyperoxia+EBM group; H-EPC-CM: hyperoxia+EPC-CM group.

圖5 FVIII染色顯示微血管密度

Figure 6.The microvascular density in each group. Control: air group; H: hyperoxia group; H-EBM: hyperoxia+EBM group; H-EPC-CM: hyperoxia+EPC-CM group. Mean±SD.n=10.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsH-EPC-CM.

圖6 各組微血管密度計數

5 肺組織KGF和VEGF的mRNA表達

4組肺組織KGF和VEGF的mRNA表達水平差異有統計學意義(P<0.05)。高氧組、EBM干預組及EPC-CM干預組較空氣組顯著降低(P<0.05)，高氧組與EBM干預組較EPC-CM干預組顯著降低(P<0.05)，見圖7。

6 肺組織SP-A和SP-C的mRNA表達

4組肺組織SP-A和SP-C的mRNA表達水平的比較見圖8。高氧組、EBM干預組和EPC-CM干預組較空氣組明顯降低(P<0.05)，并且高氧組和EBM干預組較EPC-CM干預組明顯降低(P<0.05)。

Figure 7.The relative mRNA expression of KGF (A) and VEGF (B) in each group. Control: air group; H: the hyperoxia group; H-EBM: hyperoxia+EBM group; H-EPC-CM: hyperoxia+EPC-CM group. Mean±SD.n=10.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsH-EPC-CM.

圖7 各組間 KGF和VEGF mRNA的相對表達

討 論

本實驗表明在85% O2的環境下暴露21 d可抑制終末肺泡腔的形成，造成肺泡腔變大，發生肺泡簡化，并抑制肺組織內血管的形成，使新生鼠肺組織發生類似BPD的病理變化，本課題組的前期研究[11，13]已成功地建立此高氧BPD模型。

我們的研究發現經氣管滴入EPC-CM可改善高氧對肺組織造成的傷害，增加肺泡數量，降低MLI，增加肺組織內血管密度，提示EPC培養上清對高氧暴露大鼠肺結構有改善作用。Rehman等[14]早在2003年就證實EPC能通過旁分泌方式表達和釋放許多信號分子，如VEGF、肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)、粒細胞集落刺激因子(gra-nulocyte colony-stimulating factor，G-CSF)、粒-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)等。Kim等[15]的研究也表明具有內皮祖細胞特性的人臍帶血來源的干細胞(human cord blood-derived stem cells，hCB-SCs)能夠分泌多種細胞因子及趨化因子，如轉化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)、血小板源性生長因子(platelet-derived growth factor，PDGF)、堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)、KGF和VEGF，并且能分泌具有募集干細胞功能的細胞因子G-CSF和GM-CSF，hCB-SCs可通過這些分泌因子促進內皮細胞或內皮祖細胞向傷口處聚集，加速傷口愈合。本課題組前期的研究也發現，EPCs可分泌VEGF、FGF10等肺發育相關生長因子，其旁分泌因子可促進高氧暴露下的肺泡II型上皮細胞增殖，抑制其分化為肺泡 I 型上皮細胞[10]。有研究發現EPC-CM 可抑制肺微血管內皮細胞凋亡，促進其增殖[16]。Alphonse 等[9]研究發現內皮細胞集落形成細胞培養上清(endothelial colony-forming cells-derived conditioned media，ECFC-CdM) 可促進體外培養的ECFC 網狀結構的形成，避免高氧所造成的損傷；將ECFC-CdM 經腹腔注入高氧暴露的新生小鼠也可促進肺泡發育，肺血管形成，降低肺動脈高壓的發生。Baker 等[17]的研究也證明了內皮祖細胞來源的旁分泌因子可促進肺動脈內皮細胞及肺泡II型細胞的增殖，促進高氧暴露下肺動脈內皮管樣結構的形成。Ikutomi等[18]的研究表明晚期集落形成EPCs(late-outgrowth EPCs，LOC)不單是通過直接分化為內皮細胞，還通過旁分泌因子來改善血管內皮的損傷，抑制血管內膜的增生。

Figure 8.The relative mRNA expression of SP-A (A) and SP-C (B) in each group. Control:air group; H: hyperoxia group; H-EBM: hyperoxia+EBM group; H-EPC-CM: hyperoxia+EPC-CM group. Mean±SD.n=10.*P<0.05vscontrol；#P<0.05vsH-EPC-CM.

圖8 各組間SP-A和SP-C mRNA的相對表達

我們進一步通過RT-PCR檢測肺組織內KGF、VEGF、SP-A和SP-C在mRNA水平上的表達，發現KGF、VEGF、SP-A和SP-C的表達在EPC-CM治療組較單純高氧組顯著增高。在肺組織內KGF主要由間質細胞產生[19]，是一種具有促進AECII增殖，抑制炎癥反應的生長因子[20-22]。Fons 等[23]的研究發現成纖細胞生長因子(fibroblast growth factor，FGF)/成纖維細胞生長因子受體(fibroblast growth factor receptor，FGFR)通路激活可募集循環EPCs至血管形成部位，促進血管的生成，KGF作為FGF的家族成員，EPCs分泌蛋白在促進肺組織KGF生成的同時，也許會促進FGF家族其它成員的增加，參與高氧肺組織的損傷修復。另外，Frank 等[24]的研究發現KGF也可調控肺泡上皮間質性改變，降低肺組織纖維化，改善肺組織形態結構。結合我們的研究結果，EPC-CM改善肺結構可能與促進肺內KGF基因高表達相關。VEGF是一種重要的血管內皮生長因子，其高表達可明顯增加血管的形成，促進肺組織肺泡化[25]，并對不成熟肺組織的發育有促進作用[26]。我們的研究中，EPC-CM組肺內VEGF mRNA的表達顯著增高，提示EPC-CM能夠促進肺內VEGF高表達，發揮促血管生成和修復血管內皮的作用。SP-A和SP-C是重要的肺表面活性物質，由II型肺泡上皮細胞合成，SP-A主要參與肺組織免疫應答，保護肺組織上皮細胞免受炎癥因子的損傷[27-29]。SP-C主要降低肺表面張力的增加，充足的SP-C有助于維持肺泡擴張，避免發生肺不張。EPC-CM干預組，SP-A和SP-C mRNA的表達增加提示，EPC-CM 可能直接或間接地作用于肺泡II型上皮細胞，促進、維持和修復肺泡II型上皮細胞的活性與功能。

本研究采用新生大鼠骨髓來源EPCs，更好地保留了EPCs的干細胞特性，其增殖分泌能力較成年大鼠骨髓來源EPCs強。首次將EPCs培養上清經氣道干預高氧暴露所致BPD大鼠模型，使EPC-CM直接作用于肺組織，避免了對其它部位造成的影響，更有利于最大限度地發揮在肺內的作用。EPCs移植是目前血管修復和再生領域有前景的治療策略，也是BPD 防治的重要方法。但移植EPCs的功能受體內環境的影響，治療效果并不理想。本研究表明，應用EPC-CM可促進高氧暴露肺損傷大鼠肺泡化和肺血管發育，這可能與其促進肺內KGF和VEGF mRNA的表達相關。該結果提示優化單純的細胞移植方法，如應用EPCs分泌蛋白或相當的合成制劑模擬生理性EPCs旁分泌功能，或應用某一基因修飾的EPCs，可為BPD 防治策略提供新思路。

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[26]Compernolle V, Brusselmans K, Acker T, et al. Loss of HIF-2alpha and inhibition of VEGF impair fetal lung maturation, whereas treatment with VEGF prevents fatal respiratory distress in premature mice[J]. Nat Med, 2002, 8(7):702-710.

[27]Carreto-Binaghi LE, Aliouat EM, Taylor ML. Surfactant proteins, SP-A and SP-D, in respiratory fungal infections: their role in the inflammatory response[J]. Respir Res, 2016, 17(1):66.

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[29]Goto H, Mitsuhashi A, Nishioka Y. Role of surfactant protein A in non-infectious lung diseases[J]. J Med Invest, 2014, 61(1-2):1-6.

(責任編輯： 林白霜， 羅 森)

TGF-β/Smad2/3信號在肌成纖維細胞增殖期間需要Wnt/β-catenin信號的激活

動物模型與人類疾病中的纖維化與Wnt/β-連環蛋白(β-catenin)通路的異常活化有關。盡管經過廣泛的研究努力，目前科學家仍未發現有效治療纖維化的方法。肌成纖維細胞(myofibroblasts)是纖維化的主要效應細胞，負責細胞外基質沉積。抑制肌成纖維細胞增殖對于纖維化的治療至關重要。肌成纖維細胞的增殖可引發一系列效應，從而導致纖維化。近年來，Wnt通路被認為是纖維化疾病的主要影響因素，但其介導的促纖維化的具體機制仍不甚清楚的。轉化生長因子β(transforming growth factor-β, TGF-β)和肌成纖維細胞活性在纖維化發病機制中的核心作用已經被普遍接受，然而這兩個過程之間相互作用的細節仍不清楚。Xu等的研究檢測了纖維化標志性蛋白[波形蛋白(vimentin)、α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)和膠原蛋白I(collagen I)]和TGF-β信號通路分子(包括 Smad2/3 及其磷酸化形式p-Smad2/3)的持續表達水平，并詳細分析β-catenin介導的可能分子機制，包括上皮-間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition)和成纖維細胞向肌成纖維細胞的轉變，以及信號網絡的調節中β-catenin活性增強，以抵消自分泌的TGF-β/Smad2/3信號。該研究主要提出了對纖維化機制的新認識，即TGFβ1-Smad2/3信號通過Wnt/β-catenin激活上皮和間充質細胞，從而有助于肺纖維化的形成。

J Cell Mol Med, 2017, 21(8):1545-1554(李肖肖)

Endothelial progenitor cell-conditioned medium improves lung structure in neonatal rats exposed to hyperoxia

LI Zhi, LU Ai-zhen, ZHANG Xiao-mei, QIAN Li-ling

(Children’sHospitalofFudanUniversity,Shanghai201102,China.E-mail:llqian@126.com)

AIM: To investigate the therapeutic effect of endothelial progenitor cell-conditioned medium (EPC-CM) on the lung structure of neonatal rat exposed to hyperoxia, and to explore the mechanisms.METHODS: Bone marrow-derived endothelial progenitor cells (EPCs) were collected from new born Sprague-Dawley (SD) rats and the EPCs were identified. The conditioned medium from the passage 3 EPCs was collected. Newborn SD rats (n=40) were randomly divided into 4 groups. The rats in room air group were exposed to the room air (21% O2) for 21 d. The rats in hyperoxia group were exposed to hyperoxia (85% O2) for 21 d. The rats in endothelial cell basal medium (EBM) group were exposed to hyperoxia for 21 d, and

100 μL EBM on postnatal day 14 (P14) in a single intratracheal (IT) injection. The rats in EPC-CM group were exposed to hyperoxia for 21 d, and received 100 μL EPC-CM on P14 in a singlie IT injection. The rats were sacrified on the 21st day. The left lungs were excised， placed in 4% paraformaldehyde, serially dehydrated in ethanol and embedded by paraffin. Serial sectioning of the paraffin-embedded left lung tissues was prepared for 5 μm thickness, and stained with hematoxylin and eosin. The pulmonary radical alveolar count (RAC) and alveolar mean linear intercept (MLI) were then calculated. The microvascular density was determined by FVIII immunostaining. The mRNA expression of KGF, VEGF, SP-A and SP-C in the right lung tissues was detected by real-time fluorescence quantitative PCR. RESULTS: The cultured cells had typical EPC morphological characteristics, and had the abilities to bind to FITC-UEA-1 and uptake DiI-ac-LDL. The body weight of the rats on day 21, RAC, MLI and microvascular density were significantly lower in hyperoxia group and EBM group than those in room air group (P<0.05). The EPC-CM group had significantly higher RAC and microvascular density than those in hyperoxia group and EBM group (P<0.05), but the body weight and MLI had no significant difference. The mRNA expression levels of KGF, VEGF, SP-A and SP-C in hyperoxia group and EBM group were significantly lower than those in room air group (P<0.05). The mRNA expression levels of KGF, VEGF, SP-A and SP-C in EPC-CM group were significantly higher than those in hyperoxia group and EBM group (P<0.05). CONCLUSION: EPC-CM promotes the lung alveolarization and microvascular formation in neonatal rats exposed to hyperoxia. These benefits may be correlated with the increased KGF and VEGF mRNA expression.

Hyperoxia; Endothelial progenitor cells; Lung injury; Paracrine

1000- 4718(2017)08- 1467- 08

2017- 03- 07

2017- 04- 17

國家自然科學基金資助項目(No. 81270727)

R363； R722.1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.08.020

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△通訊作者 Tel: 021-64931913; E-mail: llqian@126.com