SIRT3在脫氧膽酸誘導人正常結腸上皮NCM460細胞能量代謝損傷中的作用*

王傳杰， 周 洋， 張 萌， 周 英， 徐佳琪， 朱敏航， 詹 琳， 周乾毅， 袁 瓊

(武漢科技大學醫學院藥學系， 湖北 武漢 430065)

SIRT3在脫氧膽酸誘導人正常結腸上皮NCM460細胞能量代謝損傷中的作用*

王傳杰， 周 洋， 張 萌， 周 英， 徐佳琪， 朱敏航， 詹 琳， 周乾毅， 袁 瓊△

(武漢科技大學醫學院藥學系， 湖北 武漢 430065)

目的： 探討脫氧膽酸(deoxycholic acid，DCA)對人結腸上皮NCM460細胞能量代謝損傷的影響及可能機制。方法: 培養人正常結腸上皮NCM460細胞，采用DCA(10 μmol/L、30 μmol/L和100 μmol/L)作用5 d，或DCA(100 μmol/L)作用3、5和7 d；DCA(100 μmol/L)處理3 d后，用去乙酰化酶sirtuin 3 (SIRT3)激動劑白藜蘆醇(resveratrol，REV)處理細胞后繼續培養至第7天。細胞腺苷三磷酸(adenosine triphosphate，ATP)和乳酸生成量用試劑盒檢測，Western blot 檢測細胞的SIRT3表達。結果: DCA能濃度和時間依賴性地抑制NCM460細胞生成ATP并促進乳酸生成，抑制SIRT3蛋白表達；白藜蘆醇能逆轉DCA對NCM460細胞的作用。結論: DCA對人結腸上皮NCM460細胞的能量代謝具有損傷作用，其損傷作用與SIRT3相關。

脫氧膽酸； 能量代謝； 乳酸； 腺苷三磷酸； Sirtuin 3； 白藜蘆醇

膽汁排入腸腔后，初級膽汁酸在回腸和結腸上段經細菌水解和脫羥基作用轉化為次級膽汁酸，包括脫氧膽酸(deoxycholic acid，DCA)和石膽酸，其中DCA是次級膽汁酸中活性最強的成分[1]。有研究結果顯示DCA對正常的結腸上皮細胞具有損傷作用。DCA能誘導結腸上皮細胞內氧化應激水平從而改變線粒體膜通透性[2-3]，釋放細胞色素C并激活凋亡誘導因子(apoptosis-inducing factor, AIF)等促進結腸上皮細胞的損傷[4-5]，然而，DCA是否能誘導結腸上皮細胞能量代謝障礙導致損傷尚未見文獻報道。

Sirtuin家族成員通過對組蛋白及多種非組蛋白的乙酰化修飾參與細胞分化、凋亡、衰老及腫瘤發生等多個生理病理過程[6]。其中依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的去乙酰化酶sirtuin 3 (SIRT3)的主要功能是催化線粒體應激反應蛋白去乙酰化[7]。近期質譜實驗顯示至少65%的線粒體蛋白賴氨酸乙酰化，而SIRT3表達增高抑制了線粒體蛋白的乙酰化水平[8]。在SIRT3缺陷小鼠模型中發現，SIRT3參與調節代謝、腺苷三磷酸(adenosine triphosphate，ATP)生成和氧化應激反應等多種線粒體功能。研究證實SIRT3在有氧呼吸第二、三階段均能發揮作用，它通過對蛋白的去乙酰化從而催化三羧酸循環過程中的相關作用酶活性引起ATP生成增加[8]。細胞內線粒體功能障礙從而對有氧氧化造成影響導致的能量代謝損傷是否與SIRT3對有氧呼吸的調節有關目前尚無定論。

本研究通過離體細胞實驗探討DCA誘導結腸上皮細胞能量代謝受損及SIRT3是否參與該過程。

材 料 和 方 法

1 試劑及藥物

脫氧膽酸(Sigma)；新生牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)；RPMI-1640培養基(Thermo)；BCA試劑盒和細胞線粒體分離試劑盒(碧云天)；白藜蘆醇(同田生物)；兔抗人SIRT3及鼠抗人β-actin抗體(Santa Cruz)；乳酸測定試劑盒(南京建成公司)；ATP檢測試劑盒(南京建成公司)。

2 實驗方法

2.1 細胞實驗方案 細胞實驗分為3部分：(1)探討DCA誘導細胞能量代謝障礙的量效作用，采用DCA(10 μmol/L、30 μmol/L和100 μmol/L)干預5 d；(2)探討DCA對細胞能量代謝影響的時效性，DCA(100 μmol/L)處理 3 d、5 d和7 d；(3)探討SIRT3涉及DCA的損傷作用，采用sirtuin家族激動劑白藜蘆醇(resveratrol，REV)干預處理，實驗分為4組：正常組；REV組，REV(10 μmol/L)處理4 d; DCA 組，DCA(100 μmol/L)處理7 d; DCA+REV組，DCA(100 μmol/L)干預3 d后，REV (10 μmol/L)與DCA同時繼續干預4 d。

2.2 細胞培養及給藥處理 人正常結腸上皮細胞系NCM460購于廣州吉尼歐生物科技公司，常規復蘇，RPMI-1640培養基于恒溫培養箱中37 ℃、5% CO2培養。

2.3 乳酸及ATP測定 各組干預完成后收集細胞培養液上清，采用乳酸測定試劑盒測定細胞乳酸生成量，收集細胞采用細胞線粒體分離試劑盒分離線粒體，ATP檢測試劑盒測定細胞ATP生成量，實驗嚴格按照測定試劑盒說明書進行操作。

2.4 Western blot檢測SIRT3的蛋白表達 采用RIPA裂解液裂解細胞收集蛋白，BCA比色法測定總蛋白濃度，每孔40 μg蛋白上樣，蛋白凝膠電泳、轉膜，5%脫脂奶粉封閉，TBST洗膜3次，分別加入抗SIRT3的抗體(1∶1 000)和抗β-actin抗體(1∶1 000)4 ℃孵育過夜。TBST洗膜3次后孵育II抗(1∶1 000)1 h，ECL顯影。

3 統計學處理

所有數據均用均數±標準誤(mean±SEM)表示。組間差異采用單因素方差分析(one-way ANOVA)和Student-Newman-Keuls多重比較檢驗分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 DCA干預對NCM460細胞線粒體ATP生成的影響

采用不同劑量的DCA處理正常的結腸上皮細胞NCM460，檢測線粒體生成ATP能力。結果顯示與對照組相比，DCA能劑量依賴性地抑制NCM460細胞線粒體生成ATP，并在DCA濃度為100 μmol/L時，線粒體合成ATP能力最低(P<0.01)。DCA(100 μmol/L)分別處理NCM460細胞3 d、5 d和7 d均能顯著抑制ATP生成的作用，且具有時間依賴性(P<0.01)，見圖1。

Figure 1.The effect of deoxycholic acid (DCA) on the ATP production in the mitochondria of NCM460 cells. DCA inhibited the ATP production in a dose-dependent manner (A) and a time-dependent manner (B). Mean±SEM.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsDCA (0 μmol/L) group.

圖1 脫氧膽酸對NCM460細胞線粒體合成ATP的影響

2 DCA干預對NCM460細胞乳酸生成的影響

以不同劑量的DCA處理正常的結腸上皮細胞NCM460，檢測細胞乳酸的生成能力。結果顯示與對照組相比，DCA能劑量依賴性地促進NCM460細胞生成乳酸，并在DCA濃度為100 μmol/L時，合成乳酸能力最強(P<0.01)。DCA (100 μmol/L)分別處理NCM460細胞3 d、5 d和7 d均能顯著增加乳酸的合成，且具有時間依賴性(P<0.01)，見圖2。

Figure 2.The effect of daeoxycholic acid (DCA) on the lactic acid (LD) production of NCM460 cells. DCA inhibited the LD production in a dose-dependent manner (A) and a time-dependent manner (B). Mean±SEM.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsDCA (0 μmol/L) group.

圖2 脫氧膽酸對NCM460細胞乳酸生成的影響

3 DCA干預對NCM460細胞SIRT3蛋白表達的影響

與對照組相比，DCA能劑量依賴性地抑制NCM460細胞SIRT3蛋白的表達，且當DCA濃度達100 μmol/L時，SIRT3的蛋白表達水平最低(P<0.01)。DCA(100 μmol/L)分別處理NCM460細胞3 d、5 d和7 d，SIRT3的蛋白表達呈時間依賴性下降，且處理7 d時表達水平最低(P<0.01),見圖3。

Figure 3.The effect of deoxycholic acid (DCA) on the protein expression of SIRT3 in the NCM460 cells. DCA inhibited the protein expression of SIRT3 in a dose-dependent manner (A) and a time-dependent manner (B). Mean±SEM.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsDCA (0 μmol/L) group.

圖3 脫氧膽酸對 NCM460細胞中SIRT3蛋白表達的影響

4 白藜蘆醇干預對DCA處理后的NCM460細胞能量代謝的影響

為了進一步探討SIRT3在DCA損傷中的作用，本實驗應用sirtuin家族激動劑白藜蘆醇進行反證。如圖4所示，以DCA(100 μmol/L)處理NCM460細胞至第3天，白藜蘆醇(10 μmol/L)繼續處理4 d。DCA處理的NCM460經白藜蘆醇干預后細胞的乳酸生成顯著降低(P<0.01)；DCA處理的NCM460細胞經白藜蘆醇干預后細胞線粒體的ATP生成顯著升高(P<0.01)。

Figure 4.The effect of resveratrol on ATP and lactic acid (LD) production level induced by deoxycholic acid (DCA). Resveratrol (10 μmol/L， 4 d) reversed the effect of DCA on ATP (A) and LD (B) production. Mean±SEM.n=3.**P<0.01vsnormal group;##P<0.01vsDCA (100 μmol/L) group.

圖4 白藜蘆醇抑制脫氧膽酸對NCM460細胞ATP和乳酸生成的影響

討 論

腸黏膜屏障由物理屏障和生化屏障兩部分構成，前者主要由腸道上皮細胞和側面的細胞緊密連接等組成，后者主要由各種消化酶、抗菌肽等化學物質及免疫相關組織、細胞等組成，可阻止腸腔內致病菌和毒素等進入血液循環，而腸黏膜屏障功能受損參與多種疾病的發生發展[9-11]。施行膽囊切除的患者或長期進食高脂、高蛋白食物的人群腸腔內次級膽汁酸(DCA和石膽酸)的含量增加[1]。然而，長期暴露于DCA會造成結腸上皮細胞的損傷。研究證實，DCA通過結合磷酸鞘氨醇受體2，促進組織蛋白酶B的釋放，可以劑量依賴性地激活NLRP3炎癥小體活性，并進一步促進IL-1β的生成從而介導結腸炎的發生[12]。此外，在DCA誘導的結腸損傷細胞中發現，ERK及P38的活性明顯提升，且上調ERK的表達可抑制細胞凋亡從而促進局部炎癥部位組織增生[13]。能量代謝損傷的產生主要原因之一是線粒體功能障礙[14]。近期研究人員通過增加細胞線粒體的質量，能有效地逆轉乳酸生成的增多，增加ATP產生[15]。本研究結果顯示DCA能濃度及時間依賴性地抑制結腸上皮細胞線粒體ATP的生成、促進乳酸生成。該結果提示DCA能通過引起結腸上皮細胞線粒體能量障礙而導致結腸損傷。

SIRT3定位于線粒體，其主要功能是催化線粒體應激反應蛋白去乙酰化[7]，包括乙酰輔酶A合成酶2[16-17]、谷氨酸脫氫酶[18-19]、NADH脫氫酶[泛]1α-亞復合亞基9等在內的有氧呼吸各階段關鍵酶活性均與SIRT3介導的去乙酰化調節有關。線粒體功能異常與其內部多種酶的乙酰化水平增高有關[20]。SIRT3被證實能通過抑制線粒體DNA損傷阻斷心肌成纖維細胞分化和肺纖維化[21]。實驗首次證實，DCA能濃度和時間依賴性地抑制SIRT3表達；預先給予SIRT3激動劑白藜蘆醇能逆轉DCA對結腸上皮細胞ATP生成的抑制作用及其增加乳酸生成作用。該結果提示SIRT3表達下調介導了DCA誘導的結腸上皮細胞能量代謝障礙。

綜上所述，本研究首次發現DCA對結腸上皮細胞的線粒體能量代謝造成損傷作用，該作用可能與其抑制SIRT3表達下調引起線粒體功能障礙有關。然而，該機制還需進一步確證。

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(責任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Role of SIRT3 in dysfunction of energy metabolism induced by deoxycho-lic acid in human colon NCM460 cells

WANG Chuan-jie, ZHOU Yang, ZHANG Meng, ZHOU Ying, XU Jia-qi， ZHU Min-hang, ZHAN Lin, ZHOU Qian-yi, YUAN Qiong

(DepartmentofPharmacology,MedicalCollege,WuhanUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430065,China.E-mail:yuanqiong@wust.edu.cn)

AIM: To investigate the effect of deoxycholic acid (DCA) on the energy metabolism in human normal colon epithelial NCM460 cells. METHODS: NCM460 cells was treated with DCA at 10, 30 and 100 μmol/L for 5 d， or DCA at 100 μmol/L for 3, 5 and 7 d. After treated with DCA at 100 μmol/L for 3 d, the cells were treated with resveratrol, the activator of sirtuin 3 (SIRT3)， for the next 4 d. Adenosine triphosphate (ATP) production in the mitochondria and lactate acid level were detected. The protein expression of SIRT3 was determined by Western blot. RESULTS: DCA inhibited the ATP production, increased lactate acid level, and downregulated the protein expression of SIRT3 in a dose- and time-dependent manner. Resveratrol at 10 μmol/L reversed the effects of DCA on the NCM460 cells. CONCLUSION: DCA induces the dysfunction of energy metabolism in NCM460 cells, and the mechanism may be related with SIRT3.

Deoxycholic acid; Energy metabolism; Lactate acid; Adenosine triphosphate; Sirtuin 3; Resvertrol

1000- 4718(2017)08- 1494- 05

2016- 10- 31

2017- 05- 22

武漢科技大學大學生科技創新基金(No. 15ZRA167)

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.08.024

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