GYY4137對小鼠原代肝細胞胞質內脂質分解的影響*

王紅鋼， 張優敬， 皇甫超申， 王 軍， 吳東棟， 鐘培育， 王國英， 李彥章

(河南大學基礎醫學院， 河南 開封 475004)

·短篇論著·

GYY4137對小鼠原代肝細胞胞質內脂質分解的影響*

王紅鋼， 張優敬， 皇甫超申， 王 軍， 吳東棟， 鐘培育， 王國英， 李彥章△

(河南大學基礎醫學院， 河南 開封 475004)

目的： 探討新合成的硫化氫(H2S)供體GYY4137對小鼠原代肝脂肪變性細胞胞質內脂質分解的影響。方法: 體外用油酸誘導肝細胞脂肪變性模型。采用兩步原位灌流法分離C57BL/6小鼠原代肝細胞并分為4組：對照組用正常培養液培養54 h；模型組用含1.2 mmol/L油酸(溶于10% BSA)的培養液培養48 h，再用RPMI-1640培養液培養6 h； H2S組和DL-炔丙基甘氨酸(PAG；胱硫醚γ-裂解酶抑制劑，抑制H2S合成)組則用含有1.2 mmol/L油酸的培養液培養48 h，再用無血清無酚紅的RPMI-1640培養液(分別給予含有1 mmol/L GYY4137和200 μmol/L PAG)培養6 h。測量細胞甘油釋放量及胞內激素敏感性脂肪酶(HSL)的蛋白表達量。結果: 和模型組相比， H2S組培養液中甘油釋放量和磷酸化HSL(p-HSL)蛋白表達水平明顯降低，而PAG組又明顯升高。結論: 在小鼠原代脂肪變性肝細胞中，GYY4137可能通過抑制HSL的磷酸化水平而減少胞質內脂質分解。

硫化氫； 胞質內脂質分解； 肝細胞； 油酸

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一種普遍的肝病，它主要由脂肪在肝細胞中過度聚集導致[1]。在肝細胞中，有2條甘油三酯分解途徑，一條是脂質自嗜分解途徑，另一條是胞質內脂質分解途徑。肝細胞胞質內脂質分解減弱是其脂肪變性的重要原因[2]。

硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)是哺乳動物體內一種重要的氣體信號分子，在脂代謝和心肌細胞損傷等生理病理過程起重要作用，它在哺乳動物體內以半胱氨酸為底物，在胱硫醚γ-裂解酶(cystathionine γ-lyase，CSE)、胱硫醚β-合酶(cystathionine β-synthase，CBS)及3-巰基丙酮酸硫基轉移酶(3-mercaptopyruvate sulfurtransferase，3-MST)的催化下產生[3-4]。激素敏感性脂肪酶(hormone-sensitive lipase，HSL)是脂肪分解過程中的關鍵酶，它被蛋白激酶磷酸化后具有活性，催化脂肪分解[5]。GYY4137是一個新合成的H2S供體，能在生理溫度和pH下的溶液中緩慢持續地釋放H2S，可較好地模擬體內H2S 釋放過程[6]。在正常生理條件下，外源性或內源性H2S能影響脂質代謝，其機制還未完全清楚[7]。研究顯示，抑制小鼠脂肪細胞中CSE/H2S系統可增強胞質內脂質分解作用，減輕脂肪堆積，而外源性H2S則會降低脂肪分解作用[8]，由此本課題組推測外源性H2S可能對脂肪變性肝細胞胞質內脂質分解具有調節作用。本文用GYY4137作為H2S的供體，用油酸(oleic acid，OA)誘導建立肝脂肪變性模型，在體外研究外源性H2S對小鼠原代肝細胞胞質內脂質分解的影響，為NAFLD的臨床藥物治療及H2S相關藥物研究提供一定的理論依據。

材 料 和 方 法

1 實驗動物

實驗采用4～6周齡雄性C57BL/6小鼠(南京大學動物模型中心)，18～22 g，毛發光亮無脫毛，四肢無缺陷，全身無畸形及腫塊，攝食、活動度和精神狀態良好。

2 方法

2.1 細胞及其分組 按照Seglen的兩步灌流法[9]分離小鼠原代肝細胞。實驗分為對照(control)組(RPMI-1640培養液+10%BSA)、模型(model)組(RPMI-1640培養液+10%BSA+1.2 mmol/L OA)、H2S組和DL-炔丙基甘氨酸(DL-proparylglycine，PAG；CSE抑制劑，抑制H2S合成)組(用RPMI-1640培養液+10%BSA+1.2 mmol/L OA孵育原代肝細胞48 h后，分別給予1 mmol/L GYY4137和200 μmol/L PAG處理6 h)。

2.2 油紅染色 PBS洗3遍，4%多聚甲醛固定10 min，37 ℃避光油紅染色20 min， 再用50%異丙醇清洗20 s，雙蒸水洗3遍, 然后在倒置熒光顯微鏡下拍照。

2.3 MTT法檢測不同濃度油酸對小鼠原代肝細胞細胞活力的影響 肝細胞以1×107/L、每孔0.2 mL接種于96孔細胞培養板中，培養24 h后在培養液內分別加入不同濃度油酸(0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mmol/L)繼續培養48 h后，各孔分別加入MTT試劑(5 g/L) 20 μL，培養4 h后棄培養液，各孔分別加入150 μL DMSO并震蕩5 min，在酶標儀上測定570 nm處的吸光度(A)值，細胞活力=A處理組/A對照組×100%。上述實驗重復3次。

2.4 Western blot PBS清洗細胞3遍，每孔加入200 μL RIPA裂解液，混勻后室溫靜置10 min，然后將細胞轉移至1.5 mL的離心管中，在冰上震蕩裂解5 min，12 000×g、4 ℃離心，取上清按照BCA試劑盒檢測蛋白濃度。上樣50 μL，100 V電泳45～60 min，轉膜后取出PVDF膜，用TBST清洗10～15 min。 I 抗用含脫脂奶粉的TBST稀釋(1∶1 000)，室溫孵育2 h， TBST緩沖液洗PVDF膜10 min，洗3次，加入 II 抗(1∶1000稀釋，HRP標記)室溫孵育2 h， TBST緩沖液洗PVDF膜10 min×3次，加入顯色液照相保存結果。

2.5 檢測細胞甘油釋放量 收集各組細胞培養液，4 ℃、12 000×g離心10 min，吸取上清按照試劑盒的說明書(原理：在ATP存在下甘油被甘油激酶磷酸化為3-磷酸甘油，再被甘油磷酸氧化酶氧化產生過氧化氫；過氧化氫在過氧化物酶作用下轉化為苯醌亞胺，苯醌亞胺光密度值與甘油濃度成正比)，用比色法測量培養基中的甘油含量。

3 統計學處理

統計分析采用GraphPad Prism 5統計軟件。數據以均數±標準差(mean±SD)表示，采用單因素方差分析比較組間均數的差異， 以P<0.05 表示差異有統計學意義。

結 果

1 倒置顯微鏡下的小鼠原代肝細胞的形態

分離的小鼠原代肝細胞的純度和存活率均在95%以上，在倒置顯微鏡下，細胞貼壁，并具有典型的肝細胞形態: 細胞呈不規則圓形或多邊形，邊界輪廓清晰，胞體很大，核呈圓形或橢圓形，有單核或雙核，見圖1。

Figure 1.The morphology of mouse primary hepatocytes under inverted microscope (×200).

圖1 倒置顯微鏡下小鼠原代肝細胞的形態

2 MTT實驗確定誘導液中油酸的適宜濃度

為確定誘導液中合適的油酸濃度，本實驗用MTT法測量不同濃度油酸誘導后肝細胞的活力，結果表明誘導液中油酸濃度在0.8～1.2 mmol/L時，肝細胞活力較高，當誘導液中油酸的濃度大于1.2 mmol/L或小于0.8 mmol/L時，細胞活力明顯下降。

本實驗用1.2 mmol/L OA誘導肝細胞48 h后進行油紅染色，結果顯示細胞生長狀態良好，且肝細胞胞質內有大量脂滴積聚，提示肝細胞脂肪變性模型構建成功，見圖2、3。

Figure 2.The effect of different concentrations of OA on the viability of mouse primary hepatocytes detected by MTT assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 mmol/L;#P<0.05vs1.2 mmol/L.

圖2 不同濃度油酸對肝細胞活性的影響

Figure 3.The lipid accumulation in the hepatocytes induced by OA (oil red O staining, ×400). OA at 1.2 mmol/L was used to induce hepatocytes for 48 h to establish the steatosis model. The fat drops were indicated by the arrows. A: control group; B: model group.

圖3 油酸誘導肝細胞脂質蓄積

3 H2S對肝細胞胞質內的脂質分解的影響

肝細胞釋放至培養液的甘油量可反映胞質內脂質分解的狀況[10]。收集細胞培養液并檢測其中細胞釋放的甘油量，結果顯示對照組培養液中含甘油較少；模型組細胞培養液中甘油量比對照組顯著增多(P<0.05)；H2S組培養液中甘油量又比模型組顯著減少(P<0.05)；和H2S組相比，PAG組細胞培養液中甘油量顯著增多(P<0.05)，提示胞質內脂質分解可被外源性H2S抑制，見圖4。

Figure 4.The effect of H2S on the glycerin release from the he-patocytes. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsmodel group;△P<0.05vsH2S group.

圖4 H2S對肝細胞甘油釋放量的影響

4 H2S對肝細胞胞質內激素敏感性脂肪酶蛋白表達量的影響

檢測結果顯示，各組細胞中總的激素敏感性脂肪酶(total HSL，t-HSL)的表達均無顯著差異；模型組細胞中磷酸化的激素敏感性脂肪酶(phosphorylated HSL，p-HSL)與對照組相比顯著增多(P<0.05)； H2S組細胞中p-HSL表達水平比模型組顯著降低(P<0.05)，提示外源性H2S可抑制HSL的磷酸化，見圖5。

Figure 5.The effect of H2S on the phosphorylation of HSL in the hepatocytes. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsmodel group.

圖5 H2S對肝細胞內激素敏感性脂肪酶磷酸化的影響

討 論

肝臟在脂質代謝中有重要作用，其功能異常可導致NAFLD。肝細胞在生理條件下可分解脂肪，但不儲存脂肪；過多的脂肪在肝細胞內聚集成脂滴，代償性地增加胞質內脂質分解[11]，本實驗選用肝細胞甘油釋放量作為衡量肝細胞胞質內脂質分解代謝的指標。

體外油酸孵育細胞是制作細胞脂肪變性模型的常用方法[12]。本文選用1.2 mmol/L油酸既成功誘導建立脂肪變性模型，同時又最大程度地消除油酸細胞毒性對實驗結果的影響。HSL是胞質內催化脂肪分解的關鍵酶，該酶的磷酸化形式具有活性，可催化胞質內甘油三酯分解，因此HSL磷酸化水平可反映胞質內脂肪分解的強弱。作為一種新型H2S緩釋劑，GYY4137在高劑量時有細胞毒性，而少劑量時又不能顯著改變胞內H2S水平[13]。研究表明，GYY4137可抑制大鼠脂肪細胞中HSL的活性，抑制脂肪細胞胞質內脂質分解[14]，但對肝細胞中HSL的影響還不清楚。本文用油酸誘導小鼠原代肝細胞建立脂肪變性模型，發現來源于GYY4137的H2S可抑制胞質內脂質分解，同時胞質內p-HSL水平降低，因此本文推測，GYY4137可能通過抑制HSL的磷酸化而減弱胞質內的脂質分解。若該推測成立，將為NAFLD臨床治療開創一個新的思路，也為開發H2S藥物提供堅實的基礎。本文又發現模型組胞質內的脂質分解及p-HSL水平均比對照組增強，提示油酸誘導可導致胞質內脂質分解的代償性增強。Geng等[8]研究表明，在小鼠脂肪細胞中，GYY4137可減少cAMP水平而抑制蛋白激酶A的激活，進而降低HSL磷酸化水平抑制胞質內脂質分解。本文中GYY4137究竟通過何種途徑抑制HSL的磷酸化有待進一步研究。有研究表明NaHS可通過促進脂代謝而改善小鼠肝脂肪變[7]，與本實驗結果矛盾，也可能本文結論只是GYY4137本身的副作用或者其它，其確切原因有待進一步研究。

綜上所述，在小鼠原代脂肪變性肝細胞中，外源性給予H2S供體GYY4137可能通過降低HSL的磷酸化水平而抑制由油酸誘導的胞質內脂質分解的代償性增強。

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(責任編輯： 盧 萍， 羅 森)

Effect of GYY4137 on cytosolic lipid decomposition in mouse primary hepatocytes

WANG Hong-gang, ZHANG You-jing, HUANG-FU Chao-shen, WANG Jun, WU Dong-dong, ZHONG Pei-yu, WANG Guo-ying, LI Yan-zhang

(TheBasicMedicalCollegeofHenanUniversity,Kaifeng475004,China.E-mail: 10190011@henu.edu.cn)

AIM: To evaluate the effect of GYY4137， a novel hydrogen sulfide (H2S) donor， on cytosolic lipid decomposition in mouse primary steatosis hepatocytes. METHODS: Oleic acid (OA) was used to induce hepatic steatosis modelinvitro. The C57BL/6 mouse primary hepatocytes isolated and cultured by 2-stepinsituperfusion were divided into 4 groups: the cells in control group were incubated with normal medium for 54 h; the cells in model group were incubated with OA at 1.2 mmol/L for 48 h followed by serum-free phenol red-free RPMI-1640 for 6 h; the cells in H2S group or DL-propar-gylglycine (PAG； an inhibitor of cystathione γ-lysase， inhibiting H2S synthesis) group were incubated with OA at 1.2 mmol/L for 48 h followed by serum-free phenol red-free RPMI-1640 which contained 1 mmol/L GYY4137 or 200 μmol/L PAG for 6 h. The glycerin release and the protein expression of hormone-sensitive lipase (HSL) in the cells were mea-sured. RESULTS: Compared with model group, the glycerin release and the protein expression of phosphorylated HSL (p-HSL) in H2S group decreased significantly， while those increased significantly in PAG group. CONCLUSION: In steatosis hepatocytes, exogenous H2S possibly decreases cytosolic lipid decomposition by decreasing the protein level of p-HSL.

Hydrogen sulfide； Cytosolic lipid decomposition； Hepatocytes； Oleic acid

1000- 4718(2017)08- 1520- 04

2017- 06- 05

2017- 06- 27

國家自然科學基金資助項目(No. 3130084)；河南省高校重點科研項目(No. 16A310001)

R575.5

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.08.028

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