3-甲基腺嘌呤聯合曲古霉素A抑制三陰性乳腺癌細胞生長*

朱 坤， 徐 明， 丁米娜， 林貞花， 陳麗艷,△

(延邊大學醫學院 1生物化學與分子生物學教研室， 2腫瘤研究中心， 吉林 延吉 133000)

3-甲基腺嘌呤聯合曲古霉素A抑制三陰性乳腺癌細胞生長*

朱 坤1， 徐 明2， 丁米娜1， 林貞花2， 陳麗艷1,2△

(延邊大學醫學院1生物化學與分子生物學教研室，2腫瘤研究中心， 吉林 延吉 133000)

目的： 探討自噬特異性抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)聯合組蛋白去乙酰化酶抑制劑曲古霉素A(TSA)對三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231生長的影響及其可能的分子機制。方法: MTT法檢測TSA對MDA-MB-231細胞活力的抑制作用；劃痕實驗檢測細胞遷移能力的變化；Western blot檢測細胞自噬相關蛋白的變化；MTT法檢測3-MA聯合TSA對細胞活力的影響。結果: TSA可有效抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞的生長，并呈劑量和時間依賴性；TSA抑制MDA-MB-231細胞的遷移能力，并誘導細胞發生自噬；3-MA可有效抑制TSA誘導的乳腺癌細胞自噬，并進一步抑制細胞活力，差異有統計學意義。結論: 3-MA可明顯增加TSA對三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231的生長抑制作用。

乳腺癌； 曲古霉素A； 3-甲基腺嘌呤； 自噬

三陰性乳腺癌約占乳腺癌的15%～20%，由于其缺乏臨床特異性的治療靶點，具有侵襲性強、易復發轉移等特點，受到廣泛的研究和關注[1-2]。自噬是細胞維持生存的重要機制之一，與腫瘤關系密切。研究表明，自噬在腫瘤發生發展中表現出雙刃劍作用：一方面，自噬可提高腫瘤細胞對不利環境的耐受能力，從而維持其生存；另一方面，自噬也可成為某些腫瘤細胞的死亡途徑[3]。有研究顯示，抑制自噬可增加某些化療藥物的療效。曲古霉素A(trichostatin A，TSA)屬于廣譜組蛋白去乙酰化酶抑制劑，是一種新型的抗腫瘤藥物[4]。本實驗旨在探討自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)聯合TSA對三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞生長的影響及其可能的分子機制，為臨床治療三陰性乳腺癌提供新的實驗依據。

材 料 和 方 法

1 材料

人乳腺癌MDA-MB-231細胞系由延邊大學腫瘤研究中心提供；TSA和3-MA購自Selleck；胎牛血清、DMEM培養基和青-鏈霉素等化學試劑為Gibco產品；MTT試劑及Western blot實驗相關試劑為Sigma產品；LC3B和β-actin抗體等為Cell Signaling Technology產品。

2 方法

2.1 細胞培養 MDA-MB-231細胞置于含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM培養基中，在37 ℃、5% CO2培養箱中常規培養，使用0.25%胰酶消化傳代。

2.2 MTT法檢測細胞活力變化 取對數生長期細胞，按每孔1×104接種于96孔板，37 ℃、5% CO2培養箱中常規培養，待細胞貼壁后加入不同濃度的TSA，每種濃度設6個平行復孔，對照組加入等體積的培養液。分別于24 h、48 h和72 h 后每孔加入50 μL的MTT(5 g/L)，4 h后終止培養吸棄上清，每孔加入100 μL的二甲基亞砜(DMSO)，用酶標儀在570 nm波長處測定各孔吸光度值，并按公式計算細胞生存率：細胞生存率(%)=實驗組吸光值/對照組吸光值×100%。

2.3 劃痕實驗檢測細胞遷移能力變化 將細胞接種于6孔板中培養，待細胞生長至90%，用 10 μL的槍頭垂直劃痕，PBS 洗3 次后加入無血清培養基，并給予相應濃度的TSA藥物處理；置 37 ℃、5% CO2培養箱中培養，分別在劃痕后 0 h、12 h和24 h 拍照，顯微鏡下測量劃痕間隙的距離。

2.4 Western blot實驗檢測細胞自噬相關蛋白的變化 乳腺癌細胞經藥物處理48 h后，加入RIPA裂解液提取總蛋白；Bradford法測定蛋白濃度；SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳進行蛋白分離并轉至PVDF膜上；5%脫脂奶粉室溫下封閉1 h；加入 I 抗(LC3B)后4 ℃過夜；室溫下洗膜，加入相應 II 抗孵育2 h；ECL 曝光，觀察并拍照。

3 統計學處理

采用SPSS 17.0軟件進行統計學分析。數據用均數±標準差(mean±SD)表示，組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 TSA對MDA-MB-231細胞活力及遷移能力的影響

TSA處理MDA-MB-231細胞24 h、48 h和72 h后，乳腺癌細胞的活力明顯受到抑制。隨著給藥劑量的增加，時間的延長，細胞吸收光密度值逐漸減小，細胞活力抑制率明顯增加，與未加藥對照組相比，差異具有統計學意義(P<0.05)，見圖1。倒置顯微鏡下可見，TSA給藥后活細胞數量明顯減少，細胞密度下降，細胞形態變小，固縮(圖2)。劃痕實驗結果顯示，應用不同濃度TSA處理MDA-MB-231細胞后，其劃痕愈合距離較未處理組細胞明顯縮短，且呈時間與濃度依賴性(P<0.05)，見圖3。

Figure 1.Effect of TSA on the vitality of MDA-MB-231 cells. Mean±SD.n=3

圖1 TSA對乳腺癌MDA-MB-231細胞活力的影響

Figure 2.Effect of TSA on the growth of MDA-MB-231 cells (×40).

圖2 TSA對乳腺癌MDA-MB-231細胞生長的影響

2 Western blot 檢測TSA處理后自噬相關蛋白的表達

與未加藥對照組細胞相比，TSA處理乳腺癌細胞后，給藥組的自噬標志性蛋白LC3-I型轉化為LC3-Ⅱ型明顯增多，以200 nmol/L TSA的作用效果最為顯著(P<0.05)，見圖4。

Figure 3.Effect of TSA on the migration ability of MDA-MB-231 cells (×40).

圖3 TSA對乳腺癌MDA-MB-231細胞遷移能力的影響

Figure 4.Expression of autophagy-related proteins in MDA-MB-231 cells induced by TSA. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖4 TSA誘導MDA-MB-231細胞自噬相關蛋白的表達

3 3-MA聯合TSA對MDA-MB-231細胞增殖的影響

為進一步檢測自噬抑制劑3-MA對TSA抑制MDA-MB-231細胞活力的影響，通過MTT法檢測了3-MA與TSA聯合處理MDA-MB-231細胞48 h后細胞活力的變化。結果表明，與TSA單獨給藥組比較，3-MA可進一步增加TSA對細胞活力的抑制作用(P<0.05)，見圖5。

Figure 5.Effect of 3-MA combined with TSA on the growth of MDA-MB-231 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group；#P<0.05vsTSA group.

圖5 3-MA聯合TSA對MDA-MB-231細胞生長的影響

4 3-MA對TSA誘導MDA-MB-231細胞自噬的影響

Western blot實驗結果表明，2.5 μmol/L的3-MA與100 nmol/L 的TSA聯合處理MDA-MB-231細胞48 h后，與TSA單獨用藥組比較，聯合用藥組細胞內自噬蛋白LC3-Ⅱ的表達明顯下調，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖6。

討 論

近年研究發現，組蛋白去乙酰化是腫瘤抑癌基因失活的重要機制。抑制組蛋白去乙酰化酶可在一定程度上逆轉抑癌基因的低乙酰化水平，從而介導腫瘤細胞的生長及分化[5]。TSA源自鏈霉菌代謝產物，是發現的第一個可抑制組蛋白去乙酰化酶的天然產物，研究證實TSA對多種腫瘤細胞具有抗癌活性并以其特異性、高效性及低毒性等特點而受到關注。本實驗通過體外培養三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞系，首先探討了TSA對細胞增殖及遷移能力的影響。實驗結果發現TSA可明顯抑制MDA-MB-231細胞的生長及遷移能力，并且抑制效應與時間及劑量呈正相關。

Figure 6.Effect of 3-MA combined with TSA on the autophagy of MDA-MB-231 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group；#P<0.05vsTSA group.

圖6 3-MA對TSA誘導MDA-MB-231細胞自噬的影響

有研究顯示，自噬與腫瘤發生發展密切相關，多種抗腫瘤治療都可誘導腫瘤細胞發生自噬[6-7]。LC3-Ⅱ是特異性表達在自噬小體膜的分子標識，可作為自噬的特異檢測指標。為探討TSA對三陰性乳腺癌細胞自噬作用的影響，本實驗通過蛋白印跡實驗分析了TSA給藥后乳腺癌MDA-MB-231細胞自噬相關蛋白的表達。實驗結果發現，100 nmol/L的TSA處理MDA-MB-231細胞48 h后，細胞內LC3B-Ⅱ的表達明顯上調，提示TSA對乳腺癌細胞具有明顯的誘導自噬作用。

有學者認為，自噬可降低腫瘤對某些化療藥的敏感性，提示自噬可能是細胞對抗腫瘤治療的一種耐受機制[8]。3-MA為自噬特異性抑制劑，既往研究報道3-MA可增強腫瘤細胞對放化療的敏感性，并促進腫瘤細胞的凋亡或自噬[9-10]，提示其作為聯合治療藥物之一，具有較好的臨床應用前景。因此，本文進一步探討了自噬抑制后TSA對三陰性乳腺癌的治療效果。結果發現，當3-MA與TSA聯合處理三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞后，聯合用藥組細胞自噬蛋白LC3-Ⅱ的活化得到有效抑制；同時細胞生長能力進一步受到抑制，表明自噬作用被抑制后，腫瘤細胞對TSA的敏感性得到增強，提示乳腺癌化療中存在的細胞自噬可能是化療抵抗的原因之一。

綜上所述，本研究結果證實，自噬抑制劑3-MA與TSA聯用可明顯抑制乳腺癌細胞的生長，其作用機制與腫瘤細胞的保護性自噬受到抑制密切相關。自噬抑制劑與化療藥物的聯用可為三陰性乳腺癌的治療提供更多的選擇。

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(責任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

3-MA combined with TSA inhibits growth of triple-negative breast cancer cells

ZHU Kun1, XU Ming2, DING Mi-na1, LIN Zhen-hua2, CHEN Li-yan1, 2

(1DepartmentofBiochemistryandMolecularBiology,2CancerResearchCenter,YanbianUniversityMedicalCollege,Yanji133002,China.E-mail:lychen@ybu.edu.cn)

AIM: To investigate the effect of 3-methyladenine (3-MA) combined with trichostatin A (TSA) on triple-negative breast cancer cells and the mechanism involved. METHODS: The viability of MDA-MB-231 cells was detected by MTT assay, the migration ability was determined by scratch assay, and the expression of autophagy-related proteins was detected by Western blot. RESULTS: TSA significantly inhibited the viability of MDA-MB-231 cells in a time- and dose-dependent manner. The results of scratch assay showed that TSA inhibited cell migration ability. Western blot data indicated that TSA resulted in a moderate increase in LC3-Ⅱ expression. Moreover, 3-MA inhibited cell autophagy induced by TSA, and combination of 3-MA and TSA further inhibited the viability of MDA-MB-231 cells. CONCLUSION: Combination of 3-MA and TSA may effectively inhibit the growth of triple-negative breast cancer cells．

Breast cancer; Trichostatin A; 3-methyladenine; Autophagy

1000- 4718(2017)08- 1524- 04

2016- 12- 23

2017- 03- 23

國家自然科學基金資助項目(No. 81460399 )

R730.23; R737.9

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.08.029

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△通訊作者 Tel: 0433-2435041; E-mail: lychen@ybu.edu.cn