BMP- 2和IGF- 1基因治療糖尿病骨折延遲愈合的作用和機制

吳良邦 吳水培 顧增輝

(杭州市解放軍117醫院骨科，浙江 杭州 310000)

BMP- 2和IGF- 1基因治療糖尿病骨折延遲愈合的作用和機制

吳良邦 吳水培1顧增輝

(杭州市解放軍117醫院骨科，浙江 杭州 310000)

目的 探討骨形態發生蛋白(BMP)- 2、胰島素生長因子(IGF)- 1基因治療糖尿病(DM)骨折延遲愈合的作用和機制。方法 選取6～7周齡雄性Wistar大鼠150只，分為骨折對照組、DM骨折組和治療組。利用酶聯免疫試劑盒檢測各組大鼠血清中BMP- 2、IGF- 1的表達；測定各組大鼠血清中堿性磷酸酶(ALP)的含量，以判斷對成骨細胞生長的影響；利用放射免疫競爭法檢測血清中骨鈣素的含量變化；利用局部骨密度儀檢測骨折區域局部骨密度的變化情況。結果 術后前3 w，DM骨折組與骨折對照組BMP- 2、IGF- 1的濃度均呈上升趨勢，第3周達到最大值，治療組BMP- 2含量在第2周達到最大值，IGF- 1的濃度在第3周達到最大，隨后開始下降、實驗中，治療組BMP- 2、IGF- 1的表達量最高，DM骨折組表達量始終最低。DM骨折組ALP與骨鈣素的含量始終顯著低于骨折對照組與治療組，骨折前3 w，治療組ALP與骨鈣素的含量顯著低于對照組骨折無顯著差異(P>0.05)。骨折區域局部骨密度檢測結果顯示治療組骨密度最高，骨折對照組其次，DM骨折組骨密度最低。結論 BMP- 2、IGF- 1基因通過提高DM大鼠骨折愈合過程中與成骨細胞增殖成熟相關的細胞因子的表達，促進骨折愈合過程中骨折區域局部骨密度的增加，從而顯著改善DM骨折延遲愈合情況。

糖尿病；骨折延遲愈合；骨形態發生蛋白- 2；胰島素生長因子- 1

糖尿病(DM)會導致骨質疏松，相較于健康人群而言，DM患者更易發生骨折，而且骨折后愈合延遲，甚至不愈合〔1,2〕。骨形態發生蛋白(BMP)- 2屬于轉化因子β超家族成員，是一種多功能的分泌性蛋白〔3〕。它能誘導骨髓間充質細胞分化成軟骨細胞和成骨細胞，促進新骨形成，同時它還能促進堿性磷酸酶(ALP)和骨鈣素的表達，促進骨基質蛋白表達，使細胞外基質礦化，從而促進骨細胞的成熟〔4,5〕。胰島素生長因子(IGF)- 1在骨組織的含量豐富，成骨細胞、破骨細胞和某些間質細胞均能合成IGF- 1，IGF- 1通過自分泌和旁分泌的方式調節骨代謝，促進骨髓基質干細胞以及成骨細胞的增殖和分化，它能刺激骨鈣素和膠原蛋白的合成，促進形成骨基質，進而促進骨折愈合〔6～8〕。研究發現在骨折區域局部注射BMP- 2等生長因子能明顯加快骨折愈合的速度〔9〕，但是外源生長因子提取困難，成本較高，而且臨床上應用時可能會出現免疫原性引起的不良反應。本研究旨在探討BMP- 2、IGF- 1基因對大鼠DM骨折愈合的作用效果。

1 材料與方法

1.1 一般資料 選取6～7周齡雄性Wistar大鼠150只，體重200～220 g。將大鼠放于有恒溫控制條件的動物室內進行飼養，光照時間/黑暗時間為12 h/12 h，平均濕度50%，室內平均溫度26℃，不限食水。飼養1 w后隨機將大鼠分為骨折對照組、骨折組、治療組，每組50只。

1.2 大鼠DM骨折模型制備 隨機選取100只大鼠禁食禁水12 h后腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)溶液，48 h后檢測大鼠的血糖以及尿糖含量，當血糖含量>16.7 mmol/L，尿糖為以上時對大鼠進行骨折手術處理，無菌條件下對大鼠進行麻醉后，鋸斷左腿脛骨，并進行縫合固定，術后單籠飼養，每日注射青霉素防止傷口感染，連續注射3 d。剩下的50只大鼠腹腔注射與實驗組相同劑量的檸檬酸鈉緩沖液，骨折處理同實驗組。

1.3 大鼠DM骨折治療模型制備 從制備好的100只DM骨折模型中隨機選取50只大鼠制備DM骨折治療組模型，胰酶消化事先培養的BMP- 2和IGF- 1共轉染的骨髓瘤基質干細胞，洗滌后進行細胞計數，調節細胞濃度為2×106個/ml，以每只大鼠注射0.4 ml細胞液的濃度，將細胞注入骨折局部區域制備治療模型。

1.4 血液樣品采集 造模后各組每周取一次血液樣品，連續取6 w，每次各選取6只大鼠取門靜脈血5 ml，離心后取血清置于-20℃保存。

1.5 酶聯免疫試劑盒檢測血清中BMP- 2、IGF- 1的表達 按照說明書稀釋標準液，分別設立空白對照孔、標準孔以及待測樣品孔，每孔做3個重復。空白孔不加試劑，標準孔加入50 μl稀釋好的標準品，待測樣品孔加入40 μl樣品稀釋液以及10 μl待測樣品，混勻后置于37℃培養箱培養30 min，去除孔中的液體，并加入稀釋過的洗滌液進行洗滌，按照說明書要求加入酶標試劑，混勻后置于37℃避光孵育10 min，加入終止液終止反應。將酶標板置于酶標儀中檢測450 nm吸光度值，并進行分析。

1.6 放射免疫競爭法檢測血清中骨鈣素的含量 利用骨鈣素試劑盒檢測所取樣品血清中骨鈣素的含量。將待測樣品以及標準液分別與標記抗原加入一起進行競爭性結合反應，置于4℃孵育20 h，待競爭反應達到平衡后，加入分離試劑室溫孵育15 min，離心棄上清，放射法測定沉淀物的放射性計數，制作標準曲線進行分析計算樣品中骨鈣素濃度。

1.7 骨密度檢測 術后連續6 w每組分別取6只大鼠進行處死，利用局部骨密度儀檢測大鼠以骨折端為中心的2.0 mm×1.5 mm區域內的骨密度，并進行記錄。

1.8 統計學方法 采用SPSS21.0軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1 各組大鼠血清中BMP- 2的表達情況 骨折對照組與DM骨折組術后第1～3周，BMP- 2的濃度逐步上升，第3周時達到最大值，隨后3 w逐步下降，前3 w兩組有顯著差異(P<0.05)，后3 w無統計學差異(P>0.05)。治療組在第2周濃度達到最大，隨后開始下降，但治療組與DM骨折組始終差異顯著(P<0.05)，1～4 w治療組顯著高于骨折對照組(P<0.05)，隨后2 w與對照組相比無顯著差異(P>0.05)。見表1。

2.2 各組大鼠血清中IGF- 1的表達情況 3組術后前3 w，血清中IGF- 1含量均逐步上升，第3周時達到最大值。DM骨折組和骨折對照組相比有顯著差異(P<0.05)，隨后3 w兩組逐步下降且無統計學差異(P>0.05)。治療組術后第4周濃度有所下降，但與DM骨折組相比差異顯著(P<0.05)，與骨折對照組在第6周比較有顯著差異(P<0.05)。見表2。

2.3 各組大鼠血清中ALP含量比較 3組ALP的含量均隨著時間的推移逐漸降低，ALP骨折組ALP下降最快，與骨折對照組相比差異顯著(P<0.05)，治療組顯著高于DM骨折組(P<0.05)，治療后前3 w顯著低于骨折對照組(P<0.05)，從第4周開始，治療組接近于骨折對照組，但兩組差異不明顯(P>0.05)。見表3。

2.4 各組大鼠血清骨鈣素濃度比較 前3 w 3組血清中骨鈣素的含量均隨著時間的推移均逐漸升高，在第3周達到最高值，之后開始下降。1～6 w DM骨折組與骨折對照組相比差異顯著(P<0.05)，治療組均顯著高于DM骨折組(P<0.05)，治療后前3 w顯著低于對照組(P<0.05)，但從第4周開始，治療組與對照組差異不明顯(P>0.05)。見表4。

表1 各組大鼠血清BMP- 2表達情況

與骨折對照組比較：1)P<0.05；與DM骨折組比較：2)P<0.05，下表同

表2 各組大鼠血清IGF- 1表達情況

表3 各組大鼠血清堿性磷酸酶變化情況

表4 各組大鼠血清骨鈣素變化情況

2.5 各組大鼠骨折處骨密度比較 術后大鼠的骨痂骨密度隨著時間的變化逐漸增大。在術后第1周，各組均沒有明顯差異，從術后第2周開始，DM骨折組顯著小于骨折對照組(P<0.05)，治療組顯著高于DM骨折組(P<0.05)，第2～3周治療組與骨折對照組相比無顯著差異(P<0.05)，從第4周開始，治療組顯著高于對照組(P<0.05)。見表5。

表5 各組大鼠骨折區域骨密度測定

3 討 論

DM屬于內分泌性疾病，其發生涉及血液循環系統、神經運動系統等多個系統。DM患者本身骨礦物質較健康人含量少，而高血糖或胰島素的缺乏也容易引起骨質疏松。

骨折愈合是一個復雜的生理過程，骨再生需要多種細胞因子參與，例如骨形態發生蛋白、成纖維細胞因子、轉化生長因子、核結合因子等都對成骨細胞的增殖分化以及對骨生成的調控具有重要作用，其中BMP- 2、IGF- 1對骨折愈合作用最顯著。BMP- 2誘導骨髓間基質干細胞分化成軟骨細胞和成骨細胞，IGF- 1能促進成骨細胞和成骨前體細胞形成骨基質，二者在促進新骨的形成具有重要作用〔10～12〕。本研究結果說明DM患者骨折愈合早期BMP- 2、IGF- 1表達量下降，引起骨折愈合延遲，基因治療能促進BMP- 2、IGF- 1的表達，消除DM對骨折愈合的不利影響。血清中ALP的水平是骨細胞早期分化的標志，能反映骨形成的能力，骨鈣素的表達水平反映了機體攝取鈣的能力，標志著骨細胞的成熟，二者的表達程度間接反映了骨的形成進程〔13，14〕。實驗數據表明DM骨折愈合過程中骨的改建過程因受DM的影響而有所滯后，基因治療能恢復DM小鼠骨折愈合過程的骨改建過程。骨密度直接反映了骨質量情況，是骨折危險性的一個重要依據〔15,16〕，骨密度越高，骨質量越好，說明基因治療能堅強骨骼，顯著改善DM引起的骨質疏松的問題，從而加快骨折愈合。本研究顯示DM導致的BMP- 2、IGF- 1生物活性因子含量的降低是延遲骨折愈合的重要因素，BMP- 2、IGF- 1基因治療通過提高BMP- 2、IGF- 1的含量，并改善與骨形成進程中相關的ALP和骨鈣素的含量，提高骨密度從而加快DM大鼠骨折愈合速度，為臨床治療DM骨折延遲愈合提供理論依據。

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〔2017- 05- 11修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

浙江省自然科學基金資助項目(No.Y2080991)

吳水培(1951- )，男，主任醫師，主要從事創傷修復研究。

吳良邦(1986- )，男，碩士，住院醫師，主要從事創傷修復研究。

R683

A

1005- 9202(2017)15- 3678- 04；

10.3969/j.issn.1005- 9202.2017.15.016

1 安徽醫科大學解放軍九八臨床學院