左歸丸對化療性卵巢早衰小鼠卵巢組織中縫隙連接蛋白43表達的影響Δ

孫曉峰，陽松威，賀又舜，陳 聰，龔力民，羅 令（.湖南中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院，長沙 4008；.湖南中醫(yī)藥大學藥學院，長沙 4008；3.中南大學湘雅三醫(yī)院骨科，長沙 4003）

左歸丸對化療性卵巢早衰小鼠卵巢組織中縫隙連接蛋白43表達的影響Δ

孫曉峰1＊，陽松威2，賀又舜1，陳 聰1，龔力民2，羅 令3#（1.湖南中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院，長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學藥學院，長沙 410208；3.中南大學湘雅三醫(yī)院骨科，長沙 410013）

目的：研究左歸丸對環(huán)磷酰胺（CTX）致卵巢早衰（POF）小鼠卵巢組織中縫隙連接蛋白43（Cx43）表達的影響，探討左歸丸治療化療性POF的作用機制。方法：將72只小鼠按體質量隨機分為空白組、模型組、戊酸雌二醇片組（陽性對照，0.000 13 g/kg）和左歸丸低、中、高劑量組（13.65、40.95、122.85 g/kg），每組10只。除空白組外，其余各組小鼠均ip CTX復制POF模型，每天1次，連續(xù)20 d；并同時ig相應藥物，每天1次，連續(xù)30 d。末次給藥2 h后，分別采用反轉錄-聚合酶鏈反應法和Western blot法檢測卵巢組織中Cx43 mRNA和蛋白表達；并采用免疫組化法檢測卵巢組織中Cx43蛋白的分布。結果：與空白組比較，模型組大鼠卵巢組織中Cx43 mRNA及蛋白表達均明顯減弱，卵泡與顆粒細胞中Cx43蛋白的分布明顯減少（P＜0.01）；與模型組比較，戊酸雌二醇片組和左歸丸中、高劑量組小鼠卵巢組織中Cx43 mRNA及蛋白表達均明顯增強，卵泡與顆粒細胞中Cx43蛋白的分布明顯增加（P＜0.01）。結論：左歸丸可上調CTX致POF小鼠卵巢組織中Cx43 mRNA及蛋白表達，增加Cx43在卵泡及顆粒細胞間的分布，改善縫隙連接功能，這可能是其治療POF的作用機制之一。

左歸丸；卵巢早衰；卵巢；縫隙連接蛋白43；小鼠

卵巢早衰（Premature ovarian failure，POF）是指女性在40歲之前出現的以卵巢功能衰退為主的婦科內分泌性疾病，其可引發(fā)心腦血管及神經系統(tǒng)病變，嚴重危害青年婦女的身心健康[1-3]。POF病因復雜，研究發(fā)現POF的發(fā)生與遺傳、染色體異常、自身免疫、醫(yī)源性損傷及顆粒細胞凋亡等因素有關[3-4]。其中，醫(yī)源性因素主要指化療因素，而環(huán)磷酰胺（CTX）是常用的化療藥，但其在治療惡性腫瘤的同時還會對卵巢造成損傷，會加速卵泡閉鎖，使卵巢組織纖維化，從而誘導POF的發(fā)生[5-6]。中醫(yī)學認為：“腎藏精，主生殖”。早在《素問·上古天真論》中就明確指出了腎中精氣的盛衰決定著機體的生、長、壯、老、已。中醫(yī)在防治生殖功能衰退方面已有幾千年的經驗總結，現代研究顯示補腎填精中藥具有增強生殖機能、抗衰老的作用，補腎填精法代表方劑左歸丸在臨床上就常用于卵巢早衰、圍絕經期綜合征、老年骨質疏松癥等的治療[7]。

間隙連接細胞間通訊（Gap junction intercellular communication，GJIC）又稱縫隙連接（Gap junction，GJ），是組織細胞間通過連接蛋白（Connexin，Cx）介導從而調節(jié)細胞新陳代謝、增殖分化以及機體內環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要方式[8-9]。研究發(fā)現，GJ廣泛存在于卵泡各種細胞間，在顆粒細胞、卵母細胞及膜細胞中均發(fā)現Cx的表達，其中Cx37與Cx43是與卵泡及顆粒細胞生理功能關系密切的兩種Cx。前期研究已證實，左歸丸可調節(jié)CTX致POF模型小鼠卵巢組織中Cx37 mRNA及蛋白表達[10-11]。在本實驗中，筆者將通過反轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）法、Western blot法及免疫組化法等技術研究左歸丸對CTX致POF模型小鼠卵巢組織中Cx43 mRNA及蛋白表達的影響，探討左歸丸治療化療損傷性POF的作用機制，為補腎填精法的應用提供實驗依據。

1 材料

1.1 儀器

Piko Real 96熒光定量PCR儀（美國Thermo公司）；Motic B5顯微攝像圖像分析系統(tǒng)（麥克奧迪實業(yè)集團公司）；164-5050電泳儀（美國Bio-Rad公司）；Olympus BX43雙目生物攝像顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；TGL-16臺式冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）。

1.2 藥品與試劑

左歸丸（由湖南中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院提供，批號：151012，規(guī)格：每1 g浸膏含左歸丸生藥1 g）；戊酸雌二醇片（德國拜耳醫(yī)藥保健有限公司，批號：113A，規(guī)格：1 mg/片）；注射用CTX（通化茂祥制藥有限公司，批號：131201，規(guī)格：0.2 g/瓶）；兔抗Cx43抗體（北京博奧森公司）；羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）/辣根過氧化酶（HRP）抗體（美國Santa Cruz公司）；二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒（北京碧云天生物研究所，批號：P0010S）；Trizol試劑（美國Invitrogen公司，批號：15596-026）；第一鏈cDNA合成試劑盒（立陶宛Fermentas公司，批號：K1631）；免疫組化檢測試劑盒（北京金杉中橋公司，批號：K126816B）。

1.3 動物

KM小鼠72只，SPF級，♀，體質量（18±2）g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，動物許可證號：SCK（湘）2011-0003。

2 方法

2.1 造模、分組與給藥

將72只小鼠按體質量隨機分為空白組、模型組、戊酸雌二醇片組（陽性對照，0.000 13 g/kg，根據人臨床用量的等效劑量換算而得，蒸餾水溶解）和左歸丸低、中、高劑量組（13.65、40.95、122.85 g/kg，根據臨床用量的1、3、9倍換算而得），每組12只。空白組小鼠ip等體積生理鹽水，其余各組小鼠ip CTX 30 mg/kg復制POF模型，注射體積均為20 mL/kg（生理鹽水溶解），每天1次，連續(xù)20 d。造模同時，各給藥組小鼠ig相應藥物，空白組和模型組小鼠ig等體積蒸餾水，20 mL/kg，每天1次，連續(xù)30 d。

2.2RT-PCR法檢測小鼠卵巢組織中Cx43 mRNA表達

末次給藥2 h后脫頸處死小鼠，剖開腹腔，摘取位于子宮末端的卵巢組織，剔除周圍附著的脂肪與結締組織。Trizol試劑提取卵巢組織總RNA，檢測RNA純度及濃度后，瓊脂糖電泳法檢測RNA完整性。然后參照試劑盒操作說明，將1 μg總RNA反轉錄合成cDNA后進行擴增。Cx43上游引物序列：5′-TGGTGTCCTTGGTGTCTCTC-3′，下游引物序列：5′-CAGGAGGAGACATAGGCGAG-3′，擴增片段大小：210 bp；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）上游引物序列：5′-CTCATGACCACAGTCCATGC-3′，下游引物序列：5′-TTCAGCTCTGGGATGACCTT-3′，擴增片段大小：155 bp。反應條件：94℃、3 min，94℃、30 s，59℃、30 s，72℃、45 s，共40個循環(huán)。參照文獻[12]方法分析實驗數據，以2－ΔΔct法（ct表示基本循環(huán)值）測定Cx43 mRNA基因相對表達量。試驗重復3次。

2.3 Western blot法檢測小鼠卵巢組織中Cx43蛋白表達

取部分小鼠卵巢組織，勻漿后以RIPA裂解液提取卵巢總蛋白，BCA法測定組織中總蛋白含量，然后進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳，電轉至硝酸纖維素（NC）膜上，以5%脫脂奶粉于37℃脫色搖床中封閉2 h，TBST緩沖液漂洗3次；加入Cx43抗體（1∶300），37℃脫色搖床中孵育2 h，TBST緩沖液漂洗3次；加入二抗（1∶40 000），37℃脫色搖床中孵育1 h；TBST緩沖液漂洗3次后將膜貼于玻璃紙上，以化學發(fā)光液（ECL）覆蓋后曝光，得到膠片，采用Gel Pro 4.0凝膠光密度（OD）分析軟件進行OD值分析。試驗重復3次。

2.4 免疫組化法檢測小鼠卵巢組織中Cx43分布

4%多聚甲醛浸泡固定卵巢組織樣本，石蠟包埋連續(xù)切片。采用PV-9000免疫組化二步法，將卵巢切片常規(guī)脫蠟入水，以3%過氧化氫（H2O2）孵育，磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗3次后滴加一抗（1∶100），于4℃下孵育過夜，PBS沖洗3次。滴加檢測試劑1，于37℃下孵育30 min，PBS沖洗3次；再滴加檢測試劑2，于37℃下孵育30 min，PBS沖洗3次，二氨基聯(lián)苯胺（DAB）溶液顯色；經自來水沖洗、復染、脫水、透明、封片等步驟后，采用Motic B5顯微圖像分析系統(tǒng)觀察Cx43蛋白的分布并進行OD值分析。

2.5 統(tǒng)計學方法

3 結果

3.1 各組小鼠卵巢組織中Cx43 mRNA及蛋白表達的測定結果

與空白組比較，模型組小鼠卵巢組織中Cx43 mRNA及蛋白表達均明顯減弱（P＜0.01）；與模型組比較，戊酸雌二醇片組和左歸丸中、高劑量組小鼠卵巢組織中Cx43 mRNA及蛋白表達明顯增強（P＜0.01）。各組小鼠卵巢組織中Cx43蛋白表達的電泳圖見圖1，Cx43 mRNA及蛋白表達測定結果見表1。

圖1 各組小鼠卵巢組織中Cx43蛋白表達的電泳圖Fig 1 Electrophoresis charts of Cx43 protein expression in ovarian tissue of mice in each group

表1 各組小鼠卵巢組織中Cx43 mRNA及蛋白表達測定結果（±s，n＝3）Tab 1 Determination results of Cx43 mRNA and protein expressions in ovarian tissue of mice in each group（±s，n＝3）

表1 各組小鼠卵巢組織中Cx43 mRNA及蛋白表達測定結果（±s，n＝3）Tab 1 Determination results of Cx43 mRNA and protein expressions in ovarian tissue of mice in each group（±s，n＝3）

注：與空白組比較，＊＊P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01Note：vs.blank group，＊＊P＜0.01；vs.model group，##P＜0.01

組別空白組模型組戊酸雌二醇片組左歸丸低劑量組左歸丸中劑量組左歸丸高劑量組Cx43蛋白表達量0.990±0.087 0.442±0.185＊＊0.753±0.052##0.518±0.025 0.686±0.036##0.753±0.033##劑量，g/kg 0.000 13 13.65 40.95 122.85 Cx43 mRNA表達量11.858±0.029 1.095±0.047＊＊8.431±0.664##2.050±0.700 4.216±1.105##6.381±0.302##

3.2 各組小鼠卵巢組織中Cx43蛋白分布觀察及OD值的測定結果

免疫組化結果顯示，空白組小鼠卵巢組織中Cx43蛋白的分布范圍較廣，不僅在成熟卵泡中大量分布，在顆粒細胞以及卵母細胞間也有分布；模型組小鼠卵巢組織中Cx43蛋白分布范圍明顯減小，視野范圍內基本未見Cx43蛋白的陽性信號；左歸丸低、中、高劑量組小鼠卵巢組織中Cx43分布范圍逐步增大，在顆粒細胞與卵母細胞中分布差異尤為明顯，其分布范圍呈明顯量-效關系。OD值分析顯示，與空白組（0.309±0.079）比較，模型組小鼠卵巢Cx43陽性表達（0.178±0.052）明顯減弱（P＜0.01）；與模型組比較，戊酸雌二醇片組和左歸丸中、高劑量組小鼠卵巢組織中Cx43陽性表達（依次為0.246±0.074、0.255±0.098、0.273±0.050）均明顯增強（P＜0.05或P＜0.01），左歸丸低劑量組小鼠卵巢組織中Cx43陽性表達（0.229±0.072）增強不明顯（P＞0.05），該結果與顯微觀察的Cx43蛋白分布結果一致。免疫組化圖見圖2。

圖2 各組小鼠卵巢組織中Cx43蛋白分布的免疫組化圖（×400）Fig 2 Immunohistochemistry of Cx43 protein distribution in ovarian tissue of mice in each group（× 400）

4 討論

哺乳動物的細胞間通訊有3種形式：（1）遠程通訊，是以激素為信息傳遞者，細胞分泌物經血液或淋巴遠距離運送到靶細胞；（2）短程通訊，即細胞間經狹窄的間隙傳遞信息，如化學性突觸等；（3）直接通訊，GJ就是細胞間直接通訊的結構基礎，兩相鄰細胞胞膜上的蛋白顆粒彼此相連形成孔對孔的直接交通管道，細胞間可借GJ進行某些小分子物質的交換和離子交換[13]。哺乳動物的卵泡由卵母細胞、顆粒細胞及卵泡基膜構成，顆粒細胞包圍著卵母細胞，基膜包被著顆粒細胞且是唯一與卵巢內毛細血管接觸的結構，同時卵丘細胞通過突出物與卵母細胞表面突起接觸，形成GJ，構成顆粒細胞-顆粒細胞、卵母細胞-顆粒細胞、膜細胞-顆粒細胞之間的通訊途徑，且均由GJ介導，對卵泡的生長發(fā)育及與卵巢內外環(huán)境進行信息傳遞起著重要的作用[14]。Cx作為GJ的基本結構單位，其構型的改變決定縫隙通道的開啟或關閉，又受到激素、鈣離子等因素的調控。其中Cx43是卵巢組織中表達最為豐富的Cx，主要表達于卵母細胞與顆粒細胞中，隨著卵泡發(fā)育逐漸增多，對于顆粒細胞的增殖及分層、維持卵泡的正常結構和功能具有重要作用[15-16]。

化療藥物（如CTX等）在殺傷病變細胞的同時對正常組織和細胞也具有較強的毒副作用，卵巢對化療藥物尤為敏感，化療時可損害正常細胞的DNA轉錄及蛋白合成，最終引起卵巢過早萎縮老化[17]。Cx43影響卵泡發(fā)育的主要途徑有以下幾種[18-19]：（1）影響原始生殖細胞遷移及胚胎卵巢發(fā)育；（2）維持顆粒細胞正常增殖及分層；（3）抑制卵巢顆粒細胞凋亡；（4）調節(jié)卵母細胞減數分裂進程；（5）調節(jié)卵巢重塑時期排卵、黃體形成、分化及退化過程；（6）調節(jié)激素或細胞因子轉錄、翻譯及表達過程。Cx43的缺失可導致卵泡發(fā)育、排卵及早期胚胎發(fā)育嚴重損傷，進而引發(fā)POF。

目前臨床上對于POF的治療多采取外源性雌激素替代療法、誘導排卵、免疫抑制劑及贈卵治療等。戊酸雌二醇片為臨床常用的雌激素替代藥，主要用于卵巢早衰、更年期綜合征的治療，可改善卵巢功能衰退引發(fā)的性激素分泌失調、下丘腦-垂體-卵巢軸功能紊亂等癥狀[20-22]。但此類藥物長期應用會產生明顯副作用，不易為患者接受。中醫(yī)認為，POF發(fā)生的根本原因是天癸耗竭、沖任虧虛，腎-天癸-沖任-胞宮軸功能衰退，可將其歸類為“閉經”“年未老而經水斷”“白合病”等范疇，臨床多以補腎填精為治療原則。左歸丸為補腎填精代表方，常用于治療卵巢早衰、圍絕經期綜合征及老年骨質疏松等疾病，療效確切[7]。前期實驗研究發(fā)現，左歸丸可有效改善CTX致POF小鼠卵巢的儲備功能、顆粒細胞凋亡及卵巢組織中Cx37蛋白表達，促進小鼠未成熟卵母細胞發(fā)育[11，23-24]。本實驗研究發(fā)現，CTX主要破壞顆粒細胞間、卵母細胞與顆粒細胞間GJ，表現為Cx43及mRNA表達量呈明顯下降趨勢，與卵泡閉鎖相關。而左歸丸可有效改善CTX導致的上述變化，增強顆粒細胞間、卵母細胞與顆粒細胞間聯(lián)系，促進卵泡的正常發(fā)育，這可能是其治療化療性POF的機制之一。

[1] Tong Y，Liao WX，Roy AC，et al.Absence of mutations in the coding regions of follicle-stimulating hormone receptor gene in Singapore Chinese women with premature ovarian failure and polycystic ovary syndrome[J].Hoem Metab Res，2001，33（4）：221-226.

[2] Venkatesh S，Kumar M，Sharma A，et al.Oxidative stress and ATPase6 mutation is associated with primary ovarian insufficiency[J].Arch Gynecol Obstet，2010，282（3）：313-318.

[3] Taylor AE.Systemic adversities of ovarian failure[J].J Soc Gynecol Invest，2001，8（1）：S7-S9.

[4] Li Y，Fang Y，Liu Y，et al.MicroRNAs in ovarian fuction and disorders[J].J Ovarian Res，2015，doi：10.1186/ s13048-015-0162-2.

[5] Verma S，Goldammer T，Aitken R.Cloning and expression of activation induced cytidine deaminase from Bos taurus [J].Ver Immunol Immunopathol，2010，134（3/4）：151-159.

[6] Matsuda F，Inoue N，Manabe N，et al.Follicular growth and atresia in mammalian ovaries：regulation by survival and death of granulosa cells[J].Reprod Dev，2013，58（1）：44-50.

[7] 劉立萍，姜波，李雪峰，等.補腎填精方對去卵巢骨質疏松模型大鼠膠原代謝的影響[J].時珍國醫(yī)國藥，2017，28（2）：821-823.

[8] Holder JW，Elmope E，Barrent JC.Gap junction functional cancer[J].Cancer Res，1993，53（1）：32-34.

[9] Su V，Lau AF.Connexins：mechanisms regulating protein levels and intercellular communication[J].FEBS Lett，2014，588（8）：1212-1220.

[10] Veitch GI，Gittens JE，Shao Q，et al.Selective assembly of connexin37 into heterocellular gap junction at the oocyte/ granulosa cell interface[J].J Cell Sci，2004，doi：10.1242/ jcs.01124.

[11] 陽松威，孫曉峰，賀又舜，等.左歸丸對化療致POF模型小鼠卵巢Cx37及mRNA表達的影響[J].中藥新藥與臨床藥理，2016，27（1）：33-38.

[12] Licak KJ，Schmittgen TD.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2－ΔΔCTmethod[J].Methods，2001，25（4）：402-408.

[13] 侯建華，芩堯，馬玉珍.間隙連接蛋白在卵泡發(fā)育過程中的作用[J].現代生物醫(yī)學進展，2012，12（9）：1791-1793.

[14] Matzuk MM，Burns KH，Viveiros MM，et al.Intercellular communication in the mammalian ovary：oocytes carry the conversation[J].Science，2002，doi：10.1126/science. 107/965.

[15] Ponsioen B，van Zeijil L，Moolenaar WH，et al.Direct measurement of cyclic AMP diffusion and signaling through connexin43 gap junctional channels[J].Exp Cell Res，2007，313（2）：415-423.

[16] Cecconi S，Ciccarelli C，Barrberi M，et al.Granulosa celloocyte interactions[J].Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol，2004，115（S1）：19-22.

[17] Desmeules P，Devine P.Characterizing the ovotoxicity of cyclophosphamide metabolites on cultured mouse ovaries [J].Toxicol Sci，2006，90（2）：500-509.

[18] 連紅梅，賈莉婷，張展，等.間隙連接蛋白Cx43和Cx37在多囊卵巢綜合征大數據卵巢中的表達及意義[J].中國婦幼保健，2008，23（32）：4622-4624.

[19] Borowczy KE，Johnson ML，Bilski JJ，et al.Expression of gap junctional connexins 26，32，and 43 mRNA in ovarian preovulatory follicles and corpora lutea in sheep[J].Can J Physiol Pharmacol，2006，84（10）：1011-1012.

[20] 李彥，趙純全.戊酸雌二醇片在婦產科的臨床應用進展[J].中國藥房，2014，25（10）：933-935.

[21] 陽松威，郭建生，王曉倩，等.補腎療更浸膏對去勢更年期模型大鼠神經內分泌功能失調的作用[J].中成藥，2016，38（3）：651-654.

[22] 陽松威，郭建生，王曉倩，等.補腎療更浸膏延緩老年小鼠卵巢功能衰退的實驗研究[J].中藥新藥與臨床藥理，2015，26（5）：613-618.

[23] 陽松威，孫曉峰，賀又舜，等.左歸丸對化療致卵巢早衰小鼠卵巢功能的影響[J].中成藥，2016，38（4）：717-722.

[24] 孫曉峰.左歸丸促進小鼠未成熟卵母細胞體外核成熟的實驗研究[J].現代生物醫(yī)學進展，2011，11（3）：444-447.

Effect of Zuogui Pill on the Expression of Gap Junction Protein 43 in Ovarian Tissue of Mice with Chemotherapy-induced Premature Ovarian Failure

SUN Xiaofeng1，YANG Songwei2，HE Youshun1，CHEN Cong1，GONG Limin2，LUO Ling3（1.College of TCM，Hunan University of Chinese Medicine，Changsha 410208，China；2.College of Pharmacy，Hunan University of Chinese Medicine，Changsha 410208，China；3.Dept.of Orthopedics，the Third Xiangya Hospital of Central South University，Changsha 410013，China）

OBJECTIVE：To study the effect of Zuogui pill on the expression of gap junction protein 43（Cx43）in ovarian tissue of mice with premature ovarian failure（POF）induced by intraperitoneal injection of cyclophosphamide（CTX），and explore its mechanism in the treatment of chemotherapy-induced POF.METHODS：72 mice were randomly divided into blank group，model group，Estradiol valerate tablet group（positive control，0.000 13 g/kg），Zuogui pill low-dose，medium-dose，high-dose groups（13.65，40.95，122.85 g/kg）by body mass，10 in each group.Except for blank group，other groups were reduce POF model by ip CTX，once a day，for 20 d.Meanwhile，the mice were intragastrically administrated related medicines，once a day，for 30 d.After 2 h of last administration，reverse transcription-polymerase chain reaction method and Western blot method were used to detect the Cx43 mRNA and protein expressions in ovarian tissue respectively，and immunohistochemistry method was adopted to detect the distribution of Cx43 protein in ovarian tissue.RESULTS：Compared with blank group，Cx43 mRNA and protein expressions in ovarian tissue of mice in model group were obviously weakened，and the distribution of Cx43 protein in follicle and granulocytes were obviously reduced（P＜0.01）.Compared with model group，Cx43 mRNA and protein expressions in ovarian tissue of mice in Estradiol valerate tablet group and Zuogui pill medium-dose，high-dose groups were obviously strengthened，and the distribution of Cx43 protein in follicle and granulocytes were obviously increased（P＜0.01）.CONCLUSIONS：Zuogui pill can increase the Cx43 mRNA and protein expressions in ovarian tissue of CTX-induced POF mice，increase the distribution of Cx43 in follicle and granulocytes and gap junction function，which may be one of the treatment mechanism of POF.

Zuogui pill；Premature ovarian failure；Ovarian；Gap junction protein 43；Mice

R285

A

1001-0408（2017）22-3044-04

2016-12-09

2017-02-19）

（編輯：林 靜）

國家自然科學基金資助項目（No.81303004）；湖南省科技廳資助項目（No.2009RS3018）；湖南省教育廳資助項目（No. 09C727）

＊副教授，博士。研究方向：中醫(yī)藥對女性生殖的影響。E-mail：2642724115@qq.com

#通信作者：教授，博士。研究方向：骨質疏松性骨折防治。E-mail：307068826@qq.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.22.06