參附注射液對慢性充血性心力衰竭大鼠心肌miRNA表達譜的影響Δ

施 洋，樊官偉（1.克拉瑪依市人民醫院藥劑科，新疆克拉瑪依 834000；2.天津市現代中藥重點實驗室/省部共建國家重點實驗室培育基地/天津中醫藥大學中醫藥研究院，天津 300193；3.天津中醫藥大學方劑學教育部重點實驗室，天津 300193）

參附注射液對慢性充血性心力衰竭大鼠心肌miRNA表達譜的影響Δ

施 洋1，2，3＊，樊官偉2，3#（1.克拉瑪依市人民醫院藥劑科，新疆克拉瑪依 834000；2.天津市現代中藥重點實驗室/省部共建國家重點實驗室培育基地/天津中醫藥大學中醫藥研究院，天津 300193；3.天津中醫藥大學方劑學教育部重點實驗室，天津 300193）

目的：研究參附注射液（SFI）對慢性充血性心力衰竭（簡稱心衰）大鼠心肌微小RNA（miRNA）表達譜的影響，以明確SFI抗心衰的作用靶點。方法：將40只大鼠按隨機數字表法分成假手術組（生理鹽水，ip）、模型組（生理鹽水，ip）、纈沙坦組（陽性對照，10 mg/kg，ig）和SFI組（0.75 mL/kg，im），每組10只，除假手術外的其余各組大鼠均復制心衰模型。造模成功后，各組小鼠每天給予相應藥物1次，連續給藥28 d后采用Affymetrix miRNAV4.0芯片技術對心衰大鼠心肌組織中miRNA表達進行分析，并篩選各組大鼠心肌組織中共同差異表達miRNA，以差異基因表達倍數大于或等于1.1為閾值分析心衰相關miRNA；利用基因本體論（GO）分析對差異表達基因進行功能分類及生物信號通路分析。結果：共篩選出29條共同差異表達miRNA，7條心衰相關miRNA（rno-miR-30c-1-3p、rno-miR-125b-5p、rno-miR-133a-5p、rno-miR-199a-5p、rno-miR-221-3p、rno-miR-146a-5p和rno-miR-1-3p），SFI能顯著下調心衰大鼠心肌組織中rno-miR-125b-5p、rno-miR-133a-5p、rno-miR-221-3p、rno-miR-1-3p表達（P＜0.05或P＜0.01）。GO分析結果顯示，差異表達miRNA主要與信號通路轉導、細胞質及核苷酸結合有關。結論：SFI參與下調心衰進展相關miRNA，進而經細胞質與核苷酸結合后影響相關信號通路的轉導，從而發揮其抗心衰作用。

參附注射液；慢性充血性心力衰竭；微小RNA；差異篩選；基因本體論分析

慢性充血性心力衰竭（簡稱心衰），是由心臟結構或功能異常導致的心室充盈或射血能力受損所致的一組復雜的臨床綜合征，已成為嚴重危害人類健康的頑疾之一，具有發病率高、病情危重、病死率高、預后不良等特點，其5年生存率與惡性腫瘤相仿[1]。據流行病學調查顯示，我國現有約1 000萬左右心衰患者，發病率為2%～3%，住院30 d的病死率為5.4%[2-3]。降低心衰患者病死率，延長心衰患者壽命并提高其生活質量已成為當今醫學界共同致力研究的焦點。

1 材料

1.1 儀器

Scanner3000型掃描儀、Hybridization Oven640型雜交爐、Fluidics Station450型洗滌工作站（美國Affymetrix公司）；UV1901型雙光束紫外-可見分光光度計（上海奧析科學儀器有限公司）；G2939A型2100質檢儀（美國Agilent公司）；2000型NanoDrop RNA濃度檢測儀（美國Thermo公司）；9700型定量聚合酶鏈式反應（Q-PCR）儀（美國ABI公司）；LX-300型離心機（江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司）。

1.2 藥品與試劑

SFI（雅安三九藥業有限公司，批號：141001010，規格：10 mL/支）；纈沙坦膠囊（北京諾華制藥有限公司，批號：X1711，規格：80 mg/粒）；注射用青霉素鈉（石家莊制藥集團有限公司，批號：017140617，規格：0.96 g/瓶）；FlashTag Biotin HSR RNA Labeling Kit（RNA標記試劑盒，美國Affymetrix公司）；GeneChip?Hybridization，Wash，and Stain Kit（基因芯片雜交、洗滌、染色試劑盒，美國Affymetrix公司）；mirVanaTMRNAIsolation KitAM1556（miRNA提取試劑盒，美國Thermo Fisher公司）。

1.3 動物

SPF級SD大鼠40只，♂，體質量（240±10）g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[合格證號：SCXK-（京）2012-0001]。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

將40只大鼠按隨機數字表法分為假手術組、模型組、纈沙坦組（陽性對照）及SFI組，每組10只。除假手術組大鼠行假手術外（只穿線不結扎），其余各組大鼠均采用冠狀動脈左前降支結扎術造成大鼠心肌梗死。術后連續ip青霉素鈉3 d抗感染，籠中飼養4周后檢測左室射血分數，若小于或等于35%則判定心衰模型造模成功[8-10]。造模成功后，纈沙坦組大鼠ig纈沙坦膠囊水溶液（10 mg/kg，根據臨床用量換算而得），SFI組大鼠im SFI（0.75 mL/kg，根據臨床用量換算而得），假手術組和模型組大鼠ip生理鹽水（10 mL/kg），每天1次，連續28 d。

我國在胸痛中心成立前，對于STEMI患者的救治多采用“綠色通道”和優化急救流程的方式，縮短救治時間［7-9］，但效果并不理想。目前我國已成立一千多家胸痛中心，并在治療這類患者中發揮了重要作用［10］。全國各地胸痛中心成立后，對 STEMI患者的救治方面產生了積極的影響。但目前以STEMI為代表的急性胸痛患者診療流程仍存在一些問題，因此，了解胸痛中心的救治現狀及存在的問題很有必要，同時可以為提出改進措施提供依據。

2.2 總RNA提取

給藥結束后，處死大鼠，取梗死邊緣區心肌組織200 mg，立即浸入液氮中迅速降溫后置于－80℃超低溫冰箱中保存，備用。按照mRNA提取試劑盒的相關操作說明進行操作，提取心肌組織中的總RNA。

2.3 Affymetrix miRNAV 4.0表達譜芯片試驗

取提取的心肌組織總RNA，采用分光光度計分別在波長為260、280 nm處測定其吸光度（A），A260/A280比值在1.8～2.0之間為較純RNA。通過2100質檢儀對RNA進行檢測，定義RNA分子完整數（RIN）≥7且28S/18S≥0.7為質量合格RNA。然后依次經過加尾、生物素標記、雜交、洗滌、染色和掃描等步驟完成表達譜芯片試驗。此項工作由上海歐易生物醫學科技有限公司完成。

2.4 差異表達miRNA分析

將假手術組、模型組、纈沙坦組、SFI組4個組按照實驗目的進行兩兩配對，得到假手術組與模型組、模型組與纈沙坦組、模型組與SFI組3個配對組，分別對經表達譜試驗篩選的差異miRNA進行列表比較，從而得到各配對組差異表達miRNA。再取上述3個配對組交集，得到各組共同差異表達miRNA，運用Q-PCR儀定量檢測差異miRNA的表達水平。之后查閱文獻并以差異基因表達倍數值大于或等于1.1為閾值挑選出與心衰相關miRNA，以假手術組和模型組分別作為基準，對比給藥前后心衰相關miRNA的相對表達水平，并進行統計學分析。所有試驗均平行3次，以保證實驗結果的可重復性和客觀性。

2.5 基因功能GO分析

對表達譜芯片試驗篩選得到的所有具有差異表達的基因進行GO分析，從而描述該基因的功能。該分析主要從3個方面進行描述，即生物途徑、細胞組分和細胞分子功能。統計每個GO條目中所包括的差異基因數目并計算其富集的顯著性。當富集度＞0時，表明顯著性GO上調；富集度＜0時，表明顯著性GO下調；若P值相同，那么GO富集度越大，則意味著該功能受試驗的影響越大（富集度大小用轉錄域覆蓋率表示，轉錄域覆蓋率越大表明富集度越高）。

2.6 統計學方法

3 結果

3.1 3個配對組的差異表達miRNA分析結果

將假手術組與模型組、模型組與纈沙坦組以及模型組與SFI組分別進行配對比較并篩選差異miRNA后，得到共同差異表達miRNA 29條。其中，假手術組、模型組和SFI組共同差異表達miRNA 38條；假手術組、模型組和纈沙坦組共同差異表達miRNA 47條；模型組、纈沙坦組和SFI組共同差異表達miRNA36條，結果見圖1。

圖1 3個配對組的差異表達miRNA交集圖Fig 1 Intersection diagram of miRNAs on differential expression in 3 matched groups

3.2 心衰相關miRNA表達差異分析結果

根據查閱的文獻[7，11-12]和miRNA的篩選結果，挑選出了7條與心衰相關的miRNA，即rno-miR-30c-1-3p、rno-miR-125b-5p、rno-miR-133a-5p、rno-miR-199a-5p、rno-miR-221-3p、rno-miR-146a-5p和rno-miR-1-3p。與假手術組比較，模型組大鼠心肌組織中篩選出的7個心衰相關miRNA表達均上調，其中rno-miR-125b-5p、rno-miR-133a-5p、rno-miR-221-3p、rno-miR-146a-5p、rno-miR-1-3p差異有統計學意義（P＜0.01）。給藥28 d后，與模型組比較，纈沙坦組和SFI組大鼠心肌組織中7個心衰相關miRNA表達均有不同程度的下調，其中rnomiR-125b-5p、rno-miR-133a-5p、rno-miR-221-3p和rnomiR-1-3p差異有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。該試驗結果表明，SFI發揮抗心衰作用的機制與下調心衰相關miRNA的表達有密切聯系。心衰相關7個miRNA表達差異結果見表1，統計分析結果見圖2。

表1 心衰相關7個miRNA表達差異結果Tab 1 Results of expression differences of 7 miRNAs associated with heart failure

圖2 心衰相關7個miRNA表達差異統計分析結果（n＝3）Fig 2 Statistical analysis results of expression differences of 7 miRNAs associated with heart failure（n＝3）

3.3 差異基因GO分析結果

GO分析結果顯示，在生物途徑方面，信號轉導相關的基因占7.5%，包括低氧誘導因子1（HIF-1）信號轉導通路、環磷酸腺苷（cAMP）信號轉導通路和腺苷酸激活蛋白激酶（AMPK）信號轉導通路；在細胞組成方面，細胞質相關的差異表達基因占38.8%，其余有細胞核、細胞膜、細胞質膜、細胞溶質、線粒體等；在分子功能方面，與結合有關的差異基因占71.4%，主要為核苷酸結合（20%）、蛋白結合（19.2%）、金屬離子結合（17.4%）和三磷酸腺苷（ATP）結合（14.8%），結果見圖3。

圖3 差異基因GO分析結果Fig 3 GO analysis results of differential genes

4 討論

miRNA基因芯片檢測原理與DNA、RNA芯片相近，即用標記物對總體RNA樣本進行標記，然后與miRNA芯片雜交，通過掃描芯片上綠光信號的強度，計算出該樣品中miRNA的表達量，從而了解該樣品中miRNA表達的異常情況。目前該技術在醫藥領域主要應用于疾病相關研究和藥物研發中，是一種較快的研究miRNA表達的方法。纈沙坦是一種血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）受體拮抗藥，其對AngⅡ的Ⅰ型受體（AT1）有高度選擇性，可通過阻斷AngⅡ與AT1受體的結合，抑制血管收縮和醛固酮的釋放，從而產生降壓作用。長期應用纈沙坦，可抑制血管重塑、提高心功能、降低心血管事件的發生率[13-15]。此外，該藥不良反應少、安全性高、耐受性好，故常作為心肌梗死、心衰、糖尿病、高血壓等患者的常規用藥，故在本研究中以其為陽性對照藥。

GO是“Gene Ontology”的縮寫，譯為基因本體論，可分為分子功能、生物過程和細胞組成3個部分。通過對靶基因進行GO分析，可對該基因的功能進行描述。蛋白質或者基因可通過身份識別對應或序列注釋的方法找到與之對應的GO號，而GO號可對應找到相應的類別，即功能分類或細胞定位。GO分析目前已廣泛應用于分子生物領域，其對靶基因的篩選和細胞信號通路的預測有著重要而深遠的作用[16]。

Li J等[17]研究發現，miR-30家族在抑制細胞凋亡方面具有重大意義，其可抑制細胞抑癌基因P53的表達，阻止線粒體的分裂，從而保護心肌細胞。而miR-30c是miR-30家族的一員，其在心肌細胞中高表達。van Rooij E等[18]通過檢測原發性心力衰竭患者心臟組織中miRNA表達的變化，發現在原發性心力衰竭過程心臟組織中miRNA表達失調，其中miR-125、miR-199a表達顯著升高。miR-133a在維持心臟細胞外基質平衡中占重要地位，當其表達異常時，會出現心臟結構畸形，并存在嚴重的心肌纖維化，最終導致心衰[19-20]。有學者認為，miR-221可通過調控p27/CDK2/mTOR通路介導的自噬抑制誘發心衰，是心肌細胞內自噬調控的關鍵因子[21]。miR-146a通過對靶基因Smad4進行調控，可減弱對TGF-β/Smads信號傳導通路的抑制作用，而TGF-β/ Smads信號通路與心肌纖維化及心衰密切相關[22]。miR-1雖然能抑制心肌細胞發達，但卻會負性調節心肌缺血損傷，促進細胞凋亡，在缺氧或過氧化氫及高糖環境下均可使miR-1表達水平升高[23-25]。筆者通過對上述7種miRNA進行統計分析后發現，SFI能不同程度地下調心衰大鼠心肌組織中rno-miR-30c-1-3p、rno-miR-125b-5p、rno-miR-133a-5p、rno-miR-199a-5p、rno-miR-221-3p、rno-miR-146a-5p及rno-miR-1-3p的表達水平，且對rnomiR-125b-5p、rno-miR-133a-5p、rno-miR-221-3p和rnomiR-1-3p的下調作用最為明顯。

綜上所述，大鼠心衰過程中，7個心衰相關miRNA表達均明顯上調；SFI參與下調心衰進展相關的miRNA，包括rno-miR-30c-1-3p、rno-miR-125b-5p、rno-miR-133a-5p、rno-miR-199a-5p、rno-miR-221-3p、rno-miR-146a-5p及rno-miR-1-3p等，進而經細胞質與核苷酸結合后影響某些信號通路（如HIF-1信號轉導通路、cAMP信號轉導通路和AMPK信號轉導通路等）的轉導，從而發揮其抗心衰的作用。

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Effect of Shenfu Injection on the Expression Profile of Myocardial miRNA in Rats with Chronic Congestive Heart Failure

SHI Yang1，2，3，FAN Guanwei2，3（1.Dept.of Pharmacy，Karamay Municipal Peoples’Hospital，Xinjiang Karamay 834000，China；2.Tianjin State Key Laboratory of Modern Chinese Medicine/Breeding Base，State Key Laboratory/Research Institute of TCM for Tianjin University of TCM，Tianjin 300193，China；3.Key Laboratory of Pharmacology of Traditional Chinese Medical Formulae，Tianjin University of TCM，Ministry of Education，Tianjin 300193，China）

OBJECTIVE：To study the effect of Shenfu injection（SFI）on the expression profile of myocardial miRNA in rats with chronic congestive heart failure（referring to heart failure）.METHODS：40 rats were randomly divided into sham operation group（normal saline，ip），model group（normal saline，ip），valsartan group（positive control，10 mg/kg，ig）and SFI group（0.75 mL/kg，im），10 in each group.Except for sham operation group，another groups were reduced heart failure.After modeling，rats in other groups

related medicines，once a day.Affymetrix miRNA V4.0 chip technology was conducted to analyze the miRNA expression in myocardial tissue of rats with heart failure after administration for 28 d，and screen the miRNA on common differential expression in myocardial tissue of rats in each group.The miRNA associated with heart failure was analyzed by threshold of differential gene expression multiple value greater than or equal to 1.1.Gene Ontology（GO）analysis was used to analyze functional classification and biological signaling pathway of differentially expressed genes.RESULTS：There were totally 29 miRNAs on common differential expression and 7 miRNAs associated with heart failure（rno-miR-30c-1-3p，rno-miR-125b-5p，rno-miR-133a-5p，rno-miR-199a-5p，rno-miR-221-3p，rno-miR-146a-5p and rno-miR-1-3p）.SFI can significantly downregulate the expressions of rno-miR-125b-5p，rno-miR-133a-5p，rno-miR-221-3p，rno-miR-1-3p in myocardial tissue of rats（P＜0.05 or P＜0.01）.Results of GO analysis showed，miRNAs on differential expression were mainly related to signal transduction，cytoplasm and nucleotide binding.CONCLUSIONS：SFI plays the role of anti-heart failure by participating in the downregulation of miRNAs associated with heart failure process and then affecting related signal pathways transduction after the combination of cytoplasm and nucleotide.

Shenfu injection；Chronic congestive heart failure；miRNA；Differential screening；Gene ontology analysis

R285

A

1001-0408（2017）22-3048-05

2016-12-01

2017-05-12）

（編輯：林 靜）

國家重點基礎研究發展計劃（973計劃）課題（No.2012CB518404）；教育部“創新團隊發展計劃”課題（No.IRT1276）

＊藥師，碩士。研究方向：臨床藥學、心血管藥理學。電話：0990-6865417。E-mail：shiyangtjutcm@126.com

#通信作者：副研究員，碩士生導師，博士。研究方向：心血管藥理學。電話：022-59596163。E-mail：fgw1005@hotmail.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.22.07