茯苓皮水提物對四氯化碳誘導大鼠肝纖維化的改善作用Δ

蔣征奎，王學方（1.鄭州大學附屬腫瘤醫院藥學部，鄭州 450000；.河南省植物天然產物開發工程技術研究中心，鄭州 45000）

茯苓皮水提物對四氯化碳誘導大鼠肝纖維化的改善作用Δ

蔣征奎1＊，王學方2（1.鄭州大學附屬腫瘤醫院藥學部，鄭州 450000；2.河南省植物天然產物開發工程技術研究中心，鄭州 450002）

目的：研究茯苓皮水提物（PWE）對四氯化碳（CCl4）誘導大鼠肝纖維化的改善作用。方法：將84只大鼠隨機分為空白對照組、溶劑對照組、模型對照組、陽性對照組（復方鱉甲軟肝片，0.75 g/kg）和PWE低、中、高劑量組（0.9、1.8、3.6 g/kg，以生藥計），每組12只。除空白對照組與溶劑對照組（ip植物油）外，其余各組大鼠均ip CCl4-植物油溶液復制肝纖維化模型。造模成功后，各給藥組大鼠ig相應藥物，其余3組大鼠ig等體積生理鹽水，每天1次，連續4周。給藥結束后，采用酶聯免疫吸附法檢測大鼠血清中天冬氨酸轉氨酶（AST）、丙氨酸轉氨酶（ALT）、層黏連蛋白（LN）、透明質酸（HA）、羥脯氨酸（Hyp）和肝組織中還原性谷胱甘肽（GSH）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）的含量，蘇木精-伊紅染色和Masson染色觀察大鼠肝組織病理變化。結果：與空白對照組比較，溶劑對照組大鼠各指標均無明顯變化（P＞0.05）；模型對照組大鼠血清中AST、ALT、LN、HA、Hyp含量和肝組織中MDA含量顯著升高（P＜0.05），肝組織中GSH、SOD含量顯著降低（P＜0.05），且肝組織發生明顯纖維化病變。與模型對照組比較，PWE中、高劑量組大鼠血清中AST、ALT、LN、HA、Hyp含量和肝組織中MDA含量顯著降低（P＜0.05），肝組織中GSH、SOD含量顯著升高（P＜0.05），肝組織纖維化程度明顯減輕。結論：PWE對CCl4誘導的大鼠肝纖維化具有良好的改善作用，其機制可能與抑制機體脂質過氧化有關。

茯苓皮；水提物；肝纖維化；脂質過氧化；大鼠

茯苓皮為多孔菌科真菌茯苓[Poria cocos（Schw.） Wolf]菌核的外皮，味甘、淡，性平，具有利水消腫的功效，用于治療水腫、小便不利等[1]。茯苓皮總三萜和多糖為茯苓皮中主要的化學成分[2]?，F代藥理研究表明，茯苓皮三萜類成分和多糖成分具有較好的抗氧化活性[3]，茯苓皮總三萜對高脂血癥小鼠具有明顯的降血脂作用[4]，茯苓皮乙醇提取物具有顯著的利尿作用[5]。然而，茯苓皮在我國作為加工“茯苓片”“茯苓塊”時削下的外皮臨床上用量很少，在日本加工白茯苓時一般作為下腳料廢棄。有文獻報道，茯苓皮中的三萜類成分含量遠高于茯苓菌核[6]。張先淑等[7]研究表明，茯苓三萜對四氯化碳（CCl4）致小鼠肝損傷有明顯的治療作用，但未見茯苓皮提取物對肝纖維化作用的實驗研究。

肝纖維化是多種慢性肝病向肝硬化發展的中間病理階段，是威脅人類健康的常見疾病，也是原發性肝癌發病的危險因素之一。迄今為止，雖然治療肝纖維化的藥物繁多，但治療效果并不理想，因而中藥治療成為研究和臨床治療的熱點[8-9]。本研究用CCl4誘導大鼠發生肝纖維化，觀察茯苓皮水提物對大鼠肝纖維化的改善用，為其臨床應用提供實驗基礎，也為茯苓資源的綜合開發利用提供科學依據。

1 材料

1.1 儀器

Thermo 3001 Varioskan Flash全自動多功能酶標儀（美國Thermo公司）；AU-2700全自動生化分析儀、BX-50顯微鏡（日本Olympus公司）；UV-2409紫外分光光度計（北京市永光明醫療儀器廠）。

1.2 藥品與試劑

復方鱉甲軟肝片（內蒙古福瑞醫療科技有限公司，批號：20150112，規格：0.5 g/片）；丙氨酸轉氨酶（ALT，批號：20140303）、天冬氨酸轉氨酶（AST，批號：20140303）、還原型谷胱甘肽（GSH，批號：20140512）、丙二醛（MDA，批號：201400722）、超氧化物歧化酶（SOD，批號：201400722）、羥脯氨酸（Hyp，批號：20140724）酶聯免疫吸附（ELISA）試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；透明質酸（HA，批號：14070303）、層黏連蛋白（LN，批號：14070304）ELISA試劑盒均購自上海拜沃生物科技有限公司；CCl4（分析純，天津市光復科技發展有限公司）。

1.3 動物

SPF級健康Wistar大鼠84只，♂，體質量180～220 g，購自鄭州大學實驗動物中心，許可證號：SCXK（豫）-2010-0002，動物合格證號：41003100001553。

1.4 藥材

茯苓皮藥材購自河南瑞龍制藥股份有限公司，由河南大學藥學院張保國教授鑒定為多孔菌科真菌茯苓[Poria cocos（Schw.）Wolf]菌核的外皮。

2 方法

2.1 藥物的制備

取茯苓皮藥材1 500 g，粉碎，加10倍量水，煎煮3次，每次1 h，合并3次煎液，過濾，濾液減壓濃縮至干，得茯苓皮水提物（PWE）。采用比色法測得PWE中多糖的含量為32.9%，臨用前用生理鹽水配成含藥混懸液使用。

2.2 分組、造模與給藥

將84只大鼠隨機分成7組，分別為空白對照組、溶劑對照組、模型對照組、陽性對照組（復方鱉甲軟肝片，0.75 g/kg）和PWE低、中、高劑量組（0.9、1.8、3.6 g/kg，以生藥計）。其中，空白對照組大鼠以常規鼠飼料喂養，自由飲水；溶劑對照組大鼠ip植物油溶液（1 mL/kg），每周2次（周一上午和周四晚上），連續4周；其余5組大鼠均ip 40%CCl4-植物油溶液（1 mL/kg）造模，每周2次（周一上午和周四晚上），連續4周，各組大鼠均在相同條件下飼養。造模4周后，各給藥組大鼠每天空腹ig相應藥物1次（10 mL/kg），空白對照組、溶劑對照組和模型對照組大鼠ig等體積生理鹽水，連續4周，并于給藥同時繼續上述造模處理。

2.3 指標檢測

各組大鼠于末次給藥后禁食不禁水1 d，然后于眼靜脈叢取血，并將其斷頸處死，分離血清在－20℃條件下保存。按照ELISA試劑盒說明書操作檢測血清中AST、ALT、LN、HA和Hyp的含量；用10%的甲醛溶液將肝右葉固定，用于病理切片蘇木精-伊紅（HE）染色與Masson染色分析；將剩余肝組織置于液氮中保存，勻漿后按照ELISA試劑盒說明書操作，檢測肝組織中GSH、SOD和MDA的含量。

2.4 統計學方法

3 結果

3.1 PWE對肝纖維化大鼠血清中AST、ALT的影響

與空白對照組比較，溶劑對照組大鼠血清中AST、ALT含量差異無統計學意義（P＞0.05）；模型對照組大鼠血清中AST、ALT含量顯著升高（P＜0.05）。與模型對照組比較，PWE低劑量組大鼠血清中AST、ALT含量略有降低，但差異無統計學意義（P＞0.05）；PWE中、高劑量組大鼠血清中AST、ALT含量顯著降低（P＜0.05），結果詳見表1。

表1 各組大鼠血清中AST、ALT含量測定結果（±s，n＝12）Tab 1 Determination results of ALT，AST contents inserum of rats in each group（±s，n＝12）

表1 各組大鼠血清中AST、ALT含量測定結果（±s，n＝12）Tab 1 Determination results of ALT，AST contents inserum of rats in each group（±s，n＝12）

注：與空白對照組比較，＊P＜0.05；與模型對照組比較，#P＜0.05Note：vs.blank control group，＊P＜0.05；vs.model control group，#P＜0.05

組別空白對照組溶劑對照組模型對照組陽性對照組PWE低劑量組PWE中劑量組PWE高劑量組ALT，U/L 51.23±20.38 52.24±16.58 258.47±36.72＊92.49±30.73#220.32±50.77 147.62±25.30#96.45±13.64#劑量，g/kg 0.75 0.9 1.8 3.6 AST，U/L 55.39±19.64 55.54±9.98 249.65±16.16＊89.33±19.51#207.56±10.74 158.12±6.72#94.28±6.67#

3.2PWE對肝纖維化大鼠血清中LN、HA、Hyp含量的影響

與空白對照組比較，溶劑對照組大鼠血清中LN、HA、Hyp含量差異無統計學意義（P＞0.05）；模型對照組大鼠血清中LN、HA、Hyp含量顯著升高（P＜0.05）。與模型對照組比較，陽性對照組和PWE中、高劑量組大鼠血清中LN、HA、Hyp含量顯著降低（P＜0.05），結果見表2。

表2 各組大鼠血清中LN、HA、Hyp含量測定結果（±s，n＝12，μg/L）Tab 2 Determination results of LN，HA，Hyp contents in serum of rats in each group（±s，n＝12，μg/L）

表2 各組大鼠血清中LN、HA、Hyp含量測定結果（±s，n＝12，μg/L）Tab 2 Determination results of LN，HA，Hyp contents in serum of rats in each group（±s，n＝12，μg/L）

注：與空白對照組比較，＊P＜0.05；與模型對照組比較，#P＜0.05Note：vs.blank control group，＊P＜0.05；vs.model control group，#P＜0.05

組別空白對照組溶劑對照組模型對照組陽性對照組PWE低劑量組PWE中劑量組PWE高劑量組Hyp 14.71±0.27 15.10±0.43 20.82±0.52＊16.96±0.81#19.93±0.14 17.98±0.34#16.61±0.87#劑量，g/kg 0.75 0.9 1.8 3.6 LN 76.85±3.58 76.99±3.59 115.13±16.34＊80.78±8.60#112.79±17.32 91.29±14.62#84.03±11.10#HA 134.51±19.45 136.12±34.03 331.84±34.58＊263.24±30.11#308.47±47.46 242.39±31.89#179.78±28.40#

3.3 PWE對肝纖維化大鼠肝組織中GSH、SOD、MDA含量的影響

與空白對照組比較，溶劑對照組大鼠肝組織中GSH、SOD、MDA含量差異無統計學意義（P＞0.05）；模型對照組大鼠肝組織中GSH、SOD含量顯著降低（P＜0.05），MDA含量顯著升高（P＜0.05）。與模型對照組比較，陽性對照組和PWE中、高劑量組大鼠肝組織中GSH、SOD含量顯著升高（P＜0.05），MDA含量顯著降低（P＜0.05），結果見表3。

表3 各組大鼠肝組織中GSH、SOD、MDA含量測定結果（±s，n＝12）Tab 3 Determination results of GSH，SOD，MDA content in liver tissue of rats in each group（±s，n＝12）

表3 各組大鼠肝組織中GSH、SOD、MDA含量測定結果（±s，n＝12）Tab 3 Determination results of GSH，SOD，MDA content in liver tissue of rats in each group（±s，n＝12）

注：與空白對照組比較，＊P＜0.05；與模型對照組比較，#P＜0.05 Note：vs.blank control group，＊P＜0.05；vs.model control group，#P＜0.05

組別空白對照組溶劑對照組模型對照組陽性對照組PWE低劑量組PWE中劑量組PWE高劑量組MDA，nmol/g prot 1.29±0.29 1.19±0.32 2.70±0.41＊2.13±0.47#2.46±0.39 1.92±0.25#1.52±0.63#劑量，g/kg 0.75 0.9 1.8 3.6 GSH，mg/g prot 2.71±0.22 2.62±0.41 1.68±0.23＊2.39±0.42#1.76±0.51 1.93±0.21#2.27±0.38#SOD，U/g prot 250.69±25.56 244.87±17.76 149.18±11.39＊141.89±15.70 153.77±22.83 190.18±35.46#217.09±34.56#

3.4 PWE對肝纖維化大鼠肝組織病變的影響

3.4.1 HE染色 空白對照組與溶劑對照組大鼠肝細胞結構正常，無炎癥細胞浸潤，肝索排列整齊，肝小葉結構完整。模型對照組大鼠肝組織發生明顯炎癥變化，可見大量脂肪變性與炎癥細胞浸潤，另有水樣變性甚至氣球樣變化，可見散在的不同程度的壞死肝細胞，肝的正常結構遭到破壞。陽性對照組和PWE各劑量組大鼠肝組織病理損傷程度均有不同程度減輕的趨勢，且以PWE高劑量組效果最好，細胞炎癥明顯減輕、脂肪變性空泡明顯減少，結果見圖1。

圖1 各組大鼠肝組織HE染色結果（×200）Fig 1 Results of HE staining in liver tissue of rats in each group（×200）

3.4.2 Masson染色 空白對照組大鼠肝組織未見纖維增生，僅在中央靜脈及肝竇內有輕微的藍色膠原纖維。溶劑對照組大鼠肝組織未見纖維增生。模型對照組大鼠匯管區和小葉間有大量粗大增生的膠原纖維，切片中有大量假小葉形成，膠原纖維呈寬帶狀，互相連接，細胞變性壞死明顯，偏光顯微鏡下區分可見紅、黃色成分居多。陽性對照組和PWE各劑量組大鼠肝組織膠原纖維均有不同程度減輕，肝小葉結構也有所恢復，結締組織增生也有不同程度減少，且以PWE高劑量組效果最好，結果見圖2。

圖2 各組大鼠肝組織Masson染色結果（×200）Fig 2 Results of Masson staining in liver tissue of rats in each group（×200）

4 討論

肝纖維化是繼發于多種物理、化學因素引起的肝炎癥或損傷后組織修復過程中的代償反應，屬于可逆病變[10]。CCl4誘發的化學性肝纖維化動物模型是常用的經典模型，被廣泛應用于防治肝纖維化藥物篩選及其作用機制的研究。本研究選用的陽性藥復方鱉甲軟肝片為治療慢性乙型肝炎纖維化以及早期肝硬化屬“瘀血阻絡、氣血虧虛兼熱毒未盡”的有效中成藥，已被納入我國肝纖維化中西醫結合診療指南[11]。

在本研究造模期間，模型對照組大鼠的行為習慣均異于空白對照組，表現出行動遲緩、毛發散亂、厭食少動等行為，而用藥組大鼠則表現得相對正常。

肝功能的改變可反映肝的炎癥和肝細胞變性、壞死的程度。當肝受到損害時，肝細胞的變性、壞死會導致細胞內容物的溢出，通過檢測血清或者血漿中相關酶含量或活性變化可對肝細胞的受損程度進行評價，目前常用的檢測指標有AST、ALT等[12]。肝纖維化的實質是由于膠原和細胞外基質（ECM）的合成與降解失衡，導致ECM在肝內過量沉積。而參與肝纖維化形成的ECM成分包括膠原蛋白、非膠原性糖蛋白和蛋白多糖三大類。其中，Hyp為膠原蛋白所特有的氨基酸成分，其含量可反映膠原代謝的變化情況，與肝纖維化程度相平行；HA是構成ECM中蛋白多糖的主要成分；LN是一種重要的結構糖蛋白，HA和LN對慢性肝損傷和肝纖維化的診斷價值已得到普遍認可[13]。本研究結果顯示，模型對照組大鼠血清中AST、ALT、LN、HA、Hyp含量均明顯增加，肝組織損傷較重，提示CCl4誘發的大鼠肝纖維化模型復制成功。而給予PWE后，可顯著降低由CCl4所致的大鼠血清中AST、ALT、LN、HA、Hyp含量的增加，提示PWE具有抑制肝損傷的作用；且病理切片也顯示PWE可抑制肝膠原纖維的合成和沉積，對CCl4誘導的大鼠肝纖維化具有良好的防治作用。

有研究表明，CCl4誘導的肝纖維化模型大鼠存在明確的脂質過氧化損傷反應[14]。SOD是一種超氧離子清除劑，可抑制自由基啟動的脂質過氧化反應；MDA是脂質過氧化的最終產物，其含量高低反映了組織過氧化損傷的程度；GSH是重要的抗氧化劑和自由基清除劑，在拮抗氧化性毒物中發揮著重要作用，其不僅可防止肝細胞損傷，還可增強肝細胞膜對氧自由基的耐受性，從而提高機體的抗氧化能力。本研究結果顯示，模型對照組大鼠肝組織中GSH、SOD含量顯著減少，MDA含量顯著增加；給予PWE后，肝纖維化模型大鼠肝組織中GSH、SOD含量顯著增加，MDA含量顯著減少，提示PWE具有抗氧化作用。

綜上所述，PWE對CCl4誘導的大鼠肝纖維化具有良好的改善作用，其機制可能與抑制機體的脂質過氧化有關。

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Improvement Effect of Poria cocos Peels Water Extract on Liver Fibrosis in Rats Induced by Carbon Tetrachloride

JIANG Zhengkui1，WANG Xuefang2（1.Dept.of Pharmacy，Affiliated Cancer Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou 450000，China；2.Henan Plant Natural Products Development Engineering Technology Center，Zhengzhou 450002，China）

OBJECTIVE：To study the improvement effect of Poria cocos peels water extract（PWE）on liver fibrosis in rats induced by carbon tetrachloride（CCl4）.METHODS：84 rats were randomly divided into blank control group，solvent control group，model control group，positive control group（Compound biejia ruangan tablet，0.75 g/kg），PWE low-dose，medium-dose，high-dose groups（0.9，1.8，3.6 g/kg，calculated by crude drugs），12 in each group.Except for blank control group and solvent control group（ip vegetable oil），other groups

CCl4-vegetable oil solution to reduce liver fibrosis model，ip.After modeling，each administration group received related medicines，ig，other 3 groups received equal volume of normal saline，once a day，for 4 weeks.After administration，enzyme-linked immunosorbent assay was used to detect the aspartate aminotransferase（AST），alanine aminotransferase（ALT），laminin（LN），hyaluronic acid（HA），hydroxyproline（Hyp）contents in serum and reduced glutathione（GSH），superoxide dismutase（SOD），malondialdehyde（MDA）contents in liver tissue of rats；HE staining and Masson staining were adopted to observe the pathological changes of liver tissue.RESULTS：Compared with blank control group，indexes of rats in solvent control group had no obvious changes（P＞0.05）.AST，ALT，LN，HA，Hyp contents in serum and MDA content in liver tissue in model control group were significantly increased（P＜0.05）；GSH，SOD contents in liver tissue were significantly reduced（P＜0.05）；and liver tissue showed obvious fibrosis lesions.Compared with model control group，AST，ALT，LN，HA，Hyp contents in serum and MDA content in liver tissue in PWE medium-dose，high-dose groups were significantly reduced（P＜0.05）；GSH，SOD contents in liver tissue were significantly increased（P＜0.05）；fibrosis degree of liver tissue was obviously relieved.CONCLUSIONS：PWE shows good improvement effect on liver fibrosis of rats induced by CCl4，which may be related to inhibiting the lipid peroxidation.

Poria cocos peels；Water extract；Liver fibrosis；Lipid peroxidation；Rats

R285.5

A

1001-0408（2017）22-3065-04

2017-02-07

2017-04-11）

（編輯：林 靜）

河南省科技攻關項目（No.152102110115）

＊主管藥師，碩士。研究方向：中藥質量標準與新藥開發。電話：0371-65587172。E-mail：kui3456@163.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.22.11