介孔碳納米粒的構建及化療-光療聯合抗多藥耐藥腫瘤研究Δ

李方舟，俞燕娜，朱 浩，沈園園（上海交通大學藥學院，上海 200240）

介孔碳納米粒的構建及化療-光療聯合抗多藥耐藥腫瘤研究Δ

李方舟＊，俞燕娜，朱 浩，沈園園#（上海交通大學藥學院，上海 200240）

目的：構建負載化療藥物并具有光熱和光動力聯合治療效果的介孔碳納米粒（MCNs），研究其體外抗多藥耐藥腫瘤的作用。方法：利用低濃度水熱法制備MCNs，通過混酸超聲法將MCNs表面羧基化制成MCNs-COOH（MCNC），對其形貌、表面性質等進行表征。利用吸附法構建負載阿霉素（ADR）的ADR/MCNC，通過紫外吸光度計算其載藥量，利用透析法考察其釋放特性。選用耐ADR人乳腺癌MCF-7/ADR細胞通過共聚焦激光顯微鏡觀察ADR/MCNC的細胞攝取和定位，MTT法考察ADR/MCNC的細胞毒性，用流式細胞術測定NIR光照下細胞內活性氧自由基（ROS）水平。結果：所制備的MCNC的粒徑約為90 nm，表面含有羧基，BET比表面積為541.62 m2/g，孔容為0.34 cm3/g，孔徑分布約為2.5 nm，具有顯著光熱效應。ADR/MCNC的載藥量為47.4%，具有pH/NIR響應性釋放特性；NIR光照下能促進ADR的細胞攝取和核內蓄積，能誘導MCF-7/ADR細胞產生ROS，并對細胞有顯著的抑制作用。結論：成功制得MCNs，此外ADR/MCNC具有抗多藥耐藥腫瘤的作用。

介孔碳；納米給藥系統；光熱療法；光動力療法；響應性；腫瘤多藥耐藥

腫瘤的多藥耐藥是癌癥治療的主要瓶頸，是導致傳統化學治療失敗的主要原因之一。抗多藥耐藥腫瘤是改善癌癥化學治療效果亟待解決的關鍵性問題[1]。

納米藥物遞釋系統的出現為抗多藥耐藥腫瘤帶來了福音[2]。其利用無機納米粒的光熱、光動力效果直接殺死腫瘤細胞或誘導腫瘤細胞產生抑制多藥耐藥相關基因的蛋白[3]，成為一種抗多藥耐藥腫瘤的新型手段。

介孔碳材料是一種新型的無機納米材料。本課題利用低濃度水熱法制備了介孔碳納米粒（MCNs），其具有比表面積大、孔容高、藥物負載量大的特性，并且其載藥和釋藥過程具有pH依賴性，此種特性很好地順應了給藥系統在腫瘤組織微酸性條件下釋藥的需求[4]。MCNs具有近紅外（NIR）光熱及光動力效應，能在NIR光照下升高溫度促進介孔中所負載藥物的釋放[5]，產生活性氧自由基（ROS）直接殺滅腫瘤細胞[6]。結合MCNs的優勢，筆者設計并構建了一種負載抗癌藥阿霉素（ADR）的ADR/MCNs，并對其體外抗多藥耐藥腫瘤作用進行了評價。

1 材料

1.1 儀器

JEM-2010透射電鏡（TEM）、JSM-7401F掃描電鏡（SEM）（日本Jeol公司）；Zatasizer Nano S動態光散射儀（DLS，英國Malvern公司）；IR/Nicilte 6700傅里葉變換紅外光譜儀（FTIR，美國Nicilet公司）；sP2010M+C比表面積孔隙度及化學吸附分析儀（美國Micromeritics Instrument公司）；Varioskan Flash酶標儀（美國Thermo公司）；BD LSRGortessa流式細胞儀（美國BD公司）；TCS SP5共聚焦激光顯微鏡（德國Leica公司）；LE-LS-808-2000TFCA 808 nm高溫激光器、LENS-808CC-A5 808 nm光纖激光連接器（深圳歐立光電技術有限公司）；U-2910紫外-可見光-NIR分光光度儀（日本Hitachi公司）。

1.2 藥品與試劑

ADR原料藥（北京華奉聯博化學材料有限公司，批號：HF150728，純度：99%）；苯酚[阿拉丁試劑（上海）有限公司，批號：C1523045]；甲醛溶液（國藥集團化學試劑有限公司，批號：20160225）；泊洛沙姆（F127，美國Sigma-Aldrich公司，批號：BCBH4538V）；1640培養基（美國Gibco公司，批號：1786043）；MTT、胰酶、胎牛血清（FBS）（上海索萊寶生物科技有限公司，批號：303H0510、20150623、140716）；2′，7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽（DCFHDA，南京碧云天生物技術有限公司，批號：S0033）；其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 細胞

耐ADR人乳腺癌MCF-7/ADR細胞由中國科學院上海藥物研究所提供。

2 方法與結果

2.1 MCNs的制備

按文獻[7]的低濃度水熱法制備MCNs。取0.96 g F127超聲溶于15 mL水中，備用；取0.6 g苯酚于70℃油浴中攪拌融化，緩慢加入15 mL 0.1 mol/L的NaOH溶液，逐滴加入2.1 mL的甲醛溶液（37%～40%），攪拌30 min；之后逐滴加入F127溶液，66℃油浴，（340±20）r/min攪拌2 h；加入50 mL水稀釋，70℃油浴，反應16～18 h，得深紅色膠體溶液；取膠體溶液17.7 mL，加入56 mL水稀釋，130℃水熱24 h，水洗數次，真空干燥，700℃焙燒3 h，最終得到MCNs。

2.2 MCNs表面羧基化改性

焙燒后的MCNs分散性極差，須通過混酸超聲法將MCNs表面羧基化，以增強其在水中的分散性[8]。濃硫酸（98%）與濃硝酸（70%）按體積比3∶1配制得到強混酸；取2 mg MCNs與強混酸混合均勻，超聲4 h進行羧基化，之后室溫攪拌12 h；離心收集羧基化得到的MCNs-COOH（縮寫為MCNC），水洗數次，直到上清液呈中性，之后以2 mL水重懸MCNC，超聲攪拌后得均勻穩定的MCNC分散液。

2.3 MCNs和MCNC的表征

采用TEM和SEM分別觀察MCNs和MCNC的形貌和介孔結構；MCNs和MCNC表面基團由FTIR進行表征；MCNs比表面積和孔徑分布由比表面積孔隙度及化學吸附分析儀通過N2吸附-脫附原理進行測定；MCNC的粒徑由DLS測定。結果顯示，MCNs具有均一的粒徑，約為90 nm，但極易團聚，分散性極差；MCNC在水中分散較好，粒徑約為85 nm，并且孔道規則，介孔充分暴露，有利于藥物的負載。MCNs和MCNC的形貌和結構圖見圖1。

圖1 MCNs和MCNC的形貌和結構圖Fig 1 Morphology and structure of MCNs and MCNC

FTIR圖譜顯示，MCNs的3 440 cm－1和1 382 cm－1分別對應—OH、酚—OH的伸縮振動和彎曲振動峰，1 625 cm－1對應酚環C＝C的伸縮振動峰，1 100 cm－1對應C—O的伸縮振動峰；MCNC中未灼燒完全的酚類物質對應的特征峰強度稍有減弱，暴露出了羧酸所對應的1 698 cm－1的C＝O特征峰，以及MCNC表面的亞甲基對應的2 915 cm－1和2 848 cm－1的伸縮振動峰。N2吸附-脫附等溫線顯示，MCNs的BET比表面積為541.62 m2/ g，總孔容為0.34 cm3/g，孔徑分布約為2.5 nm。MCNs和MCNC的表征結果見圖2。

圖2 MCNs和MCNC的表征結果Fig 2 Characterization of MCNs and MCNC

2.4 統計學方法

2.5 MCNC的載藥性質考察

將ADR溶于pH 9.0的緩沖液中制備成200 μg/mL的溶液；取1 mg MCNC超聲5 min分散于5 mL的上述ADR溶液中，室溫下避光磁力攪拌24 h，離心收集ADR/ MCNC，并用相應的緩沖液洗滌至上清液無色；合并所有上清液并計算總體積，紫外分光光度計測定上清液的吸光度，計算載藥量。分別檢測MCNC和ADR/MCNC的粒徑、多分散系數（PDI）。結果顯示，MCNC、ADR/ MCNC的粒徑分別為（88.98±4.48）、（177.1±8.53）nm，PDI分別為0.149±0.04、0.222±0.01（n＝3）；ADR/ MCNC的載藥量為47.4%，包封率為90.2%，表明幾乎所有投入的ADR都能被MCNC所負載，顯示了MCNC優良的載藥特性。

2.6 ADR/MCNC的釋藥性質考察

以pH 5.5的緩沖液模擬腫瘤細胞的酸性微環境，以pH 7.4的緩沖液模擬正常生理環境，利用透析法對ADR/MCNC的釋藥進行評價。取500 μg樣品加入1 mL不同pH（5.5、7.4）的釋放介質，均勻分散；將上述1 mL分散液分別加入至透析袋中，放入含4 mL相應釋放介質的離心管中，于37℃水浴搖床中2 000 r/min振搖；分別于不同時間點取出1 mL釋放液，并補加等溫等體積的新鮮釋放介質。分別考察ADR溶液和ADR/MCNC在無或有NIR光照（808 nm波長，10 W/cm2光密度，5 min）下ADR的累積釋放度。體外釋放結果見圖3。

圖3 體外釋放結果（n＝5）Fig 3 Results of release in vitro（n＝5）

由圖3A可知，游離ADR從透析袋內擴散到外界的速度非常快，表明該過程不是一個限速過程，ADR從納米粒中釋放并擴散至透析袋外的速度取決于ADR從納米粒中釋放出來的速度。此外，ADR/MCNC在pH 5.5時的累積釋放度（52.3%）明顯高于在pH 7.4時的累積釋放度（12.1%）（P＜0.01），這說明MCNC對ADR的釋放具有pH響應性。由圖3B可知，與無NIR光照比較，NIR光照下ADR/MCNC的累積釋放度顯著增加（P＜0.01），達到65.0%，這說明MCNC對ADR的釋放具有NIR響應性。

2.7 ADR/MCNC的細胞攝取、蓄積和分布

取對數生長期的MCF-7/ADR細胞以1×105個/孔的密度接種到共聚焦皿中，培養過夜，分別給予ADR和ADR/MCNC，孵育4 h后，對ADR/MCNC以808 nm、10 W/cm2光照5 min，繼續培育4 h；吸棄含藥培養基，加入6 μg/mL的細胞核染料（Hoechst 33342），孵育20 min；吸棄染料，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌3次，加入2 mL 4%的多聚甲醛固定細胞30 min。共聚焦顯微鏡拍照（ADR：激發波長480 nm，發射波長590 nm；Hoechst 33342：激發波長350 nm，發射波長440～480 nm）。MCF-7/ADR細胞的共聚焦激光顯微圖像見圖4。

圖4 MCF-7/ADR細胞的共聚焦激光顯微圖像Fig 4 Confocal laser microscopy images of MCF-7/ ADR cells

由圖4所示（藍色熒光表示細胞核，紅色熒光表示ADR），ADR能被MCF-7/ADR細胞少量攝取，細胞內整體蓄積量很少；ADR/MCNC的細胞攝取顯著提高，細胞內的ADR蓄積量增加，但ADR主要分布在細胞質，很少能進入細胞核（合并圖中紅色與藍色不重疊）；NIR光照后，細胞內ADR的蓄積量進一步提高，并且進入細胞核內的ADR也顯著增多（合并圖中紅色與藍色重疊顯紫色）。

2.8 ADR/MCNC的體外細胞毒性試驗

對數生長期的MCF-7/ADR細胞，按5 000個/孔接種于96孔板，培養過夜后，更換新鮮的含不同質量濃度藥物的培養基（6.25～100 μg/mL MCNC和3.125～100 μg/mL ADR、ADR/MCNC），孵育48 h（NIR光照于第24小時給予808 nm、10 W/cm2的光照5 min）。吸棄培養基，用PBS洗滌孔板，每孔加入180 μL的培養基和20 μL的MTT溶液（5 mg/mL），繼續孵育4 h后終止培養。吸棄培養基，每孔加入200 μL二甲基亞砜，輕搖10 min溶解藍色晶體。用酶標儀于570 nm波長檢測，計算細胞存活率和半數抑制濃度（IC50）。體外細胞毒性試驗結果見圖5。

由圖5A可知，不論MCNC質量濃度高低，細胞的存活率均較高，說明MCNC對MCF-7/ADR細胞沒有明顯毒性。以ADR為對照，ADR的IC50約為56.93 μg/mL，ADR/MCNC的IC50約為40.46 μg/mL，NIR光照下ADR/ MCNC的IC50約為19.77 μg/mL，逆轉耐藥指數（RRI）為2.88（RRI＝ADR的IC50/納米粒的IC50）。這說明NIR光照聯合化學療法能有效地殺滅耐藥腫瘤細胞。

2.9 細胞內ROS水平檢測

圖5 體外細胞毒性試驗結果（n＝6）Fig 5 Results of cytotoxicity in vitro evaluation（n＝6）

利用二氯熒光黃（DCF）法對NIR光照下的MCNC和ADR/MCNC在細胞內產生的ROS水平進行評價，以ADR為對照。將MCF-7/ADR細胞以1×105個/孔接種于24孔板，培養過夜，分別更換含ADR、MCNC、ADR/ MCNC的培養基，孵育24 h后分別給予808 nm、10 W/cm2光照5 min；之后吸棄含藥培養基，加入按1∶1 000比例以無血清培養基稀釋后的DCFH-DA熒光探針，37℃孵育20 min；吸棄熒光探針培養基，用PBS洗滌細胞3次，胰酶消化，用預冷的PBS洗滌細胞，335×g離心5 min收集細胞。將細胞重懸在0.5 mL 4℃預冷的PBS溶液中，流式細胞儀測定細胞內ROS的平均熒光強度。MCF-7/ ADR細胞內ROS水平測定結果見圖6。

圖6 MCF-7/ADR細胞內ROS水平測定結果（n＝6）Fig 6 Results of ROS level in MCF-7/ADR cells（n＝6）

由圖6可知，與ADR比較，MCNC和ADR/MCNC光照后細胞內ROS水平顯著提高（P＜0.01），且兩者ROS水平接近，這證實了MCNC能誘導腫瘤細胞產生ROS，且負載藥物并不會影響MCNC光照下誘導細胞產生ROS的能力，這有力地解釋細胞毒性試驗中ADR/ MCNC光照下的細胞存活率顯著降低的現象。

3 討論

本研究采用低濃度水熱法制備的MCNC具有均一的粒徑、有序的介孔、高藥物負載量。本課題組還考察了MCNC的NIR光照介導的光熱性質。結果發現，MCNC的吸收波長范圍較廣，在NIR波段也有較強吸收，ADR可成功負載到MCNC上；MCNC和ADR/ MCNC的光熱效應曲線顯示二者具有MCNC濃度依賴性和時間依賴性，即隨著MCNC濃度的升高和照射時間的延長，光熱效應越明顯。但時間依賴性有一定的限度：5 min后的升溫進入平臺期，溫度不會再隨著時間的延長而升高。由此筆者選擇能使12.5 μg/mL的MCNC和ADR/MCNC達到40℃左右的808 nm、10 W/cm2光照5 min作為最終治療方法。

本文設計構建了ADR/MCNC，其具有pH/NIR雙重響應性釋放特性。體外耐藥細胞株細胞毒性實驗結果證明，ADR/MCNC能通過NIR光熱和光動力聯合治療有效殺滅耐藥細胞，起到較為顯著的抗多藥耐藥腫瘤的作用。體外ROS水平測定更加直觀地表明，NIR光照不僅是通過光熱作用促進ADR的釋放和核內分布，更是通過誘導腫瘤細胞產生ROS的方式來殺滅腫瘤細胞，起到增強抗多藥耐藥腫瘤療效的作用。

筆者所構建的ADR/MCNC的雙重響應性釋放、化療-光熱/光動力聯合治療的功效已經得到了證實，但具體在體內的應用效果仍有待在動物水平上進行藥效學和藥動學實驗來驗證。

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Establishment of Mesoporous Carbon Nano-drug Delivery System and Study on Its Chemotherapy-phototherapy Combination for Anti-multidrug-resistant Tumor

LI Fangzhou，YU Yanna，ZHU Hao，SHEN Yuanyuan（School of Pharmacy，Shanghai Jiao Tong University，Shanghai 200240，China）

OBJECTIVE：To establish the mesoporous carbon nano-drug delivery system（MCNs）with chemotherapy drugs loaded and holding photothermal and photodynamic combined effect，and study its anti-multidrug-resistant tumor effect in vitro. METHODS：MCNs was prepared by low-concentration hydrothermal route，and the MCNs surface was carboxylated by the mixed acid ultrasound method to made MCNs-COOH（MCNC）.The morphology and surface properties were evaluated.Adriamycinc（ADR）was loaded into MCNC to fabricate ADR/MCNC via adsorption method.Drug loading capacity was calculated by UV，and drug release profile was investigated by dialysis method.ADR-resistant human breast cancer MCF-7/ADR cells were chosen，and cell uptake and positioning of ADR/MCNC were observed by confocal laser microscopy；cytotoxicity of ADR/MCNC was detected by MTT method；and intracellular reactive oxygen species（ROS）level under NIR irradiation was measured by flow cytometry.RESULTS：The particle size of prepared MCNs was about 90 nm，with carboxyl in surface.The specific surface area was 541.62 m2/ g，pore volume was 0.34 cm3/g，and pore size distribution was 2.5 nm，with significant photothermal effect.The drug loading capacity of ADR/MCNC was 47.4%，showing pH/NIR responsiveness release characteristics.It can promote ADR in cell uptake and nuclear accumulation and induce MCF-7/ADR cell to generate ROS under NIR irradiation，with significant inhibitory effect.CONCLUSIONS：MCNs is prepared successfully，and ADR/MCNC has an effect on anti-multidrug-resistant tumors.

Mesoporous carbon；Nano-drug delivery system；Photothermal therapy；Photodynamic therapy；Responsive；Tumor multidrug resistance

R943；R73

A

1001-0408（2017）22-3117-04

2017-02-27

2017-04-28）

（編輯：鄒麗娟）

國家自然科學基金資助項目（No.81573352）

＊碩士研究生。研究方向：納米給藥系統、藥劑學。電話：021-34204793。E-mail：lfzh1991@126.com

#通信作者：高級工程師，副教授，碩士生導師。研究方向：藥劑學。電話：021-34204793。E-mail：shenyuanyuan@sjtu.edu.cn

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.22.25