口蹄疫病毒分子生物學(xué)診斷方法研究進展

■文/山東綠都生物科技有限公司 于新友 李天芝

口蹄疫病毒分子生物學(xué)診斷方法研究進展

■文/山東綠都生物科技有限公司 于新友 李天芝

文章論述了口蹄疫病毒分子生物學(xué)診斷方法，包括基因芯片檢測方法、常規(guī)RT-PCR方法、多重RT-PCR方法、熒光定量RT-PCR方法、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)、核酸試紙檢測技術(shù)、賴解旋酶恒溫基因擴增技術(shù)等7種方法，對口蹄疫的診斷和防控有一定的參考價值。

口蹄疫病毒；分子生物學(xué)；診斷

口蹄疫(foot and mouth disease，F(xiàn)MD)是由口蹄疫病毒(foot and mouth disease virus，F(xiàn)MDV)引起的偶蹄動物的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，可感染豬、牛、羊等70多種動物[1]。該病于1514年首次發(fā)現(xiàn)于意大利，目前，在非洲、亞洲、南美洲及歐洲的部分國家廣泛流行。該病傳染性強、傳播快、流行范圍廣，且能以氣溶膠的形式遠距離傳播，一旦發(fā)生，往往造成大流行，不易控制和消滅，不僅給畜牧業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失，還影響社會穩(wěn)定、國際貿(mào)易及國家聲譽。我國是世界上口蹄疫多發(fā)國家之一，且疫情復(fù)雜，這與我國的地理環(huán)境密切相關(guān)，鄰國如越南、緬甸、泰國等國都有口蹄疫流行。世界各國對口蹄疫的防控都十分重視，此病已成為國際重點檢疫對象。世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將口蹄疫列在15個A類動物疫病之首，我國政府也將其排在一類動物傳染病的第一位。口蹄疫一年四季均可發(fā)病，多發(fā)于冬、春寒冷季節(jié)[2]。本文就口蹄疫病毒的分子生物學(xué)診斷方法研究進展進行綜述，以期為口蹄疫的快速診斷和防控提供參考。

1 分子生物學(xué)診斷

1.1 基因芯片檢測

基因芯片檢測技術(shù)是在芯片上排列著眾多一定堿基順序的DNA探針，通過與堿基互補序列的單鏈目標DNA片段雜交，捕捉相應(yīng)的DNA分子。檢測系統(tǒng)再將雜交過程或結(jié)果轉(zhuǎn)化為可觀測的信號，進入信號采集分析系統(tǒng)[3]。楊林等[4]根據(jù)FMDV基因組序列保守區(qū)，設(shè)計合成2對引物，通過RT-PCR方法篩選出特異引物，用Cy3標記下游引物5′端，針對這個基因片段，設(shè)計合成4條寡核苷酸探針，開展靶基因擴增和克隆、陽性質(zhì)粒構(gòu)建、芯片雜交與反應(yīng)條件優(yōu)化以及芯片靈敏度和特異性分析等試驗研究，建立FMDV的基因芯片檢測方法。相磊等[5]為建立FMDV不同血清型與基因型的基因芯片檢測方法，設(shè)計針對O型8個基因型、A型3個基因型和亞洲1型的特異性探針。從美國GenBank與英國世界口蹄疫參考實驗室基因庫下載了O型、A型和亞洲1型FMDV的VP1基因序列547條。對每一種血清型序列用DNA Star軟件ClastalW程序進行多重比對，做系統(tǒng)發(fā)育分析并進行基因分型。用生物學(xué)軟件BioSun 2.0建立基因型數(shù)據(jù)庫，設(shè)計每一基因型的特異性探針。共設(shè)計出104條候選探針，通過芯片試驗篩選出12條特異性探針。以各型特異性探針所對應(yīng)的靶序列模板做10倍系列稀釋進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物與探針雜交，驗證各探針的靈敏度。對O型SEA、Euro-SA、ME-SA、WA4個基因型的各條探針的靈敏度進行了檢驗，結(jié)果這些探針能夠檢測到102數(shù)量級拷貝數(shù)的陽性靶標。

1.2 常規(guī)RT-PCR 方法

RT-PCR方法是根據(jù)目的片段序列設(shè)計引物，借助儀器和相關(guān)聚合酶體外大量擴增部分或全部目的片段，是一種快速、簡便、特異的診斷方法。張書光等[6]設(shè)計合成一套引物，通過反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立了一種RTPCR的方法，用于檢測O、A和亞洲I型口蹄疫病原，并用該法檢測患病豬的頜下淋巴結(jié)和扁桃體，牛、羊的食道-咽分泌物(O-P液)等樣品。結(jié)果表明，該方法可快速靈敏檢測出豬的頜下淋巴結(jié)和扁桃體，牛、羊的食道-咽分泌物中的FMDV，并具有較好的特異性和重復(fù)性。結(jié)論：建立了一種RT-PCR檢測O、A和亞洲I型口蹄疫病原的方法。

1.3 多重RT-PCR方法

多重RT-PCR具有快速、靈敏度高、高效、特異性強等優(yōu)點，是在同一反應(yīng)體系中，加入多種引物，同時檢測2種或2種以上的病毒RNA，目前已廣泛應(yīng)用于臨床疾病的快速診斷。張彥婷等[7]根據(jù)口蹄疫病毒VP1基因序列，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計4條特異性引物，通過對退火溫度等反應(yīng)條件進行優(yōu)化，建立能夠同時擴增出O型、A型、Asia-1型口蹄疫病毒的多重RT-PCR檢測方法。結(jié)果表明，建立的方法最低可以檢測出約含1pg/μL的病毒樣品，該方法對豬瘟病毒、豬細小病毒、豬偽狂犬病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒等其他相關(guān)病毒的檢測結(jié)果均為陰性，特異性良好。秦敏等[8]針對藍舌病病毒(BTV)NS3基因、FMDV 3D基因、小反芻獸疫病毒(PPRV)N基因和水皰性口炎病毒(VSV)N基因序列設(shè)計引物，優(yōu)化反應(yīng)體系和擴增條件，建立了一種同時檢測4種病毒的多重PCR方法。對建立的多重PCR檢測方法的特異性及敏感性進行檢驗，結(jié)果表明建立的多重PCR檢測方法敏感性強、特異性良好，對4種病毒的最低檢出限分別為PPRV 103copies/μL、BTV 103copies/μL、VSV 103copies/ μL和FMDV 102copies/μL。

1.4 熒光定量RT-PCR方法

熒光定量RT-PCR技術(shù)是指采用SYBR GreenⅠ熒光染料或熒光探針通過連續(xù)監(jiān)測熒光信號強弱的變化來測定特異性產(chǎn)物的量，不需要分離擴增產(chǎn)物，即能準確定量起始模板數(shù)[9]。李金海等[10]根據(jù)FMDV聚合酶3D基因序列比對結(jié)果，設(shè)計特異性引物和MGB探針，建立檢測FMDV的一步法熒光定量RT-PCR檢測方法。結(jié)果顯示，該法能特異性檢測A型、O型、Asia1型FMDV，而對豬瘟病毒、豬藍耳病病毒、豬圓環(huán)病毒、豬細小病毒、豬狂犬病毒、豬乙型腦炎病毒等檢測結(jié)果均為陰性，構(gòu)建的熒光定量標準曲線Ct值與模板濃度呈良好的線性關(guān)系，檢測質(zhì)粒的敏感性可達83.4copies/ μL，檢測病毒RNA的敏感性可達7.1fg/μL，比多重RT-PCR敏感性高10倍，對4份樣品進行5次批內(nèi)和批間重復(fù)檢測，檢測結(jié)果變異系數(shù)均小于2%。王乃福等[11]根據(jù)口蹄疫病毒3D蛋白編碼基因、水皰性口炎病毒N蛋白編碼基因和豬水泡病病毒VP1蛋白編碼基因的高保守區(qū)設(shè)計特異性引物和探針，對3種動物病毒進行多重?zé)晒舛縍T-PCR擴增。結(jié)果經(jīng)過擴增，可以同時檢測口蹄疫病毒、水皰性口炎病毒和豬水皰病病毒，而其他參試病原均無擴增信號，顯示其良好的特異性。對口蹄疫病毒、水皰性口炎病毒、豬水皰病病毒的最低檢測限分別達到101、102、102個質(zhì)粒拷貝濃度。宋爽等[12]根據(jù)高度保守的牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)的5'UTR基因、牛傳染性支氣管炎病毒(IBRV)的gB基因和FMDV的3D基因，分別設(shè)計了3對對應(yīng)的特異性引物和3種不同發(fā)光基團標記的TaqMan探針，建立了同時檢測這3種病毒的多重?zé)晒舛縋CR的方法。并對其反應(yīng)條件進行優(yōu)化。結(jié)果表明，該多重?zé)晒舛縋CR方法能夠特異性檢測出BVDV、IBRV和FMDV，而對BTV等檢測結(jié)果均為陰性，對BVDV、IBRV、FMDV的最低檢測量分別為194copies/μL、208copies/μL和150copies/μL。而且組內(nèi)和組間變異系數(shù)均低于0.85%。

1.5 環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(LAMP)是在等溫條件進行擴增反應(yīng)。基因的擴增和產(chǎn)物的檢測可一步完成，擴增效率和特異性高，可在15～60min擴增109～1010倍，可只通過擴增產(chǎn)物的有無來判別。秦智鋒等[13]設(shè)計了6條針對FMDV 3D基因的8個位點的特異性引物，建立了口蹄疫病毒RTLAMP檢測方法的。所建立的檢測方法靈敏度高，與實時熒光RT-PCR靈敏度相當(dāng)，且具有特異性，對其他水皰性疾病病原體檢測均為陰性，而且簡單，不需要復(fù)雜的儀器，常規(guī)水浴鍋在63.5℃即可進行，肉眼可直接觀察檢測結(jié)果。李健等[14]利用逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴增技術(shù)(RT-LAMP)，建立了口蹄疫病毒快速檢測方法，同時評價了該方法的靈敏性和特異性。結(jié)果表明，根據(jù)蹄疫病毒多聚蛋白基因保守區(qū)段設(shè)計的LAMP引物能夠在65℃下，1h內(nèi)實現(xiàn)目標核酸區(qū)段的大量擴增，檢測結(jié)果可直接用肉眼判斷。該檢測體系具有極高的特異性，只能檢測到目標病毒，與其他類似病毒如豬水皰病病毒、豬瘟病毒、豬細小病毒等無交叉反應(yīng)，可檢測到10-5稀釋度的目標病毒核酸量，比普通RTPCR的靈敏性高100倍，比熒光PCR高10倍。

1.6 核酸試紙檢測技術(shù)

核酸試紙檢測技術(shù)是將核酸探針標記與試紙條相結(jié)合進行生物學(xué)檢測，是核酸檢測的新領(lǐng)域。龔真莉等[15]用RT-PCR方法獲得FMDV3D核苷酸片段，在引物中設(shè)計了靈敏度高、特異性好的核酸探針-生物素和地高辛，使擴增產(chǎn)物結(jié)合探針。利用膠體金的放大原理將鏈霉親和素與金顆粒形成膠體金混合物，從而與RT-PCR產(chǎn)物中的生物素探針結(jié)合。硝酸纖維素膜上端標記生物素化山羊抗兔IgG作為指控條帶，下端標記抗地高辛抗體以捕獲RT-PCR產(chǎn)物中的地高辛探針。組裝金標試紙條，檢測RT-PCR產(chǎn)物，結(jié)果表明該核酸試紙條可以檢測到0.3×10-3～3×10-3μg/μL，敏感性高于瓊脂糖凝膠電泳，兩種方法的符合率高。

1.7 賴解旋酶恒溫基因擴增技術(shù)

賴解旋酶恒溫基因擴增技術(shù)(HDA)是一種新興、簡單、有效的基因擴增技術(shù)，其擴增原理是先用解旋酶解開雙鏈DNA，再依靠單鏈DNA結(jié)合蛋白(SSB)與模板單鏈結(jié)合，使模板單鏈處于單鏈狀態(tài)并保護它的完整性，引物與模板雜交，然后在DNA聚合酶催化下擴增。新生成的dsDNA產(chǎn)物作為底物進入下一輪擴增[16]。金靜維等[17]針對FMDV編碼3D蛋白(RNA聚合酶)的保守序列設(shè)計特異性引物，建立了FMDV逆轉(zhuǎn)錄解旋酶恒溫擴增技術(shù)(RT-HDA)快速檢測方法。該方法可在65℃下，120min內(nèi)實現(xiàn)對口蹄疫病毒保守序列的大量擴增。該方法可檢測到0.2ng的FMDV核酸量，比普通RT-PCR高10倍，具有極高的特異性，除了能對FMDV核酸進行擴增外，對其他臨床癥狀與口蹄疫類似的病毒，如水皰病病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒、豬細小病毒和水皰性口炎病毒的核酸，則不能擴增出目的片段。

2 小結(jié)

口蹄疫防控工作是一項涉及畜牧業(yè)安全生產(chǎn)的大事，也是保障人們食品安全和國家聲譽的重要問題。目前，我國是疫區(qū)國家，國內(nèi)及周邊疫情都很復(fù)雜，口蹄疫的防控形勢仍比較嚴峻，口蹄疫的正確診斷是進行防控的前提和基礎(chǔ)，因此，建立早期、快速而準確的檢測方法從而采取相應(yīng)的防控措施才能控制口蹄疫的流行。目前已經(jīng)建立了FMDV多種分子生物診斷方法，但這些方法各有利弊，如基因芯片檢測技術(shù)優(yōu)點是一次可檢測大量樣品和大量疾病，檢測速度快、靈敏度高，缺點是一次性需要大量的資金投入，費用高，不適合基層實驗室應(yīng)用，且特異性不高，容易出現(xiàn)假陽性。常規(guī)RT-PCR方法雖然檢測速度快、特異性強，但不能準確定量，且敏感性有限。熒光定量RT-PCR方法雖然克服了常規(guī)RT-PCR的缺陷，但儀器和探針的合成價格昂貴，檢測成本比較高，不適合大面積推廣應(yīng)用。LAMP方法雖然簡單、方便，適合基層進行推廣應(yīng)用，但靈敏度太高，易出現(xiàn)假陽性結(jié)果。文中提到的核酸試紙檢測技術(shù)，需要對樣品進行PCR擴增，且需要對樣品進行純化，對技術(shù)要求較高，基層部門不易掌握。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，筆者認為恒溫基因擴增技術(shù)與試紙檢測技術(shù)結(jié)合進行檢測是未來分子檢測技術(shù)發(fā)展的新方向，目前對其他疾病的檢測方面已經(jīng)研制出了基因試紙卡檢測盒，是將LAMP檢測與試紙檢測技術(shù)相結(jié)合的新技術(shù)，兼具二者的優(yōu)點，操作簡單，全程時間短，又能避免假陽性的出現(xiàn)，不需要冷凍保存，易保存和運輸，適合基層獸醫(yī)部門應(yīng)用，基因試紙卡及其配套適合攜帶的簡易核酸制備設(shè)備是未來口蹄疫檢測試劑的研究方向。■

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山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系生豬產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團隊項目(SDAIT-08-17)。