久瀉靈顆粒對脾腎陽虛型潰瘍性結腸炎大鼠結腸髓樣分化因子88和白細胞介素受體相關激酶1表達的影響

劉香玉，劉永華，李海龍，2，劉峰林，程小麗，吳玉泓，2

1.甘肅中醫藥大學，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省中藥新產品創制工程實驗室，甘肅 蘭州 730000

久瀉靈顆粒對脾腎陽虛型潰瘍性結腸炎大鼠結腸髓樣分化因子88和白細胞介素受體相關激酶1表達的影響

劉香玉1，劉永華1，李海龍1，2，劉峰林1，程小麗1，吳玉泓1，2

1.甘肅中醫藥大學，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省中藥新產品創制工程實驗室，甘肅 蘭州 730000

目的觀察久瀉靈顆粒對脾腎陽虛型潰瘍性結腸炎（UC）大鼠結腸髓樣分化因子88（MyD88）和白細胞介素受體相關激酶1（IRAK1）表達的影響，探討其作用機制。方法 采用復合方法制作動物模型。90只Wistar大鼠隨機分為空白組、模型組、陽性藥組和久瀉靈高、中、低劑量組，各給藥組給予相應藥物灌胃。RT-qPCR、免疫組化和Western blot分別檢測MyD88、IRAK1基因和蛋白的表達。結果 與空白組比較，模型組大鼠 MyD88、IRAK1基因和蛋白表達均增強（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠 MyD88、IRAK1基因和蛋白表達均減弱（P＜0.01），久瀉靈顆粒高劑量組最為明顯。結論 久瀉靈顆粒可抑制MyD88、IRAK1的表達，影響MyD88信號通路的傳導，阻滯下游炎癥因子的釋放，從而達到治療脾腎陽虛型UC的目的。

久瀉靈顆粒；潰瘍性結腸炎；脾腎陽虛；髓樣分化因子88；白細胞介素受體相關激酶1；大鼠

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種反復發作的慢性非特異性炎癥性腸病（inflammatory bowel disease，IBD），屬于中醫學“久痢”“久瀉”范疇，臨床常見腹痛腹瀉伴里急后重、黏液膿血便等癥狀，脾腎陽虛型UC在臨床最為常見[1]，其病因尚不明確，目前認為與自身免疫密切相關[2]。有研究顯示，TLRs/MyD88信號通路在UC發病中起重要作用[3]。本研究選擇MyD88依賴信號通路中髓樣分化因子88（MyD88）和白細胞介素受體相關激酶1（IRAK1）作為效應指標，觀察其在脾腎陽虛型UC模型大鼠結腸組織基因和蛋白的表達。久瀉靈顆粒是以四神丸合理中丸為主方，功效溫補脾腎。課題組前期研究表明，久瀉靈顆粒對大鼠結腸黏膜局部過激的免疫炎癥反應有治療作用，其治療效果與治療時間呈正相關[4-5]。在此基礎上，本實驗就不同劑量久瀉靈顆粒治療脾腎陽虛型UC的效果，研究其藥物量效關系。

1 實驗材料

1.1 動物

SPF級Wistar大鼠90只，雌雄各半，鼠齡5～7周，體質量（170±20）g，甘肅中醫藥大學實驗動物中心，動物許可證號SCXK（甘）2015-0002。飼養于甘肅中醫藥大學SPF級實驗室。

1.2 藥物

大黃水煎液，甘肅中醫藥大學附屬醫院；氫化可的松注射液，國藥集團容生制藥有限公司，批號1406418-A11；久瀉靈顆粒（補骨脂∶人參∶干姜∶炒白術∶炙甘草∶五味子∶肉豆蔻∶吳茱萸＝4∶3∶3∶3∶3∶2∶2∶1），甘肅省眾友健康醫藥股份有限公司；柳氮磺吡啶腸溶片（SASP），上海信誼天平藥業有限公司，批號09141010。

1.3 主要試劑與儀器

TNBS（Sigma公司），MyD88、IRAK1基因上下游引物（大連寶生物公司），反轉錄試劑盒、擴增試劑盒（Promega公司），濃縮型 DAB底物液、DAB溶液、兔SP試劑盒（中杉金橋），SDS-PAGE凝膠、BCA蛋白定量試劑盒（Solarbio公司），MyD88、IRAK1一抗（ImmunoWay）。電動勻漿器、冷凍高速離心機（Biofuge-Stratos），Bio-Rad熒光定量 PCR 儀（CFX96），BI-2000醫學圖像分析系統（成都泰盟科技有限公司），MIE圖像處理系統（山東易創電子有限公司），顯微鏡（日本 Olympus，CX21型），Benchmark Plus連續波長酶標儀（Bio-rad），核酸轉印系統（Bio-rad，Mini Protean），電泳儀（BIO-RAD，PowerPac Universal），凝膠成像分析系統（Bio-rad，CHEMI DOC XRS+）。

2 實驗方法

2.1 分組和造模

實驗大鼠適應性喂養7 d，按性別及體質量隨機數字表法分為空白組、模型組、陽性藥組和久瀉靈高、中、低劑量組，每組 15只。采用大黃水煎液灌胃＋肌注氫化可的松＋TNBS＋乙醇灌腸法[6-7]復制脾腎陽虛型UC大鼠模型，除空白組外，其余各組大鼠每日上午予大黃水煎液灌胃，每日下午予蒸餾水灌胃，2 mL/只，共14 d，造成脾虛模型，空白組大鼠給予等體積蒸餾水；在此基礎上，第15日大鼠左右肢臀部交替肌注氫化可的松25 mg/（kg?d），共10 d，造成脾腎陽虛模型；第25日禁食不禁水，第26日給予100 mg/kg TNBS＋50%乙醇灌腸，空白組給予等體積蒸餾水灌腸，完成病證結合動物模型。

2.2 給藥

造模后第2日開始藥物干預灌胃，1次/d。久瀉靈高、中、低劑量組每日分別給予（通過體型系數換算大約為正常成人劑量的10、5、2.5倍）13.5、6.75、3.375 g原藥材/kg藥液灌胃，陽性藥組按0.2 g/kg劑量給予SASP灌胃，空白組和模型組給予等量生理鹽水灌胃，灌胃體積均為10 mL/kg，共21 d。

2.3 標本采集

各組大鼠于造模21 d末禁食不禁水24 h，水合氯醛麻醉，剖腹截取大鼠整個結腸組織，縱軸剪開，生理鹽水反復清洗，裝入標記的凍存管，-80 ℃保存。

2.4 指標檢測

2.4.1 RT-qPCR檢測髓樣分化因子88和白細胞介素受體相關激酶1 mRNA表達 提取總RNA，反轉錄合成cDNA，引物序列見表1。PCR擴增反應：反應體系為25 μL，預變性，PCR反應循環40次，溶解，取各組Ct值，ΔCt＝Ct值目的基因－Ct值GAPDH，2-ΔΔCt法計算相對表達量，重復3次，取其平均值。

表1 基因引物序列

2.4.2 免疫組化和 Western blot檢測髓樣分化因子88和白細胞介素受體相關激酶1蛋白表達 免疫組化：石蠟切片、脫蠟，去離子水孵育、封閉；滴加MyD88、IRAK1抗體孵育，滴加生物素化山羊抗兔IgG孵育，辣根酶標記鏈霉卵白素工作液孵育，滴DAB液后室溫顯色；蘇木素輕度復染，自來水返藍，脫水透明，中性樹膠封片；每組取切片4張，每張切片光鏡下取8個視野觀察，應用醫學圖像分析系統分析平均光密度。Western blot：提取蛋白，按說明滴加BCA蛋白定量試劑，酶標儀測OD值，計算蛋白濃度，buffer（5×）進行蛋白變性；蛋白電泳，轉膜；免疫反應：封閉，一抗孵育，二抗孵育，化學發光；凝膠圖像分析，每個目標帶密度與GAPDH密度的比值進行定量分析作為蛋白的相對表達量。

3 統計學方法

4 結果

4.1 一般狀況

空白組大鼠反應敏捷，飲食、活動情況正常，精神佳，毛發柔順有光澤，糞便呈棕褐色顆粒。模型組大鼠造模第 14日開始出現蜷臥、扎堆倦怠、毛色晦黯、食量減少、體質量減輕、大便質軟等脾腎陽虛的癥狀；病證結合造模后均出現稀便、黏液便、部分可見膿血便、肛周污穢、精神萎靡、倦怠、畏寒、體型消瘦、成群蜷縮或弓背、毛發枯槁疏散無光澤等癥狀。經藥物治療后，久瀉靈各劑量組大鼠毛發潔凈，反應較靈活，精神、飲食尚可，大便基本成形，個別出現軟便，其中，久瀉靈高劑量組大鼠毛發潔凈有光澤，反應靈敏，大便呈顆粒狀，顯著恢復。實驗過程中模型組死亡3只，久瀉靈高劑量組死亡2只，久瀉靈中劑量組死亡2只，久瀉靈低劑量組死亡3只，陽性藥組死亡4只。

4.2 久瀉靈顆粒對模型大鼠結腸黏膜形態學的影響

各組大鼠結腸組織黏膜形態學評分參照 Luketal標準[8]。與空白組比較，模型組評分明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組評分不同程度降低（P＜0.01），且以久瀉靈高劑量組最為明顯。結果見表2。

表2 各組大鼠結腸組織黏膜損傷評分比較（±s，分）

表2 各組大鼠結腸組織黏膜損傷評分比較（±s，分）

注：與空白組比較，△△P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01；與久瀉靈高劑量組比較，#P＜0.05，##P＜0.01（下同）

組別 只數 劑量/（g/kg） 黏膜損傷評分空白組 15 0.38±0.52模型組 12 4.69±0.46△△久瀉靈高劑量組 13 13.5 2.06±0.32**久瀉靈中劑量組 13 6.75 2.81±0.37**#久瀉靈低劑量組 12 3.375 3.01±0.53**#陽性藥組 11 0.2 2.87±0.35**##

4.3 久瀉靈顆粒對模型大鼠結腸髓樣分化因子88和白細胞介素受體相關激酶1基因表達的影響

與空白組比較，模型組大鼠結腸組織 MyD88、IRAK1基因表達明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥大鼠結腸組織MyD88、IRAK1基因表達明顯下降（P＜0.01），且以久瀉靈高劑量組尤為明顯。結果見表3。

表3 各組大鼠結腸組織MyD88、IRAK1基因水平比較（±s，2-ΔΔCt）

表3 各組大鼠結腸組織MyD88、IRAK1基因水平比較（±s，2-ΔΔCt）

組別 只數 劑量/（g / k g） M y D 8 8 I R A K 1空白組 8 0 . 2 5 ± 0 . 0 1 0 . 2 6 ± 0 . 0 2模型組 8 1 . 0 0 ± 0 . 0 0△△ 1 . 0 0 ± 0 . 0 0△△久瀉靈高劑量組 8 1 3 . 5 0 . 3 7 ± 0 . 0 3** 0 . 3 6 ± 0 . 0 3**久瀉靈中劑量組 8 6 . 7 5 0 . 5 1 ± 0 . 0 7**## 0 . 4 6 ± 0 . 0 2**##久瀉靈低劑量組 8 3 . 3 7 5 0 . 5 8 ± 0 . 0 2**## 0 . 5 2 ± 0 . 0 6**##陽性藥組 8 0 . 2 0 . 5 4 ± 0 . 0 5**## 0 . 4 6 ± 0 . 0 1**##

4.4 久瀉靈顆粒對模型大鼠結腸組織髓樣分化因子88和白細胞介素受體相關激酶1蛋白表達的影響

4.4.1 免疫組化結果 空白組組織形態正常，MyD88和IRAK1在腸黏膜及下層表達微弱；模型組腸黏膜有缺損，腸黏膜及下層見多量黃色顆粒浸潤，MyD88、IRAK1陽性表達明顯上調；久瀉靈高劑量組MyD88存在散在黃色顆粒浸潤黏膜間質，IRAK1表達為弱陽性，但與空白組比較仍升高；久瀉靈中劑量組腸黏膜層見少量MyD88陽性表達，IRAK1中強度陽性表達，黃色顆粒減少；低劑量組在組織黏膜層、黏膜下層見較大量 MyD88陽性表達，散在分布IRAK1陽性表達，均弱于模型組；陽性藥組腸黏膜組織輕度炎性改變，MyD88、IRAK1見個別弱陽性表達，間質黃色顆粒少見，見圖 1、圖2。與空白組比較，模型組 MyD88、IRAK1表達增強（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組MyD88、IRAK1表達減弱（P＜0.01），且以久瀉靈高劑量組最明顯。結果見表4。

圖2 各組大鼠IRAK1蛋白表達（免疫組化染色，×400）

表4 各組大鼠結腸黏膜MyD88、IRAK1蛋白表達比較（±s，平均光密度值）

表4 各組大鼠結腸黏膜MyD88、IRAK1蛋白表達比較（±s，平均光密度值）

組別 只數 劑量/（g/kg） MyD88 IRAK1空白組 8 72.42±2.79 77.11±0.96模型組 8 109.74±1.72△△108.14±2.11△△久瀉靈高劑量組 8 13.5 77.13±1.12** 81.81±2.46**久瀉靈中劑量組 8 6.75 79.68±2.39**##89.75±1.95**##久瀉靈低劑量組 8 3.375 93.89±3.02**#95.05±2.71**#陽性藥組 8 0.2 88.30±2.30**#91.97±1.67**#

4.4.2 Western blot結果 模型組蛋白表達明顯高于空白組，各給藥組蛋白表達較模型組明顯減弱，且與藥物濃度呈正相關，且以久瀉靈高劑量組最明顯，見圖3。與空白組比較，模型組MyD88、IRAK1表達明顯增強（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組IRAK1表達減弱（P＜0.01），且以久瀉靈高劑量組最明顯。結果見表5。

圖3 各組大鼠結腸黏膜MyD88、IRAK1蛋白表達免疫印跡圖

表5 各組大鼠結腸黏膜MyD88、IRAK1蛋白表達比較（±s，平均灰度值）

表5 各組大鼠結腸黏膜MyD88、IRAK1蛋白表達比較（±s，平均灰度值）

組別 只數 劑量/（g / k g） M y D 8 8 I R A K 1空白組 8 0 . 0 8 ± 0 . 0 1 0 . 1 1 ± 0 . 0 1模型組 8 0 . 7 3 ± 0 . 0 0△△ 0 . 9 7 ± 0 . 0 1△△久瀉靈高劑量組 8 1 3 . 5 0 . 2 8 ± 0 . 0 1** 0 . 3 8 ± 0 . 0 1**久瀉靈中劑量組 8 6 . 7 5 0 . 4 9 ± 0 . 0 4**## 0 . 6 6 ± 0 . 0 5**##久瀉靈低劑量組 8 3 . 3 7 5 0 . 5 8 ± 0 . 0 1**## 0 . 7 6 ± 0 . 0 1**##陽性藥組 8 0 . 2 0 . 4 9 ± 0 . 0 3**## 0 . 6 6 ± 0 . 0 5**##

5 討論

MyD88是Toll樣受體（TLRs）信號通路中的重要銜接蛋白，Toll樣受體可通過MyD88依賴途徑及非MyD88依賴途徑向下游進行信號傳遞，TLRs活化后MyD88募集原本穩定結合于Tollip的IRAK家族成員，磷酸化IRAK1組成聯合體IRAK1-MyD88，此聯合體可高度磷酸化自身激酶導致IRAK1從MyD88與 Tollip分離后參與下游反應，最終激活核因子-κB引起一系列炎癥反應，造成組織損傷。

本實驗結果表明，病證結合造模后大鼠飲食、精神活動、毛發、大便性質均發生改變；對大鼠結腸黏膜形態學進行評分，模型組遠高于空白組而各給藥組評分不同程度降低。RT-qPCR、免疫組化和 Western blot結果均顯示，模型組較空白組MyD88和IRAK1無論在 mRNA還是蛋白水平均明顯升高，提示脾腎陽虛型UC模型與MyD88依賴信號通路的異常表達密切相關；各給藥組較模型組基因及蛋白水平不同程度降低，其中久瀉靈顆粒高劑量組最為明顯，表明久瀉靈顆粒可抑制MyD88依賴信號通路下游分子達到抗炎作用，以此來減輕炎癥反應對結腸黏膜的損傷，促進結腸黏膜的修復。

久瀉靈顆粒以四神丸為君藥，重用補骨脂，取其辛苦大溫之藥性，補命門之火以溫脾土，針對腎虛泄瀉；理中丸作臣藥，其功效溫中祛寒，補氣健脾是為溫補并用，先天之本與后天之本互資互生；佐以肉豆蔻溫暖脾胃配合君藥溫腎暖脾，再佐酸味之五味子，固腎澀腸，止瀉之力加倍；吳茱萸藥性辛苦大熱，溫暖肝脾腎而散寒，可輔君臣溫澀止瀉之功。

綜上，久瀉靈顆粒可抑制TLR4/MyD88依賴信號通路中MyD88、IRAK1的表達，從而減弱炎癥反應，保護修復結腸組織，高劑量久瀉靈顆粒治療脾腎陽虛型UC療效最佳。

[1]朱佳杰,蘇曉蘭,劉珊,等.病證結合復制大鼠脾腎陽虛腹瀉型腸易激綜合征模型的探討[J].上海中醫藥雜志,2016,50(9)：15-17,35.

[2]ZHU H, LI Y R. Oxidative stressand redox signaling mechanisms of inflammatory bowel disease：updated experimental and clinical evidence[J]. Exp Biol Med,2012,237(5)：474-480.

[3]周毅駿,欽丹萍,楊新艷,等.雷公藤多苷片對潰瘍性結腸炎大鼠miR-146a、miR-146b及TLR4/MyD88依賴信號通路的調控作用研究[J].中草藥,2016,47(10)：1723-1730.

[4]吳玉泓,許雅清,李海龍,等.久瀉靈顆粒對脾腎陽虛型潰瘍性結腸炎大鼠TLR4及NF-κB p65表達的影響[J].中國實驗動物學報,2016,24(1)：47-52.

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[6]吳玉泓,許雅清,李海龍,等.脾腎陽虛型潰瘍性結腸炎大鼠模型的建立[J].中國實驗動物學報,2016,24(2)：116-119.

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[8]國家中醫藥管理局醫政司.中醫臨床診療術語[M].北京：中國標準出版社,1997.

Effects of Jiuxieling Granules on Expressions of MyD88 and IRAK1 in Ulcerative Colitis Rats with Spleen-Kidney Yang Deficiency

LIU Xiang-yu1, LIU Yong-hua1, LI Hai-long1,2, LIU Feng-lin1, CHENG Xiao-li1, WU Yu-hong1,2(1. Gansu University of Chinese Medicine, Lanzhou 730000, China; 2. Gansu Province Chinese Medicine New Products Engineering Laboratory, Lanzhou 730000, China)

ObjectiveTo observe the effects of Jiuxieling Granules on the expressions of MyD88 and IRAK1 in ulcerative colitis model rats with spleen-kidney yang deficiency; To discuss its mechanism of action. Methods Animal models were established by compound methods. 90 Wistar rats were randomly divided into blank group, model group, positive medicine group, and Jiuxieling Granules high-, medium-, and low-dose groups. Each administration group was given relevant medicine for gavage. RT-qPCR, SP immunohistochemistry and Western blot were used to detect mRNA and proteins of MyD88 and IRAK1 in colon tissues. Results Compared with the blank group, mRNA and proteins of MyD88 and IRAK1 in the model group increased (P＜0.01). Compared with the model group, mRNA and proteins of MyD88 and IRAK1 in each administration group decreased (P＜0.01), especially in Jiuxieling Granules high-dose group. Conclusion Jiuxieling Granules can reduce the expressions of MyD88 and IRAK1, and then influence the transmission of MyD88 signaling pathway and block the release of downstream inflammatory factors to achieve the result of treating ulcerative colitis with spleen-kidney yang deficiency.

Jiuxieling Granules; ulcerative colitis; spleen-kidney yang deficiency; MyD88; IRAK1; rats

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.09.013

R285.5

A

1005-5304(2017)09-0051-04

2016-12-03）

（

2016-12-21；編輯：華強）

國家自然科學基金（81260520）

吳玉泓，E-mail：172924249@qq.com