細胞因子LIF和IL-10在體外卵巢癌微環境影響樹突狀細胞前體細胞分化和功能中的作用研究

陳麗莉，潘子旻，盧曉男，俞 穎，胡東曉

（浙江大學醫學院附屬婦產科醫院婦科，浙江 杭州 310000）

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細胞因子LIF和IL-10在體外卵巢癌微環境影響樹突狀細胞前體細胞分化和功能中的作用研究

陳麗莉，潘子旻，盧曉男，俞 穎，胡東曉

（浙江大學醫學院附屬婦產科醫院婦科，浙江 杭州 310000）

目的 探討白血病抑制因子（LIF，leukemia inhibitory factor）和白介素-10（Interleukin-10）在卵巢癌細胞微環境中對樹突狀細胞（Dendritic cell，DC）前體細胞分化及其功能的影響。方法 分離健康捐贈者外周血白細胞中的單個核細胞，采用全自動磁選儀分選Lin-CD45RA- DC前體細胞，用GM-CSF和TNF-α聯合誘導成熟DC生成。在培養過程中加入細胞因子LIF及IL-10及其抗體組合，研究LIF和IL-10在卵巢癌細胞SKOV3培養上清中對Lin-CD45RA-DC前體細胞分化和成熟的影響。結果 在空白組中，IL-10聯合LIF能降低培養系統中mDC的比例，增高pDC的比例，同時成熟DC 表達的表面分子HLA-DR和CD80明顯降低，刺激CD3+T細胞增殖的能力同時降低，培養上清中免疫活性分子IL-12的分泌水平也下降。結論 卵巢癌SKOV3培養上清也下調mDC比例并上調pDC比例。但在卵巢癌SKOV3 細胞培養上清中加入抗IL-10及LIF細胞因子抗體，培養體系中mDC的下調和pDC的上調沒有變化，IL-12的水平仍然是下降的。

細胞因子；IL-10；LIF；上皮性卵巢癌；樹突狀細胞

上皮性卵巢癌（epithelium ovarian carcinoma，EOC）是婦科惡性腫瘤中惡性程度最高的一類，五年生存率僅為30%左右。目前認為EOC的臨床特點，極易發生局部擴散和盆腹腔內播散性轉移，且70%的患者在發現時已經為晚期，這與腫瘤局部微環境免疫缺陷具有密切的相關性，并認為是治療的重要環節。構成腫瘤的免疫微環境包括了癌細胞，基質細胞，浸潤的炎癥細胞，如樹突狀細胞（dendritic cell，DC）、T細胞，組織液，微血管以及細胞因子等，并認為這些因素在腫瘤免疫及免疫耐受中起重要作用[1]。

樹突狀細胞是DC是生物體內功能最強大的專職抗原提呈細胞，而抗原提呈是機體特異性免疫應答過程中的必要步驟，因此DC在機體抗腫瘤免疫中起到至關重要的作用。在人類外周血中，DC通常分為兩種亞群，CD11c+CD123-DC，具有單個核細胞的特性，稱為“髓樣DC”（MDC）；CD11c-CD123+DC，具有漿細胞的特性，稱為“漿細胞樣DC”（PDC）。前者誘導Th1免疫反應，刺激CTL細胞的增殖和免疫效應；后者對于免疫反應具有雙向調節作用，特別是在腫瘤微環境中，認為其能誘導CD8+調節性T細胞的產生，該類T細胞趨化至腫瘤區域淋巴結，分泌IL-10，抑制抗腫瘤特異性反應[2]。目前眾多的研究發現，卵巢癌的免疫微環境中存在著樹突狀細胞的分化和功能缺陷：如在上皮性卵巢癌患者中，在腫瘤部位浸潤功能成熟的mDC缺乏，在患者腹水中，mDC/pDC的比例下降，有利于免疫耐受[2-4]，但是相關機制并不明確。

我們既往的研究發現，和正常卵巢上皮細胞培養上清相比較，EOC細胞培養上清中的白血病抑制因子（LIF， leukemia inhibitory factor）顯著升高[5-6]。

LIF是IL-6家族中的一員，廣泛參與細胞的增生、分化等各個環節，在很多的實體瘤中都有高水平表達，在體外調節性T細胞的培養中也發現LIF和免疫抑制性的FoxP3蛋白同步升高，因此認為LIF在腫瘤微環境的局部免疫抑制反應中可能起到重要作用[7]。而LIF在上皮性卵巢癌中的表達和臨床特征具有密切的相關性[8]。基于上述的研究，我們有理由認為LIF是EOC局部微環境缺陷的一個重要組成部分，同時也可能是EOC局部微環境中，抑制mDC分化，促進pDC分化，并抑制DC成熟和功能的重要因子。本研究進一步探討LIF和IL-10在卵巢癌微環境中對DC前體分化的影響。

1 材料與方法

1.1 研究對象

①健康捐贈者外周血白細胞。②上皮性卵巢癌SKOV3細胞株購自于美國模式培養物研究所，由浙江大學醫學院附屬婦產科醫院中心實驗室提供。

1.2 研究方法

1.2.1 收集健康捐贈者外周血白細胞，采用密度梯度離心法收獲單個核細胞。

1.2.2 采用全自動磁性細胞分選儀分選Lin-CD45RADC為前體細胞，采用GM-CSF+TNF-α聯合誘導成熟DC的產生。

1.2.3 進行上皮性卵巢癌細胞株SKOV3的傳代培養，在細胞培養至鋪滿培養瓶80%左右，更換為無血清培養基，36 h后收獲培養上清，離心去除沉淀，置于-70度保存待用。

1.2.4 實驗分組：①空白組：RPMI 1640+GM-CSF（50 ng/mL）和TNF-a（20 ng/mL）。②SKOV3培養上清組：RPMI 1640+GM-CSF（50 ng/mL）和TNF-a（20 ng/mL）+SKOV3培養上清（30%v/v）。③SKOV3培養上清+抗體組：RPMI 1640+GM-CSF（50 ng/mL）和TNF-a（20 ng/mL）+SKOV3培養上清（30%v/v）+IL-10抗體（20 ng/mL）+LIF抗體（20 ng/mL）。④細胞因子聯合組：RPMI 1640+GMCSF（50 ng/mL）和TNF-a（20 ng/mL）+IL-10（20 ng/mL）+LIF（20 ng/mL）。

1.2.5 流式細胞分析測定細胞成熟的表面分子HLA-DR及CD80的表達，mDC（HLA-DR+CD11c+CD123-）以及pDC（HLA-DR+CD11c-CD123+）的比例，同種異體T細胞增殖反應檢測培養系統中的DC對于T細胞的增殖刺激活性，培養上清中IL-12的測定采用ELISA的方法，檢測細胞分泌活性物質的能力。

1.3 統計學方法

用“均數±SD”表示三次實驗的結果。采用SPSS 11.0統計軟件中的獨立樣本t檢驗。P＜0.05被認為差異有顯著意義。

2 結 果

四組培養系統中均有成熟DC的擴增，鏡下觀察細胞為圓形，表面樹突狀多個突起及毛刺狀，大部分呈集簇狀生長，各組之間細胞生長趨勢及形態均無明顯差異。

DC前體細胞經過不同的條件培養后，代表細胞成熟度的表面分子HLA-DR和CD80的表達均有不同程度的升高。在空白組和SKOV3培養上清組中，兩類表面分子的表達均無統計學差異。而在空白組中加入IL-10和LIF因子組合后，HLA-DR及CD80的表達均下降，和其余組別相比差異有統計學意義。在SKOV3組中加入抗IL-10和抗LIF抗體后，HLA-DR和CD80無明顯改變（表1）。

與空白組相比較，SKOV3培養上清能改變mDC和pDC的比例，mDC組成下降，pDC比例上調。而與空白組相比，細胞因子IL-10+LIF聯合也使培養系統中mDC比例下降并上調pDC比例，差異有統計學意義（P＜0.05）；這一效應與SKOV3上清相比，差異無統計學意義。在SKOV3中加入抗IL-10及LIF抗體，所生成的mDC/pDC比例與不加抗體組相比較并無統計學差異，與細胞因子組相比較也明顯改變，但與對照空白組相比較mDC仍然下調，pDC組成上升，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1、圖1所示。

表1 不同培養系統中的細胞分群及細胞表面標記

圖1 不同組別mDC及pDC細胞分群的柱狀圖

觀察不同培養系統處理后的DC產生具有生物活性的IL-12的能力的變化。SKOV3培養上清處理后的DC分泌的IL-12（1.4±0.4）pg/mL，較空白組的成熟DC（2.7±0.9）pg/mL明顯下降。加入IL-10+LIF聯合培養處理后DC產生的IL-12（1.3±0.1）pg/mL也有下降，差異有顯著性意義，P=0.023。在SKOV3中加入細胞因子抗體后，IL-12（1.6±0.4）pg/mL的濃度仍低于空白組，有統計學差異，P=0.005。其余各組之間IL-12的濃度均無明顯差異。見圖2。

圖2 IL-12(P70)的濃度

3 討 論

IL-10是一類免疫抑制因子，研究表明，IL-10對于DC功能的影響表現在多個方面，比如，與IL-10共培養后，DC對于脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）的刺激存在很多缺陷，不能分泌具有免疫刺激效應等炎癥性因子；不能上調共刺激分子的表達。在IL-10的作用下，DC會保持在未成熟狀態，并誘導調節性T細胞的產生[9-10]。而目前對于LIF的研究較少。雖然文獻報道LIF在某些方面影響到DC的分化，但是LIF基因敲除后裸鼠中抗原提呈細胞細胞的抗原處理、提呈和共刺激能力均沒有受到影響[11]。因此LIF的具體效應仍需要進一步研究明確。

我們研究發現，該兩種細胞因子聯合應用能夠明顯抑制DC前體細胞的成熟，提示IL-10和LIF對DC前體的成熟具有相同或協同的抑制作用，但不是拮抗作用，從而確定了IL-10和LIF在DC前體成熟水平具有免疫抑制效應。本研究同時發現，IL-10和LIF共同作用明顯影響了DC前體細胞的分化，使mDC比例下降，而pDC比例增加，并且明顯降低了DC的免疫刺激功能。這種作用與卵巢癌細胞培養上清的作用十分相似，提示卵巢癌細胞對DC前體細胞分化的影響極可能通過IL-10和LIF而實現。但是，當用特異性抗體同時阻斷這兩種細胞因子時，并未發現能逆轉SKOV3培養上清對于DC的抑制作用，提示除IL-10和LIF外，卵巢癌細胞還通過其他途徑影響DC的分化。我們的結果還表明，在卵巢癌微環境中存在一個復雜的細胞因子網絡，多種細胞因子和多條調控途徑同時影響DC的分化，單一的細胞因子阻斷可能無法有效地逆轉腫瘤細胞誘導的免疫抑制。

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本文編輯：趙小龍

R737.31

A

ISSN.2095-8242.2017.034.6557.03

浙江省自然基金項目（LY12H16009）；浙江省教育廳科技項目（Y200909448）；浙江省自然基金項目資助項目（編號：LY12H16024）

陳麗莉（1974-），女，漢族，浙江省杭州市，博士，副主任醫師，婦科腫瘤婦科腫瘤臨床