microRNA-130a在慢性粒細胞白血病細胞耐藥中的作用

蘇梅芳

microRNA-130a在慢性粒細胞白血病細胞耐藥中的作用

蘇梅芳

目的 比較microRNA-130a在伊馬替尼耐藥的慢性粒細胞白血病(CML)細胞株K562R和伊馬替尼敏感的CML細胞株K562中的表達，探討其與CML細胞耐藥的關系。方法 通過實時熒光定量PCR檢測耐藥株K562R和敏感株K562中microRNA-130a的表達水平。通過電穿孔轉染法將microRNA-130a模擬物mimic轉入敏感株K562中上調microRNA-130a的表達，分別用伊馬替尼處理轉染mimic細胞株及對照siRNA細胞株，記錄各組細胞增殖情況。通過AnnexinV和PI雙染法分別檢測各組細胞凋亡情況。使用不同濃度的伊馬替尼處理轉染mimic細胞株及對照細胞株，利用MTT法檢測各組細胞對伊馬替尼的敏感性。結果 microRNA-130a在耐藥株K562中的表達明顯高于敏感株K562。轉染microRNA-130a模擬物mimic的K562細胞對伊馬替尼的增殖抑制率明顯低于對照組，凋亡情況也明顯少于對照組。使用不同濃度的伊馬替尼處理轉染mimic細胞株及對照細胞株，mimic組細胞增殖抑制率明顯低于對照組，IC50分別為0.13 μmol/L和3.19 μmol/L。結論 microRNA-130a在伊馬替尼耐藥株K562R中呈高表達，上調microRNA-130a的表達可降低K562對伊馬替尼的敏感性。

慢性粒細胞白血病；microRNA-130a；伊馬替尼；耐藥

0 引言

慢性粒細胞白血病(CML)是一類造血干祖細胞異常增生的惡性克隆性疾病。該類疾病的一個重要特征是染色體t(9;22) (q34;q11)異位形成費城染色體[1]。費城染色體的形成導致融合蛋白BCR-ABL異常高表達。融合蛋白BCR-ABL具有很強的酪氨酸激酶活性，激活其下游多條信號通路，使細胞獲得無限增殖的能力。這也是慢性粒細胞性白血病的主要發病原因[2-3]。伊馬替尼特異性針對BCR-ABL等酪氨酸激酶抑制劑，臨床主要用于CML的治療。但長期服用伊馬替尼，患者易產生耐藥性，嚴重影響伊馬替尼的臨床療效[4]。microRNA是一類長度為18～24 nt的小非編碼RNA，通過與目標RNA 3′UTR的結合而抑制靶基因的表達[5]。microRNA在細胞增殖、分化、凋亡等多種生命活動中發揮重要作用[6]。近年研究發現，microRNA的特異性表達或沉默與CML的發生及耐藥性相關[7-10]。本研究觀察microRNA-130a在伊馬替尼耐藥細胞株K562中的表達，探討其與CML細胞耐藥的關系，以期為臨床伊馬替尼的耐藥提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 細胞來源 伊馬替尼耐藥株K562R和敏感株K562購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。

1.2 試劑和儀器 反轉錄試劑AMV逆轉錄酶購于Takara公司，SYBR熒光定量試劑盒購于羅氏公司，AnnexinV和PI凋亡檢測試劑盒購于北京全式金生物公司，MTT 細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒購于碧云天公司。二氧化碳細胞培養箱購于Thermo公司，實時定量PCR檢測儀購于美國ABI公司，流式細胞儀FACSCalibur購于美國B&D公司。

1.3 細胞培養 耐藥株K562R和敏感株K562用含10%胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培養基培養，培養于37 ℃的含5% CO2、95%空氣的培養箱中。

1.4 RNA抽提、反轉及實時定量PCR檢測 離心收集細胞，采用Trizol法抽提RNA，并對抽提的RNA進行定量。使用AMV逆轉錄酶將抽提的RNA反轉錄為cDNA。反轉錄的cDNA作為模板進行實時定量PCR檢測。

實時定量PCR特異性檢測microRNA-130a引物由上海生工生物公司合成，序列如表1所示。PCR反應體系為：2×SYBR Mix：5 μL，正反向引物(10 μmol/L)各0.2 μL，模板cDNA 25 ng，無菌水補至10 μL。反應條件為95 ℃ 1 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，循環數為40，每個循環進行一次熒光信號的收集。microRNA-130a的相對表達量采用2-ΔΔt對基因表達量進行相對定量。

表1 核苷酸序列

1.5 microRNA-130a mimic和對照無義鏈siRNA的合成 設計特異性的microRNA-130a mimic序列和對照無義鏈siRNA序列，所設計核苷酸序列由上海生工生物公司合成。microRNA-130a mimic和對照無義鏈siRNA序列如表1所示。

1.6 microRNA-130a mimic轉染 收集處于對數生長期的K562細胞2×107個，無血清PRIM-1640重懸，使細胞濃度為2×106/mL，將細胞等分至2個電轉杯中，一個電轉杯加入對照鏈siRNA，另一個電轉杯加入mimic，冰上放置15 min，設定電壓為250 V，轉染濃度為100 nmol/L進行轉染。轉染后繼續培養，培養24 h后，實時定量PCR檢測mimic表達情況。

1.7 細胞增殖曲線 分別將轉染siRNA和mimic K562細胞培養于六孔板中，每孔細胞數為1×106，每組設3個副孔，3 μmol/L伊馬替尼處理各孔細胞，隔天收集細胞，記錄細胞數，繪制細胞增殖曲線。

1.8 AnnexinV和PI凋亡檢測、MTT檢測細胞增殖抑制率 分別收集經3 μmol/L伊馬替尼處理后的轉染siRNA和mimic的K562細胞，按AnnexinV和PI凋亡試劑盒步驟對細胞進行AnnexinV和PI標記，流式儀檢測AnnexinV和PI標記的細胞，分析細胞凋亡情況。

分別將轉染siRNA和mimic的K562細胞培養于96孔板中，每孔細胞數為3×104，按0、1、5、10 μmol/L的伊馬替尼分別處理兩組細胞，置于37 ℃培養，培養48 h。終止培養前4 h每孔分別加入20 μL MTT試劑，培養48 h后，離心棄上清，加入150 μL DMSO，充分渦旋振蕩混勻，全自動酶標儀檢測570 nm波長處的吸光值。計算各組細胞增殖抑制率，根據線性回歸方程求得伊馬替尼作用于siRNA和mimic的 K562細胞的半數抑制濃度IC50。

2 結果

2.1 K562和K562R細胞中microRNA-130a的表達 實時定量PCR檢測結果表明，與敏感株K562相比，microRNA-130a在耐藥株K562R細胞中的表達水平顯著提高(P<0.01)，表達水平為K562的(5.19±0.57)倍。見圖1。

圖1 K562和K562R細胞中microRNA-130a的相對表達量

2.2 microRNA-130a mimic和siRNA轉染K562后microRNA-130a的表達 實時定量PCR檢測結果表明，K562轉染microRNA-130a mimic后，細胞總microRNA-130a的表達水平較對照組明顯增高(P<0.01)，表達水平為K562 siRNA的(26.72±3.06)倍。見圖2。

圖2 K562細胞轉染siRNA和mimic后microRNA-130a的相對表達量

2.3 microRNA-130a mimic和siRNA轉染K562后細胞增殖情況 K562轉染microRNA-130a mimic和siRNA后，分別取等量的細胞進行培養，同時伊馬替尼處理各組別細胞，分別在第0、2、4、6天測定兩組細胞的細胞數，繪制增殖曲線。增殖曲線結果表明，伊馬替尼處理對兩組細胞增殖抑制作用明顯，mimic組細胞增殖抑制情況好于siRNA組(P<0.05)。見圖3。

圖3 K562細胞轉染siRNA和mimic后伊馬替尼處理細胞的增殖情況

2.4 microRNA-130a mimic和siRNA轉染K562后細胞凋亡情況 K562轉染microRNA-130a mimic和siRNA后，分別取等量的細胞進行培養，同時伊馬替尼處理各組別細胞，24 h后檢測各組細胞凋亡情況。流式結果表明，伊馬替尼處理后，兩組細胞均表現出明顯的凋亡現象。siRNA組凋亡細胞約占66.3%±5.62%，mimic組凋亡細胞約占32.4%±2.15%。兩組細胞凋亡情況比較差異有統計學意義(P<0.01)。見圖4。

2.5 MTT法檢測microRNA-130a mimic和siRNA轉染的K562細胞對伊馬替尼的敏感性 K562轉染microRNA-130a mimic和siRNA后，分別取等量的細胞進行培養，同時用0、1、5、10 μmol/L伊馬替尼處理各組別細胞，MTT法檢測microRNA-130a mimic和siRNA轉染的K562細胞對伊馬替尼的敏感性。MTT結果顯示，隨著藥物增加，伊馬替尼對mimic和siRNA兩組細胞的增殖抑制作用呈遞增趨勢。但是mimic細胞達到相同抑制率所需要的伊馬替尼的濃度明顯高于siRNA細胞。伊馬替尼對siRNA和mimic K562的半數抑制濃度IC50分別為0.13、3.19 μmol/L，兩組細胞IC50比較差異有統計學意義(P<0.01)。見圖5。

圖4 K562細胞轉染siRNA和mimic后伊馬替尼處理細胞的凋亡情況

圖5 K562細胞轉染siRNA和mimic后伊馬替尼處理細胞的增殖抑制率

3 討論

伊馬替尼作為治療慢性粒細胞白血病常用的酪氨酸激酶抑制劑，多數患者在用藥初期對藥物敏感，但治療后一段時間往往產生耐藥性[11-15]。近年來，越來越多的研究開始關注microRNA在白血病發生、發展及耐藥中的作用。最近研究表明，microRNA異常表達與酪氨酸激酶抑制劑的耐藥性相關[16]。近年來研究報道，在多種腫瘤組織(如卵巢癌[17]、肺癌[18]和胃癌[19-20])中，microRNA-130a表達明顯上調。

伊馬替尼作為酪氨酸激酶抑制劑，開啟了白血病分子靶向治療的新紀元。本研究發現，伊馬替尼耐藥株K562R細胞中，microRNA-130a表達較敏感株K562明顯上調，提示microRNA-130a在CML細胞中表達，并且其表達水平可能與伊馬替尼的敏感性有關。為此，筆者在敏感株K562細胞中過表達microRNA-130a的類似物mimic，轉染mimic的K562細胞microRNA-130a相對表達量明顯高于對照組。結果表明，外源microRNA-130a的類似物mimic在敏感株K562中過表達成功。為了進一步明確microRNA-130a如何調控CML對伊馬替尼的敏感性，本研究分別檢測了轉染mimic和siRNA的K562細胞的增殖情況。伊馬替尼對過表達microRNA-130a的K562細胞抑制作用明顯減弱，表明microRNA-130a明顯加速了K562對伊馬替尼的耐藥性。通過流式分析檢測細胞凋亡情況，經伊馬替尼處理后，過表達microRNA-130a的K562細胞凋亡情況明顯改善。流式分析檢測提示，過表達microRNA-130a通過抵抗凋亡進而降低白血病細胞對伊馬替尼的敏感性。進一步耐藥實驗結果表明，過表達microRNA-130a的K562的IC50從0.13 μmol/L提升至3.19 μmol/L，過表達microRNA-130a后，白血病細胞對伊馬替尼更不敏感。microRNA-130a表達上調可減弱K562細胞對伊馬替尼的敏感性，增強其耐藥能力，其耐藥能力的增強可能與細胞的凋亡相關，但具體的作用機制有待進一步研究。microRNA-130a作為抑癌基因，對CML的耐藥性及敏感性有重要意義。microRNA-130a在伊馬替尼敏感和耐藥的患者中的差異表達，可作為臨床上伊馬替尼的治療依據，并且為個體化治療提供了潛在的治療靶點。今后的研究應深入探討microRNA-130a在CML耐藥中的具體機制，以期為臨床實踐提供基礎資料，為白血病耐藥防治提供新的作用靶點。

[1] Sidaway P.Haematological cancer:ponatinib in CML-keeping PACE with multiple mutations[J].Nat Rev Clin Oncol,2016,13(3):135.

[2] Jabbour E,Kantarjian H.Chronic myeloid leukemia:2016 update on diagnosis,therapy,and monitoring[J].Am J Hematol,2016,91(2):252-265.

[3] Bansal A,Radich J.Is cure for chronic myeloid leukemia possible in the tyrosine kinase inhibitors era[J].Curr Opin Hematol,2016,23(2):115-120.

[4] 宋其芳,瞿燕春,楊紅宇,等.伊馬替尼耐藥CML患者ABL基因激酶區突變檢測[J].臨床檢驗雜志,2011,29(3):185-187.

[5] Dávalos A,Suárez Y.MiRNA-based therapy:from bench to bedside[J].Pharmacol Res,2013,75:1-2.

[6] 燕華,李衛.MicroRNAs在腫瘤中的作用研究進展[J].實用兒科臨床雜志,2012,27(21):1683-1685.

[7] Chiarenza A,Manetti F,Petricci E,et al.Novel acylguanidine derivatives targeting smoothened induce antiproliferative and pro-apoptotic effects in chronic myeloid leukemia cells[J].PLoS One,2016,11(3):e0149919.

[8] Di SC,Mirone G,Perna S,et al.The roles of microRNAs in the pathogenesis and drug resistance of chronic myelogenous leukemia (Review)[J].Oncol Rep,2016,35(2):614-624.

[9] Hua JY,Feng Y,Pang Y,et al.MiR-181a Promotes proliferation of human acute myeloid leukemia cells by targeting ATM[J].Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi,2016,24(2):347-351.

[10]Wang K,Xu Z,Wang N,et al.Analysis of microRNA and gene networks in human chronic myelogenous leukemia[J].Mol Med Rep,2016,13(1):453-460.

[11]燕瑋,楊威.達沙替尼應用于伊馬替尼耐藥的慢性粒細胞白血病的研究進展[J].實用藥物與臨床,2012,15(2):108-110.

[12]邢宏運,卞鐵榮,李曉明,等.初診慢性粒細胞白血病患者ABLA激酶區基因突變的研究[J].實用醫學雜志,2015,31(12):1962-1964.

[13]殷世亮,張弘,金戈,等.高三尖杉酯堿與伊馬替尼協同誘導慢性粒細胞凋亡[J].沈陽醫學院學報,2016,18(5):332-335.

[14]劉景華,周凡,劉洋,等.伊馬替尼治療慢性期慢性髓細胞白血病早期分子反應39 例臨床分析[J].臨床軍醫雜志,2015,43(12):1215-1217.

[15]劉旭軍,周晉,趙艷紅,等.慢性粒細胞白血病耐藥機制及治療策略[J].現代生物醫學進展,2014,14(5):975-977.

[16]黃禮彬,張曉莉,譚惠珍,等.兒童急性白血病耐藥相關microRNA的篩選[J].中山大學學報(醫學科學版),2012,33(5):592-596.

[17]李寧蔚,王紅靜,楊凌云,等.miR-130a對卵巢癌A2780細胞順鉑耐藥性的影響及其機制的研究[J].四川大學學報(醫學版),2013,44(6):865-870.

[18]王永濤,孫小亮,崔玉忠,等.microRNA-130a在非小細胞肺癌中的表達及其意義[J].腫瘤防治研究,2012,39(3):278-280.

[19]許國兵,彭高偉.甲磺酸伊馬替尼治療腹腔鏡切除術后胃腸道間質瘤效果及預后影響因子分析[J].中國醫藥,2015,10(5):667-671.

[20]湯建軍,李德鳳.胃癌中miR-130a的表達及其在上皮間充質轉化中的作用[J].腫瘤,2014,34(4):337-343.

Role of microRNA-130a in drug resistance of chronic myeloid leukemia

SU Mei-fang

(Huanggang Central Hospital,Huanggang 430000,China)

Objective To compare the expression of microRNA-130a in imatinib-resistant K562R cells and imatinib-sensitive K562 cells,and to investigate the relationship between microRNA-130a and drug resistance of chronic myeloid leukemia (CML).Methods The expression of microRNA-130a in imatinib-resistant K562R cells and imatinib-sensitive K562 cells was detected by real-time RT PCR.MicroRNA-130a mimic was transferred into K562 cells by electro-transfection.K562/mimic and the control cells were treated with imatinib,then the cell proliferation was recorded and apoptosis was detected by flow cytometry with AnnexinV/ PI staining.MTT method was used to detect the proliferation ability of K562/mimic and the control cells treated with imatinib.Results The expression level of microRNA-130a in imatinib-resistant K562R cells was higher than that of imatinib-sensitive K562 cells.The proliferation inhibition rate to imatinib and the apoptosis rate of K562/mimic were lower than those of control cells,and the IC50was 0.13 μmol/L and 3.19 μmol/L respectively.Conclusion MicroRNA-130a is highly expressed in imatinib-resistant K562R cells,and up-regulating the expression of microRNA-130a can decrease the sensitivity of imatinib to CML.

Chronic myeloid leukemia;MicroRNA-130a;Imatinib;Drug resistance

2016-12-22

黃岡市中心醫院，武漢 黃岡 430000

10.14053/j.cnki.ppcr.201708005