正交試驗(yàn)優(yōu)化冬凌草冷浸提取工藝

荊 綺，倪慧艷，王 娟，徐 虹，易承學(xué)*

正交試驗(yàn)優(yōu)化冬凌草冷浸提取工藝

荊 綺1，倪慧艷2，王 娟1，徐 虹3，易承學(xué)3*

目的 探討冷浸法提取冬凌草的最佳工藝條件。方法 采用高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定冬凌草甲素的含量，考察不同濃度乙醇對(duì)冬凌草甲素提取率的影響。在此基礎(chǔ)上，選取乙醇用量、冷浸時(shí)間、提取次數(shù)和藥材規(guī)格4個(gè)因素進(jìn)行正交設(shè)計(jì)優(yōu)化。結(jié)果 乙醇用量、冷浸時(shí)間、提取次數(shù)和藥材規(guī)格對(duì)冬凌草甲素的提取效果均有顯著影響，最佳提取工藝：冬凌草粉碎成細(xì)粉，加入15倍量體積分?jǐn)?shù)95%乙醇，冷浸提取2次，每次4 d。結(jié)論 此工藝條件簡(jiǎn)單易行，適用于冷浸法提取冬凌草。

冬凌草；冬凌草甲素；冷浸提取法；正交試驗(yàn)

0 引言

冬凌草為唇形科香茶菜屬植物碎米椏Rabdosiarubescens(Hemsl.) Hara的干燥地上部分，多年生草本植物，資源豐富，具有清熱解毒、消炎止痛、健胃活血及抗腫瘤之功效[1]。其所含二萜類成分-冬凌草甲素(Oridonin)具有很強(qiáng)的抗癌活性，對(duì)肺癌、胃癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌等多種腫瘤細(xì)胞呈抑制作用[2-6]，還具有抗炎作用，對(duì)蛋清誘導(dǎo)的大鼠足跖腫脹有明顯的抑制作用[7]。冬凌草的提取方法有乙醇回流法[8]、超聲波提取法[9]、超臨界CO2萃取法[10]和滲漉法[11]。冬凌草甲素對(duì)熱敏感，長(zhǎng)時(shí)間受熱易遭破壞，因而更適合于冷法提取。相比其他方法，冷浸提取法不需要昂貴的儀器設(shè)備，工藝簡(jiǎn)單，易操作且成本低，特別適于大規(guī)模工業(yè)化操作。本實(shí)驗(yàn)在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以高效液相色譜法測(cè)定提取物中冬凌草甲素的含量為指標(biāo)，優(yōu)選出冷浸法提取冬凌草的最佳條件，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

Agilent 1260 Infinity高效液相色譜儀，包括G1311C 四元泵、G1315D 紫外檢測(cè)器、G1316A 柱溫箱、G1329B 自動(dòng)進(jìn)樣器(美國(guó)安捷倫公司)；XP 205電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；Milli-Q Integral超純水機(jī)(美國(guó)密理博公司)；R-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士步琪公司)；DJ-10A粉碎機(jī)(上海淀久中藥機(jī)械制造有限公司)。

冬凌草2015年購(gòu)自安徽省方氏中藥飲片有限公司(經(jīng)江蘇大學(xué)藥學(xué)院童珊珊副教授鑒定為唇形科香茶菜屬植物碎米椏的干燥地上部分)，冬凌草甲素對(duì)照品(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，純度≥98.0%，批號(hào)：E1526003)，甲醇(色譜純，德國(guó)默克化工)，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Zorbax Eclipse plus C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相：甲醇-水(體積比為60∶40)，流速：1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)：239 nm，柱溫：30 ℃，進(jìn)樣體積：10 μL。在上述色譜條件下，冬凌草甲素的保留時(shí)間為6.78 min，典型色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 取冬凌草甲素7.02 mg，精密稱定，置容量瓶中用甲醇溶解后定容至刻度，制成1.404 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。逐步用甲醇稀釋成16.86、28.08、56.16、112.32、168.48、224.64 μg/mL的系列對(duì)照品溶液。按“2.1”項(xiàng)色譜條件，取上述對(duì)照品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，測(cè)定冬凌草甲素色譜峰的面積。以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)、對(duì)照品質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸分析，求得回歸方程為Y=6.211 X-10.04，r=0.999 6，線性范圍為16.86～224.64 μg/mL。

2.3 乙醇濃度考察 取9份冬凌草粉末(過(guò)3號(hào)篩)，每份約0.3 g，精密稱定后置100 mL具塞錐形瓶中，每3份分成1組，分別精密加入20 mL體積分?jǐn)?shù)為75%、85%、95%的乙醇，密塞，室溫下浸泡24 h，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，精密吸取10 μL注入高效液相色譜儀測(cè)定。計(jì)算出藥材中冬凌草甲素含量：ρ=m1(g)/m2(g)×100%(ρ：冬凌草甲素含量，m1：冬凌草甲素重量，m2：藥材重量)。表1顯示，95%乙醇提取冬凌草甲素的平均含量分別是85%乙醇和75%乙醇的1.15倍和1.29倍，故本實(shí)驗(yàn)選擇95%乙醇作為提取溶劑。

2.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)提取工藝 冬凌草飲片除去雜質(zhì)后的0.5～2 cm干燥小段。冬凌草粗粉：冬凌草用高速粉碎機(jī)粉碎，全部通過(guò)2號(hào)篩，能通過(guò)4號(hào)篩的粉末占30%。冬凌草細(xì)粉：全部通過(guò)5號(hào)篩，能通過(guò)6號(hào)篩的粉末占98%。選用體積分?jǐn)?shù)95%乙醇作為溶劑，3種規(guī)格的冬凌草藥材均為1 g(精確到0.000 1 g)，共27份，每3份為1組，按正交條件進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)束后冷浸液濾過(guò)，再用5 mL新鮮溶劑洗滌濾紙及漏斗，合并濾液后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸發(fā)至近干，用甲醇溶解殘?jiān)浦?0 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，過(guò)濾后精密吸取10 μL注入高效液相色譜儀測(cè)定。因素與水平見表2。

表1 采用不同乙醇濃度冷浸時(shí)冬凌草甲素含量(%)

表2 因素與水平表

2.5 正交試驗(yàn)結(jié)果與方差分析 表3試驗(yàn)結(jié)果表明,根據(jù)R值的大小，各因素對(duì)冬凌草提取效果的影響程度從大到小依次為D>A>B>C，即藥材規(guī)格是最主要因素，其次是溶劑用量和冷浸時(shí)間，而提取次數(shù)為最次要因素。根據(jù)極差分析中各水平的冬凌草甲素含量大小，直觀分析出較優(yōu)工藝組合應(yīng)為A3B2C2D3。

將正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析。表4結(jié)果顯示，A(乙醇用量)、B(冷浸時(shí)間)、C(提取次數(shù)) 和D(藥材規(guī)格)對(duì)冬凌草甲素的提取均有顯著性影響。通過(guò)考察各因素均數(shù)間的多重比較結(jié)果，發(fā)現(xiàn)A因素的2水平和3水平之間并無(wú)顯著性差異(P>0.05)，但2水平具有節(jié)約成本和縮短濃縮時(shí)間的優(yōu)勢(shì)，因而確定提取工藝為A2B2C2D3，即冬凌草粉碎成細(xì)粉規(guī)格，加入15倍量體積分?jǐn)?shù)95%乙醇，提取2次，每次4 d。

表3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果(n=3)

表4 方差分析結(jié)果

注：F0.05(2，18)=3.55，F(xiàn)0.01(2，18)=6.01

2.6 工藝驗(yàn)證試驗(yàn) 取冬凌草細(xì)粉3份，每份100 g，按上述最佳冷浸條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，即藥材粉碎至細(xì)粉，用15倍量體積分?jǐn)?shù)95%乙醇冷浸提取2次，每次4 d，分別測(cè)定冬凌草甲素提取量，驗(yàn)證結(jié)果見表5。3次結(jié)果都處于較高水平，說(shuō)明該提取工藝是穩(wěn)定可行的。

表5 工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果(n=3)

2.7 方法學(xué)考察

2.7.1 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取濃度為112.32 μg/mL的對(duì)照品溶液10 μL，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果冬凌草甲素峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.26%，說(shuō)明儀器性能良好。

2.7.2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批冬凌草藥材細(xì)粉6份，每份1 g，精密稱定，按上述最佳冷浸條件操作，其余步驟按“2.4”項(xiàng)所示步驟制成供試品溶液，RSD=2.85%，說(shuō)明該方法重復(fù)性良好。

2.7.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一份冬凌草供試品溶液，25 ℃下放置，分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定，冬凌草甲素峰面積的RSD=0.52%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7.4 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn) 取冬凌草藥材細(xì)粉0.5 g，精密稱定后置100 mL具塞錐形瓶中，精密加入30 mL體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇，密塞，室溫下浸泡24 h，測(cè)得浸出液中冬凌草甲素含量為76.67 μg/mL。準(zhǔn)確吸取該浸出液1.0 mL，共9份，均分3組，每組為同一個(gè)濃度，置5 mL容量瓶中，三組分別加入冬凌草甲素對(duì)照品77.22、193.05、386.1 μg，相當(dāng)于供試液中冬凌草甲素含量的1、2.5、5倍，甲醇定容后混勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液10 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率，低、中、高3種質(zhì)量濃度的平均加標(biāo)回收率分別為103.07%、101.32%、99.74%，RSD分別為1.27%、0.67%、0.83%(n=3)，表明該測(cè)定方法的加標(biāo)回收率較好，符合含量測(cè)定的要求。

3 討論

為了確定冬凌草冷浸提取法的最佳提取條件，本文選取乙醇用量、冷浸時(shí)間、提取次數(shù)和藥材規(guī)格4個(gè)因素進(jìn)行考察。結(jié)果顯示，藥材規(guī)格因素對(duì)冬凌草提取效果的影響程度最大，即為最主要因素。藥材中的有效成分一般需要經(jīng)過(guò)浸潤(rùn)、溶脹、滲透和擴(kuò)散等階段才能溶出，大量研究表明，該過(guò)程不但跟溶劑種類、溶劑用量、提取時(shí)間等因素相關(guān)，藥材的粒度亦是重要影響因素[12]。藥材粉碎成細(xì)粉規(guī)格后，粒度明顯減少，大大增加了比表面積，有利于有效成分浸出，因而有助于縮短提取時(shí)間及提高提取率。

藥材規(guī)格對(duì)冬凌草的提取起主要作用，是影響提取效果的最重要因素；其次是溶劑用量，冷浸時(shí)間和提取次數(shù)影響最小。冬凌草甲素不穩(wěn)定，其含量受溫度影響變化很大，受熱過(guò)程越長(zhǎng)，含量隨之降低越多[13]。應(yīng)綜合考慮正交試驗(yàn)的極差分析和方差分析結(jié)果，選擇適宜的溶劑因素水平，以減少乙醇用量，達(dá)到縮短有效成分受熱時(shí)間和節(jié)

能降耗的兩重目標(biāo)。

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Optimization of cold-soaked extraction process forRabdosiarubescensby orthogonal test

JING Qi1,NI Hui-yan2,WANG Juan1,XU Hong3,YI Cheng-xue3*

(1.Zhenjiang Fifth People′s Hospital,Zhenjiang 212001,China;2.Zhenjiang Fourth People′s Hospital,Zhenjiang 212001,China;3.Zhenjiang Center for Disease Control and Prevention,Zhenjiang 212004,China)

Objective To develop an optimum process condition for cold-soaked extraction ofRabdosiarubescens.Methods The content of oridonin was determined by HPLC.The effect of different concentrations of ethanol on the extraction of oridonin fromR.rubescenswas observed.The solvent dosage,extraction time,extraction times and herbs specifications were optimized by using orthogonal test.Results Four kinds of the above factors have conspicuous effect on the content of oridonin.The optimum process conditions ofR.rubescensextraction were determined as follows:fine powder of herbs specifications,15 times of solvent dosage of 95% ethanol,extraction for 2 times,extraction for 4 d each time.Conclusion The established extraction process conditions are simple and practicable.

Rabdosiarubescens;Oridonin;Cold-soak extraction process;Orthogonal test

2017-02-04

1.鎮(zhèn)江市第五人民醫(yī)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212001；2.鎮(zhèn)江市第四人民醫(yī)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212001；3.鎮(zhèn)江市疾病預(yù)防控制中心，江蘇 鎮(zhèn)江 212004

鎮(zhèn)江市衛(wèi)生科技重點(diǎn)專項(xiàng)項(xiàng)目(SHW2016015)；江蘇省“科教強(qiáng)衛(wèi)工程”專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)資助(QNRC2016461)

10.14053/j.cnki.ppcr.201708019

*通信作者