一株植物內生菌的化感作用測定

2017-09-06 10:17:09郁天臣張延浩何中瓊

現代農業科技 2017年14期

郁天臣　張延浩　何中瓊

摘要采用培養皿培育法，檢測加拿大一枝黃花內生黑曲霉CHH-S1發酵菌液對4種作物種子萌發及幼苗生長的影響。結果表明，內生黑曲霉的發酵液能降低油菜、油麥菜和芝麻種子的發芽率，不同濃度的菌液可顯著抑制4種受體植物籽苗的鮮重、根長和可溶性蛋白含量的增長，并表現出一定的濃度依賴性。油麥菜和芝麻籽苗內可溶性多糖含量受菌液刺激而增高，莧菜和油菜幼苗中的多糖含量則受到明顯抑制作用。以上結果表明，加拿大一枝黃花的內生菌具有良好的化感作用。

關鍵詞植物內生菌；黑曲霉；化感作用；幼苗；發芽率

中圖分類號 Q948.12 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2017）14-0092-03

Abstract The effects of the fermentation broth of Aspergillus niger CHH-S1，an endophytic fungus isolated from the Solidago canadensis L.，on the seed germination and seedling growth of four crops were studied by petri dish culture method.The results showed that the broth of endophytic Aspergillus niger could reduce the germination rate of rape，lettuce and sesame seeds，and different concentrations of the broth could decrease the fresh weight，root length and the content of soluble protein in four kinds of receptor plants seedlings.The effects were stronger with the broth concentration increased.The content of polysaccharide in the lettuce and sesame seedling were increased by dealing with the broth，and the contents in the leaf lettuce and rape seedlings were just inverse.These results showed that the endophytic fungus CHH-S1 of Solidago canadensis L. had allelopathic effect on other plants.

Key words endophytic fungus；Aspergillus niger；allelopathy；seedling；germination rate

化感作用是外來植物成功入侵，并造成本土生物多樣性破壞的重要機理之一[1]。加拿大一枝黃花作為一種典型入侵物種，其不同組織的水或醇提取物對小麥、玉米等多種本地植物均表現出明顯的化感抑制作用[2-5]，在我國已成為非常嚴重的“生態殺手”。

化感作用不僅存在于植物之間，已有研究表明，植物根際及正常組織中的微生物通過產生特定的代謝產物，也可以影響周邊植物或微生物的生長[6-8]。對禾草、紫莖澤蘭等植物的研究表明，植物內生真菌可以提高宿主植物抗逆境能力，促進宿主種子發芽和幼苗存活，從而增強宿主植物對周邊植物的競爭力，提高植物的入侵能力[9-10]。從核桃、胡桃、水稻及黑麥等植物中分離的內生菌，其發酵液同樣表現出對小麥、稗草、豆科植物等供試植物生長（芽或根）或病原菌生長的抑制作用[11-15]。但尚未見對加拿大一枝花內生菌作用的研究，本試驗通過對加拿大一枝黃花內生菌化感作用的研究，希望為進一步了解該植物的入侵機制和開發新型生物農藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗儀器及試劑

試驗試劑均為分析純，購自國藥化學試劑有限公司。芝麻、油麥菜、莧菜和油菜種子購自鎮江七里甸農貿市場。試驗儀器包括SW-CJ-IF超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）、DHZ-052D恒溫震蕩搖床（上海博彩生物科技有限公司）、TGL-16G離心機（上海安亭科學儀器廠）、N-1100V旋轉蒸發儀（東京理化）和SPX-250B-D光照培養箱（上海予騰生物科技有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 內生菌株的發酵。內生菌株CHH-S1為分離自加拿大一枝黃花莖組織的一株黑曲霉。采用PDA平板進行菌株活化，25 ℃恒溫培養3～5 d。接入ME液體培養基中發酵，取100 mL置于250 mL錐形瓶，在28 ℃條件下120 r/min發酵14 d，過濾得到菌液和菌體。對菌液進行重復過濾，保存備用。

1.2.2 種子發芽試驗。用2%次氯酸鈉浸泡莧菜、油麥菜、油菜和芝麻種子10 min，蒸餾水沖洗3遍，浸泡5 h后備用。在無菌的9 cm 培養皿中放入雙層濾紙，以2 mL發酵液浸潤濾紙，將30粒健康種子均勻分布在濾紙上。以蒸餾水處理作為對照，每種種子做3個平行試驗，測定其發芽率。培養條件設定為溫度（24±1）℃、光照周期12 h/12 h，連續培養6 d。記錄每天種子發芽數（以芽長2 mm以上為發芽），按以下公式進行發芽指標測定：

發芽率（%）=（發芽的種子數/供檢測的種子數）×100；

發芽指數（GI）=∑（Gt/Dt）；

抑制率（%）=（對照組數據-處理組數據）/對照數據×100。

式中，Dt—發芽天數，Gt—與發芽天數相對應的當日發芽數目。endprint

1.2.3 菌株化感作用測定。將4種植物種子于20 ℃條件下水浸潤催芽，12 h后選取發芽狀態一致的種子各30粒，以分別稀釋1倍（1/2 S1）、4倍（1/4 S1）和8倍（1/8 S1）的發酵液和無菌水分別處理4 d，觀測芽長、根長、根重以及芽重的差異。培養結束后每個培養皿選取10株發芽幼苗，測定各株的根長、芽長、株重和干重，取各組平均值進行比較。幼芽中多糖含量采用硫酸蒽酮比色法測定，可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍法測定[16]。

1.3 數據分析

統計3組觀測值數據，并采用SPSS 18.0 統計軟件進行單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 菌株發酵液對4種植物種子發芽的影響

CHH-S1發酵液處理4種植物種子6 d后，芝麻、油菜和油麥菜種子的相對發芽率分別為28.6%、51.2%和26.0%，明顯低于對照組，而莧菜種子的相對發芽率則略高于對照組。相對發芽指數略高于相對發芽率，但與后者有相似的變化特點，除莧菜種子外，其他3種作物種子的萌發均受到CHH-S1菌株發酵液的抑制（圖1）。

2.2 菌株發酵液對植物幼苗生長的影響

以3種不同稀釋倍數的菌液（1/2 S1、1/4 S1和1/8 S1）分別處理作物預萌發種子，4種作物萌發幼苗的生長表現出明顯的濃度依賴性，菌液濃度越高，萌發種子生長受到的抑制作用越強，幼苗的長度和生物量均顯著低于以蒸餾水處理的對照組（圖2、3、4）。

1/2 S1及1/4 S1的發酵液處理組的種子幾乎不見明顯生長。1/8 S1處理后的芝麻、莧菜和油麥菜的種子雖有生長，但幼芽末端變紅，根出現萎蔫；油菜的萌發幼苗則基本沒有生長（圖2）。數據分析表明，4個種子處理組的根長均與對照組根長有顯著差異（P<0.05），但油菜幼苗對發酵液濃度變化敏感，且具有明顯的濃度依賴性。油麥菜和芝麻幼苗在各稀釋濃度處理組間的根長則無明顯差異（圖3）。莧菜種子試驗組中，中低濃度（1/4 S1和1/8 S1）與高濃度組間差異顯著（P<0.05）。4種植物幼苗經不同濃度發酵液處理后，其鮮重與對照組均存在顯著差異，但均未表現出濃度依賴性（圖4）。

2.3 菌株CHH-S1對幼苗生理生化指標的影響

種子萌發后，通過營養物質的轉化以提供幼苗生長所需。因此，其中的營養物質組成會發生一定變化。采集培育6 d后的植物幼苗，按照文獻[16]方法進行組織中可溶性多糖和蛋白含量的測定。由圖5可知，菌株的各濃度菌液可以促進油麥菜和芝麻幼苗中多糖含量增加，減少莧菜和油菜幼苗組織中可溶性多糖物質的含量。油麥菜種子試驗組中，籽苗中的多糖含量排列如下：1/8 S1（13.34 mg/g）>1/2 S1（13.01 mg/g）>1/4 S1（5.39 mg/g）>CK（2.72 mg/g）。芝麻種子試驗組中，組內兩兩之間均存在顯著差異，且1/2 S1>1/8 S1>1/4 S1，種子受菌液促進效果最強（1/2 S1）時，籽苗中多糖含量為對照組的924.78%。莧菜和油麥菜種子試驗組的中低濃度組（1/8 S1和1/4 S1）組間的多糖含量無顯著差異；高濃度處理組中，莧菜中多糖含量較對照組減少96.04%，油菜組則減少92.12%，表現出明顯的抑制性。

由圖6可知，油麥菜種子試驗組中，隨著發酵液濃度的升高，蛋白含量受抑制效果不斷加強；1/2 S1濃度時，受抑制效果最強，抑制率為71.14%。油菜和莧菜種子試驗組中，1/4 S1濃度時，蛋白含量最低，抑制率分別是61.32%和89.72%。而芝麻種子試驗組，濃度為1/8時，蛋白含量最低，抑制率為73.60%。

3 討論

植物可以通過化感作用影響周邊其他植物的生長，而存活于植物組織內部的內生菌可以通過提高宿主的抗病力、增強其對不良生態因子的耐受性等作用直接或間接促進宿主植物的競爭力，并在抑制其他植物種子萌發及幼苗生長中發揮作用。楊晨從紫莖澤蘭的健康組織中分離得到多株內生菌，其中某些優勢內共生真菌能促進紫莖澤蘭種子的發芽和幼苗的存活，從而促進宿主植物更快地建立起種群[11]。王靜等發現紫莖澤蘭的部分內生真菌表現出良好的除草活性，可以抑制高粱、小麥、黃瓜、油菜等作物根系的生長[12]。本試驗從加拿大一枝黃花組織中得到一株內生黑曲霉CHH-S1，其發酵液對芝麻、油菜、莧菜和油麥菜4種作物種子發芽表現出一定的抑制作用，以上結果均表明入侵植物的內生菌對宿主外受體植物具有化感作用。攜帶內生菌的宿主植物可以表現出更強的化感作用，楊松等發現披堿草內生真菌對黑麥草、高羊茅和草地早熟禾3種草坪種子的萌發具有一定的抑制作用[17]，黃璽等發現帶菌醉馬草浸提液對針茅和硬質早熟禾的種子萌發和幼苗生長有抑制作用，并且隨著質量濃度的增加抑制作用增強[18]。內生菌的發酵產物也具有一定的化感作用。黃湘海發現黑核桃內菌生真HJI的發酵產物對3 種受體種子（小麥、油菜、蘿卜）生長具有一定的抑制作用。王靜等發現側柏內生真菌鏈格孢菌（Alternaria alternaria）對反枝莧種子幼根的生長表現出較強的抑制作用，其中有8株的抑制率在70%以上。來源于強化感水稻的內生菌塔賓曲霉、粘紅酵母發酵產物均可顯著抑制稗草的生長[15]。因此，植物內生菌可作為潛在生物除草劑的來源。

加拿大一枝花內生黑曲霉CHH-S1菌株的發酵液能明顯抑制4個種子籽苗的鮮重、根長和蛋白含量，4種受體種子籽苗的鮮重對發酵液的濃度變化不敏感，處理組間無顯著差異（P>0.05）。菌液對籽苗根伸長的抑制效果隨著濃度的降低而減弱，且4個種子處理組均與對照組間有顯著差異（P<0.05）。不同濃度的菌液對4個種子籽苗內的蛋白含量具有顯著抑制性，且不同處理組間存在顯著差異性（P<0.05）。其中，芝麻種子對菌液的敏感性最強。對于多糖含量來說，油麥菜和芝麻幼苗中的多糖物質受菌液刺激而含量增加，但莧菜和油菜幼苗中的多糖物質含量則受到明顯抑制作用。對于內生菌產物中具體的作用物質還需要進一步試驗進行分離和檢驗。endprint

4 參考文獻

[1] FABBRO C D，G？譈SEWELL S，PRATI D.Allelopathic effects of three pl-ant invaders on germination of native species：a field study[J].Biol Invas-ions，2014，16：1035-1042.

[2] 楊如意，昝樹婷，唐建軍，等.加拿大一枝黃花的入侵機理研究進展[J].生態學報，2011（4）：1185-1196.

[3] 董梅，陸建忠，張文駒，等.加拿大一枝黃花：一種正在迅速擴張的外來入侵植物[J].植物分類學報，2006（1）：72-85.

[4] 陳彤，劉文莉，張崇邦，等.加拿大一枝黃花入侵對本土植物群落動態的影響及其機制[J].植物生態學報，2012（3）：253-261.

[5] 吳德峰.加拿大一枝黃花的危害性及其利用研究[J].家畜生態學報，2012（4）：116-120.

[6] 王從彥，向繼剛，杜道林.2種入侵植物對根際土壤微生物種群及代謝的影響[J].生態環境學報，2012（7）：1247-1251.

[7] 石晶盈，陳維信，劉愛媛.植物內生菌及其防治植物病害的研究進展[J].生態學報，2006（7）：2395-2401.

[8] 王志偉，紀燕玲，陳永敢.植物內生菌研究及其科學意義[J].微生物學通報，2015（2）：349-363.

[9] 彭清青，李春杰，宋梅玲，等.不同酸堿條件下內生真菌對三種禾草種子萌發的影響[J].草業學報，2011，20（5）：72-78

[10] 何彩梅，趙春安，李海燕.植物內生真菌化感作用的研究現狀[J].生物學雜志，2010，27（4）：83-84.

[11] 楊晨.紫莖澤蘭葉內生菌對入侵地植物群落的影響[D].昆明：云南大學，2010.

[12] 王靜，羅國玖，蒙遠濤，等.紫莖澤蘭內生菌的分離及其代謝物的除草活性[J].江蘇農業科學，2013，41（5）：99-101.

[13] 黃湘海.黑核桃內菌生真HJI發酵產物化感作用的研究[D].楊凌：西北農林科技大學，2010.