哈茨木霉菌對灰葡萄孢菌生長的抑制及培養基優化研究

牛東東　馮振群　翟清云

摘要 哈茨木霉菌是一種重要的生防菌，灰葡萄孢菌是番茄灰霉病的病原菌，通過對峙試驗研究哈芡木霉菌對灰葡萄孢菌的抑制作用。結果表明，該哈茨木霉菌在室內能夠很好地抑制灰葡萄孢菌的生長。哈茨木霉菌的培養采用固液雙相培養的方法，用正交試驗優化法分別對液體培養基和固體培養基進行優化。結果表明，該哈茨木霉菌在優化好的固液雙相培養基上能產生5.6×109個孢子。

關鍵詞 哈茨木霉菌；灰葡萄孢菌；抑制作用；培養基優化

中圖分類號 Q93-335 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2017）14-0098-01

Abstract Trichoderma harzianum is a kind of important biocontrol fungus.Botrytis cinerea Pers is the pathogen of tomato grey mould.The results of dual culture showed that the T.harzianum could restrain the growth of Botrytis cinerea Pers.Cultivation of T.harzianum adopted the solid-liquid two-phase method，used orthogonal test of the liquid medium and solid medium to optimize.The results showed that the T.harzianum could produce 5.6×109 spores in the mediums.

Key words Trichoderma harzianum；Botrytis cinerea Pers；inhibitory action；medium optimization

番茄灰霉病是危害番茄的主要病害之一，該致病菌為灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea Pers），能夠侵染番茄葉片、莖和青果等植株地上部分，發病嚴重時會造成大量爛花、爛果，直接影響產量。木霉菌作為一類重要的生防真菌，廣泛存在于土壤、空氣和植物體表面等生態環境中，具有適應性強、存在范圍廣和廣譜、高效等優點[1]。哈茨木霉菌（Trichoderma harzianum）是木霉菌中應用最早、最廣的一個菌種，可以用于預防由腐霉菌、立枯絲核菌、鐮刀菌、灰葡萄孢菌、黑根霉和柱孢霉等病原菌引起的植物病害[2-3]。

哈茨木霉孢子耐受性強，易于加工成制劑，是一類重要的生防真菌，其真菌孢子培養主要采用固體發酵。固體發酵雖然操作簡單，但易受雜菌污染，產生孢子低，發酵時間長，經濟效率低。目前，主要采用先用液體發酵產生菌絲，再將菌液接種到固體培養基上培養產生孢子的固液雙相發酵培養模式。正交試驗優化法是優化培養基常用的方法。因此，采用正交試驗優化法對哈茨木霉的培養進行初步優化，為其在生防中的應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器

供試菌種為哈茨木霉菌、番茄灰葡萄孢菌，由河南省生物農藥工程研究中心分離獲得；試驗儀器有恒溫培養箱、恒溫搖床、冰箱；試劑有葡萄糖、酵母粉、瓊脂粉、NaCl、NaOH、HCl；培養基為PDA培養基、營養肉湯培養基。

1.2 試驗方法

1.2.1 哈茨木霉菌對番茄灰葡萄孢菌的抑制作用。平板對峙培養是研究生防菌效價最常用的方法之一，該方法操作簡單，能直接觀察抑制效果，因而本試驗采用平板對峙培養測定哈茨木霉菌對番茄灰葡萄孢菌的抑制效果[4]。具體操作如下：在PDA培養基中心位置接種直徑為6 mm的番茄灰葡萄孢菌菌餅，距離平板中心兩側2 cm處，分別接種一塊直徑為6 mm的哈茨木霉菌菌餅，以只接種番茄灰葡萄孢菌菌餅為對照，28 ℃恒溫培養6～9 d后，與對照對比，觀察記載哈茨木霉菌對番茄灰葡萄孢菌的抑制情況，每組處理3次重復。

1.2.2 哈茨木霉菌培養基優化。

（1）液體培養基優化。取制好的哈茨木霉菌孢子種子液（濃度為108 cfu/mL），按1%接種量分別接種于不同處理的液體培養基中，采用4因素3水平正交試驗對培養基進行優化，正交試驗的因素與水平設計見表1。培養條件為25 ℃，搖床200 r/min振蕩培養7 d，7 d后過濾菌絲，80 ℃烘干并稱量菌絲干重[5-6]。每個處理3次重復。

（2）固體培養基優化。取培養7 d的哈茨木霉菌菌絲懸浮液種子液（菌絲干重約為0.002 g/mL）按20%接種量分別接種于不同處理的固體蛭石培養基中，采用4因素3水平正交試驗對培養基進行優化，正交試驗的因素與水平設計見表2。培養條件為25 ℃，培養5 d，5 d后采用血球計數板法計算孢子數目。

2 結果與分析

2.1 哈茨木霉菌對番茄灰葡萄孢菌的抑制作用

由圖1可知，茨木霉菌在室內對番茄灰葡萄孢菌有很好的抑制效果。哈茨木霉菌在PDA培養基上長勢迅速，第3天哈茨木霉菌就表現出對番茄灰葡萄孢菌的抑制作用。對（下轉第102頁）

峙試驗第5天時，可以明顯看出哈茨木霉菌繼續生長，占據整個培養皿，番茄灰葡萄孢菌菌絲出現濃縮、消解等現象。在顯微鏡觀察下，哈茨木霉菌菌絲入侵番茄灰葡萄孢菌菌落，番茄灰霉菌絲出現斷裂。隨著培養時間的延長，最終番茄灰霉病菌完全被抑制，直至死亡消失。

2.2 哈茨木霉菌的培養基優化

2.2.1 液體培養基優化。將哈茨木霉菌孢子接種到表1中配方水平的培養基，培養7 d后，稱量菌絲干重，結果見表3。可以看出，該哈茨木霉菌液體培養基最優組合為葡萄糖1.5%、（NH4）2SO4 0.25%、酵母粉4%、花生餅粉4%。endprint

2.2.2 固體培養基優化。將哈茨木霉菌菌絲接種到表2的固體培養基，培養7 d后，通過血球計數板計數，結果見表4。可以看出，該哈茨木霉菌液體培養基最優組合為葡萄糖1.5%、酵母粉2%、花生餅粉4%、麥麩6%。

3 結論與討論

哈茨木霉菌是一種重要的生防菌，能夠抑制多種植物病原菌生長。平板對峙試驗表明，哈茨木霉菌能夠很好地抑制番茄灰霉病菌生長[7]。以往研究多側重于哈茨木霉菌菌絲的生長，但菌絲不易于保存及應用，加工成制劑困難。國外已有商品化的哈茨木霉菌成品，多數是孢子制劑。本試驗哈茨木霉菌在優化的固液雙向培養基上能產生5.6×109個孢子，方便加工成制劑及運輸。

本試驗僅限于室內平板培養，對于該哈茨木霉菌在大田生產上是否具有良好的防效有待于進一步研究。哈茨木霉菌的孢子具有抗性強、耐儲存、方便運輸等特點，液體發酵生產出較多菌絲，固體發酵易受雜菌的污染，產生孢子低，發酵時間長，因而采用固液雙相發酵的方法是一種不錯的選擇。正交優化初步對哈茨木霉菌培養基進行優化，哈茨木霉菌產生孢子受光照、溫度等很多條件的影響，下一步需要通過正交優化或者響應面法進一步深度優化[8]。

4 參考文獻

[1] 唐琳，趙輝.哈茨木霉菌T6對茄子幼苗根部防御酶系的研究[J].廣東農業科學，2011（14）：79-81.

[2] 陳方新，齊永霞.哈茨木霉對幾種植物病原真菌的拮抗作用及其抗藥性測定[J].中國農學通報，2005（11）：314-317.

[3] 傅俊范，魏曉兵，周如軍，等.哈茨木霉菌Tri41對人參銹腐病菌的抑制作用[J].吉林農業大學學報，2015（1）：52-56.

[4] 李梅云，譚麗華，方敦煌，等.哈茨木霉的培養及其對煙草疫霉生長的抑制研究[J].微生物學通報，2006（6）：79-83.

[5] 李櫟，何月秋，蘇春麗.不同條件對哈茨木霉菌株Th-B菌絲生長的影響[J].云南農業大學學報，2004（6）：677-680.

[6] 張愛華，白石，周國興，等.哈茨木霉發酵條件的初步研究[J].安徽農業科學，2008（3）：9821-9822.

[7] 岳憲化，胡夫防，段麗峰，等.哈茨木霉菌防治葡萄霜霉病試驗[J].中國果樹，2014（2）：54-56.

[8] 王慧中，趙培潔，陳衛輝，等.哈茨木霉淺層液體培養適宜條件的研究[J].浙江農業學報，1995（1）：61-62.endprint