黔產喜樹葉的HPLC指紋圖譜研究及聚類分析Δ

劉志海，范紅梅，鄒 蘭，隆 林，金 昭，余 蘭（貴州省黔西南州食品藥品檢驗檢測中心，貴州興義562400）

黔產喜樹葉的HPLC指紋圖譜研究及聚類分析Δ

劉志海＊，范紅梅，鄒 蘭，隆 林，金 昭，余 蘭（貴州省黔西南州食品藥品檢驗檢測中心，貴州興義562400）

目的：建立黔產喜樹葉的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜。方法：采用HPLC法。色譜柱為Gemini-NX C18，流動相為乙腈-0.2%磷酸溶液（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，檢測波長為370 nm，柱溫為30℃，進樣量為10 μL。以山柰素為參照物，測定14批喜樹葉藥材的HPLC圖譜，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》（2004 A）進行共有峰指認、相似度評價，并進行聚類分析。結果：14批喜樹葉藥材的HPLC圖譜共有10個共有峰，13批喜樹葉藥材與對照圖譜的相似度＞0.90，1批與對照圖譜相似度＜0.90。喜樹葉藥材樣品可歸為3大類。結論：該研究所建指紋圖譜可為黔產喜樹葉的鑒別和質量評價提供參考。

喜樹葉；指紋圖譜；聚類分析；高效液相色譜法

喜樹葉為藍果樹科喜樹屬植物喜樹Camptotheca acuminata Decne的葉，喜樹是我國特有樹種，主要分布在長江流域及西南各省[1]，多選其果實、根、根皮、樹皮、葉入藥。喜樹葉具有清熱解毒、祛風止癢之功效，主治癰瘡癤腫、牛皮癬。據文獻研究報道，喜樹葉中含喜樹堿、10-羥基喜樹堿、槲皮素和山柰酚等有效成分[2]。喜樹在貴州各地分布較為廣泛，2003年版《貴州省中藥材、民族藥材質量標準》收載了喜樹果的質量標準，但未收載喜樹葉[3]。為全面提升我省中藥材、民族藥材質量標準，現開展對喜樹葉藥材質量標準研究工作。本研究參考文獻[4]，結合我省資源情況，收集了貴州8個地州市共計14批喜樹葉藥材樣本，對其進行指紋圖譜及聚類分析研究，以期為喜樹葉的質量控制提供依據。

1 材料

1.1 儀器

e2695型高效液相色譜（HPLC）儀，包括2998 DAD檢測器、Empower色譜數據工作站（美國Waters公司）；CPA225D型十萬分之一電子分析天平（北京賽多利斯儀器有限公司）；AY220型萬分之一電子分析天平（日本Shimadzu公司）；DK-98-Ⅱ型電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.2 試劑

槲皮素對照品（批號：100081-201509，純度：98.6%）、山柰素對照品（批號：110861-201310，純度：93.2%）均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

1.3 藥材

喜樹葉藥材樣品均采于貴州省，共14批（見表1），經貴州省食品藥品檢驗所李陽教授鑒定為真品。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Gemini-NX C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.2%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～20 min，22%A；20～40 min，22%→35%A；40～60 min，35%A）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：370 nm；柱溫：30℃；進樣量：10 μL。

表1 喜樹葉藥材來源Tab 1 Source of C.acuminate

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 精密稱取槲皮素對照品14.01 mg，加甲醇定容至100 mL，量取5 mL，置于25 mL量瓶中，制成槲皮素對照品溶液；精密稱取山柰素對照品適量，置于上述裝有槲皮素對照品溶液的25 mL量瓶中，搖勻，制成槲皮素、山柰素質量濃度分別為27.63、19.96 μg/mL的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 將藥材樣品置于干燥的室內自然風干，粉碎后過4號篩，備用。取藥材樣品粉末約0.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入5%鹽酸甲醇溶液50 mL，稱定質量，水浴回流1 h，取出，放冷；再次稱定質量，用5%鹽酸甲醇溶液補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，經0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度試驗 取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件連續進樣測定6次，以山柰素的保留時間和峰面積為參照，記錄各共有峰相對保留時間和相對峰面積。結果，10個共有峰相對保留時間的RSD＜0.3%，相對峰面積的RSD＜1.2%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.3.2 穩定性試驗 取“2.2.2”項下供試品溶液（No.5）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時進樣測定，以山柰素的保留時間和峰面積為參照，記錄各共有峰相對保留時間和相對峰面積。結果，10個共有峰相對保留時間的RSD＜0.4%，相對峰面積的RSD＜1.1%（n＝6），表明供試品溶液室溫放置24 h內基本穩定。

2.3.3 重復性試驗 精密稱取同一批樣品（No.5）適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，以山柰素的保留時間和峰面積為參照，記錄各共有峰相對保留時間和相對峰面積。結果，10個共有峰相對保留時間的RSD＜0.7%，相對峰面積的RSD＜0.6%（n＝6），表明本方法重復性良好。

2.4 HPLC指紋圖譜的生成與相關數據分析

2.4.1 HPLC指紋圖譜的生成 取14批藥材樣品各適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》（2004 A）對14批藥材樣品的HPLC圖譜進行分析，得HPLC指紋圖譜，詳見圖1、圖2。

圖1 14批藥材樣品HPLC疊加指紋圖譜Fig 1 HPLC superposed fingerprints of 14 batches of samples

圖2 藥材樣品HPLC對照指紋圖譜Fig 2 HPLC control fingerprint of samples

2.4.2 相似度與各共有峰相關數據分析 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》（2004 A）對14批藥材樣品的HPLC圖譜進行比較分析。14批藥材樣品相似度評價結果見表2；各共有峰的相對保留時間和相對峰面積見表3、表4。

2.5 聚類分析

采用SPSS 18.0統計軟件與歐氏距離分層聚類法中的Ward法對14批藥材樣品指紋圖譜共有峰相對峰面積進行聚類分析[4]，詳見圖3。結果，14批藥材樣品分為3大類，其中3、4、6、7、9、11、12、13批藥材樣品為一類，8、10批藥材樣品為一類，1、2、5、14批藥材樣品為一類，但1和2、5、14批藥材樣品歐氏距離稍大，也可以將1批藥材樣品再細分為一類。在指紋圖譜相似度評價中，1批藥材樣品與對照圖譜的相似度均＜0.90；其余13批藥材樣品與對照圖譜的相似度＞0.90。由此可知，聚類分析結果和相似度評價結果基本一致，兩種方法相互印證。

3 討論

3.1 樣品提取條件的優化

筆者以61%乙醇溶液超聲處理30 min制成供試品溶液，得到的色譜圖峰較少。后改以5%鹽酸甲醇溶液水浴回流1 h提取得到的色譜圖中色譜峰較多，且分離度均較好，因此本試驗以上述方法進行樣品提取。

3.2 色譜條件的優化

筆者參考文獻[5]，分別以甲醇-0.4%磷酸溶液（50∶50，V/V）和乙腈-0.3%磷酸溶液（24∶76，V/V）為流動相，進行等度洗脫。結果，色譜峰部分重疊，且特征峰少，經反復試驗，最終確定以乙腈-0.2%磷酸溶液作為流動相，進行梯度洗脫，藥材樣品所得特征峰多，且峰形較好。

表2 14批藥材樣品相似度評價結果Tab 2 Similarity evaluation of 14 batches of samples

表3 14批藥材樣品HPLC圖譜共有峰的相對保留時間Tab 3 The relative retention time for common peaks in HPLC fingerprints of 14 batches of samples

表4 14批藥材樣品HPLC圖譜共有峰的的相對峰面積Tab 4 The relative peak areas for common peaks in HPLC fingerprints of 14 batches of samples

3.3 測定波長的選擇

圖3 14批藥材樣品聚類分析樹狀圖Fig 3 The cluster analysis dendrogram for 14 batches of samples

試驗中，筆者應用二極管陣列檢測器對藥材樣品進行了全波段檢測，結果在370 nm波長處，相對吸收峰比較多，基本能反映出藥材樣品的整體效果，在線性梯度洗脫時，基線基本平穩，所以確定檢測波長為370 nm。

筆者通過建立喜樹葉藥材的指紋圖譜，采用相似度評價軟件對來自貴州不同產地的喜樹葉藥材進行比較分析，可知貴州不同產地14批喜樹葉藥材指紋圖譜總體差異較小，但可能由于喜樹葉采集的季節不同，使得個別樣品（No.1）的指紋圖譜與對照圖譜相似度較低，質量較為一般。本研究所建鑒別方法可為完善喜樹葉質量標準提供借鑒，進一步為喜樹葉藥材收入《貴州省中藥材、民族藥材質量標準》提供參考。

[1] 中國科學院中國植物志編輯委員會.中國植物志[M].北京：科學出版社，1983：144.

[2] 國家中醫藥管理局《中華本草》編輯委員會.中華本草：第5冊[M].上海：上海科學技術出版社，1999：733.

[3] 閻秀峰，王洋，于濤，等.喜樹葉中喜樹堿含量的高效液相色譜分析[J].分析測試學報，2002，21（2）：15-18.

[4] 黃瑋，周云慶，楊洪元，等.膽黃潤腸丸指紋圖譜的聚類分析[J].中國醫院藥學雜志，2016，36（9）：719-723.

[5] 秦慶芳，粟本超.廣西不同地區喜樹嫩葉中喜樹堿含量測定[J].醫藥導報，2015，34（3）：388-391.

Study on HPLC Fingerprint and Cluster Analysis of the Leaves of Camptotheca acuminate in Guizhou

LIU Zhihai，FAN Hongmei，ZOU Lan，LONG Lin，JIN Zhao，YU Lan（Guizhou Qianxinan Prefecture Center for Food and Drug Inspection，Guizhou Xingyi 562400，China）

OBJECTIVE：To establish HPLC fingerprint for the leaves of Camptotheca acuminante in Guizhou.METHODS：HPLC method was performed.The determination was performed on Gemini-NX C18column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.2%phosphoric acid（gradient elution）at the flow rate of 1.0 mL/min.The detection wavelength was set at 370 nm，and the column temperature maintained at 30℃.The sample size was 10 μL.Using sorbitol as a reference，HPLC fingerprints of 14 batches of the leaves of C.acuminante were determined.The chromatographic fingerprint was analyzed with Similarity Evaluation System for Chromatographic Fingerprint of TCM（2004 A）in terms of common peak indentification，similarity evaluation and cluster analysis.RESULTS：There were 10 common peaks in HPLC fingerprints for 14 batches of the leaves of C.acuminate.And the similarity of 13 batches of the leaves of C.acuminate was greater than 0.90，and that of another one was less than 0.90.The leaves of C. acuminate were classified into 3 groups.CONCLUSIONS：The established fingerprint can provide reference for identification and quality evaluation of the leaves of C.acuminate.

The leaves of Camptotheca acuminante；Fingerprint；Cluster analysis；HPLC

R917

A

1001-0408（2017）24-3412-03

2017-01-18

2017-04-26）

（編輯：張 靜）

貴州省中藥材、民族藥材質量標準研究課題（No. DBXZYC52032）

＊主管中藥師。研究方向：中藥、中成藥質量標準。E-mail：19889504@qq.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.24.29