頂空氣相色譜法同時測定法匹拉韋原料藥中5種有機溶劑的殘留量Δ

劉葵葵，鄧玉曉，邢學敏，王 伶（山東省藥學科學院化學藥物重點實驗室，濟南 250101）

頂空氣相色譜法同時測定法匹拉韋原料藥中5種有機溶劑的殘留量Δ

劉葵葵＊，鄧玉曉，邢學敏，王 伶#（山東省藥學科學院化學藥物重點實驗室，濟南 250101）

目的：建立同時測定法匹拉韋原料藥中乙醇、丙酮、乙酸乙酯、N，N-二異丙基乙胺、甲苯5種有機溶劑殘留量的方法。方法：采用頂空氣相色譜法。色譜柱為DB-624毛細管柱，程序升溫，進樣口溫度為220℃，檢測器為氫火焰離子化檢測器，檢測器溫度為250℃，載氣為氮氣，載氣流速為2.0 mL/min，分流比為10∶1，頂空平衡溫度為80℃，平衡時間為20 min，頂空進樣量為1 mL。結果：乙醇、丙酮、乙酸乙酯、N，N-二異丙基乙胺和甲苯檢測質量濃度線性范圍分別為10.0～501.4 μg/mL（r＝0.999 9）、10.0～501.4 μg/mL（r＝0.999 9）、10.1～502.6 μg/mL（r＝0.999 9）、0.2～11.4 μg/mL（r＝0.999 9）、1.8～89.4 μg/mL（r＝0.999 7）；定量限分別為5.3、3.4、5.2、6.1、20.4 μg/mL，檢測限分別為1.4、1.1、1.3、1.6、5.9 μg/mL；精密度試驗的RSD＜4.0%，穩定性、重復性試驗中只檢出丙酮，其RSD＜4.0%；加樣回收率分別為96.61%～99.70%（RSD＝1.01%，n＝9）、95.81%～99.50%（RSD＝1.29%，n＝9）、96.42%～99.76%（RSD＝1.24%，n＝9）、96.36%～99.30%（RSD＝1.19%，n＝9）、97.00%～99.51%（RSD＝0.82%，n＝9）。結論：該方法簡單、準確、重復性好，可用于法匹拉韋原料藥中5種有機溶劑殘留量的同時測定。

氣相色譜法；法匹拉韋；有機溶劑；殘留量；乙醇；丙酮；乙酸乙酯；N，N-二異丙基乙胺；甲苯

法匹拉韋（Favipiravir）為日本富士膠片公司旗下富山化學工業公司研發的流感治療藥物，2011年3月在日本完成Ⅲ期臨床試驗，2014年3月在日本批準上市[1]。法匹拉韋是一種病毒RNA聚合酶抑制劑，能夠阻斷病毒RNA的合成，從而起到抗病毒的作用，同時法匹拉韋對哺乳動物細胞內的RNA合成不會產生任何抑制作用，因此是一種安全有效的抗病毒藥物。由于其特定的作用機制，除流感病毒外，法匹拉韋還可以對抗其他多種RNA病毒，如黃熱病、埃博拉等[2-4]。

目前已有相關文獻報道了法匹拉韋制劑中相關含量的測定[5]，但尚未見有關法匹拉韋原料藥中有機溶劑殘留量測定的報道；且根據法匹拉韋的合成工藝，生產中分別使用了N，N-二異丙基乙胺、乙酸乙酯、甲苯、丙酮和乙醇等有機溶劑。為確保藥品的安全、有效和質量可控，筆者采用頂空氣相色譜法建立了同時測定法匹拉韋原料藥中上述5種有機溶劑殘留量的方法[6-8]。

1 材料

1.1 儀器

6890N型氣相色譜儀，包含氫火焰離子化檢測器（FID）和7697A頂空自動進樣器（美國Agilent公司）；BS 210S型十萬分之一電子分析天平（德國Sartorius公司）；ZUPT-I-20T型超純水機（臺灣艾柯公司）。

1.2 藥品與試劑

法匹拉韋原料藥（山東省藥學科學院化學藥物重點實驗室自制，批號：20151001、20151002、20151003）；乙醇對照品（批號：20150611：純度：99.8%）、丙酮對照品（批號：20140116：純度：99.7%）、乙酸乙酯對照品（批號：20150813：純度：99.6%）、N，N-二異丙基乙胺對照品（批號：20150507：純度：99.5%）、甲苯對照品（批號：20150106：純度：99.8%）均購自國藥集團化學試劑有限公司；N，N-二甲基甲酰胺為色譜純，水為純化水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：DB-624毛細管柱（30 m×0.53 mm，3.0 μm）；升溫程序：初始溫度為50℃，保持3 min，以10℃/min升溫至180℃，保持2 min；進樣口溫度：220℃；檢測器：FID；檢測器溫度：250℃；載氣：氮氣；載氣流速：2.0 mL/min；分流比：10∶1；頂空平衡溫度：80℃；平衡時間：20 min；頂空進樣量：1 mL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 分別稱取乙醇、丙酮、乙酸乙酯、N，N-二異丙基乙胺、甲苯對照品適量，置于同一100 mL量瓶中，加N，N-二甲基甲酰胺溶解并定容，搖勻，制成每1 mL含乙醇500 μg、丙酮500 μg、乙酸乙酯500 μg、N，N-二異丙基乙胺11.4 μg、甲苯89 μg的混合對照品貯備液。精密量取上述混合對照品貯備液5 mL，置于50 mL量瓶中，加N，N-二甲基甲酰胺稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液 精密稱取樣品0.5 g，置于10 mL頂空瓶中，精密加入N，N-二甲基甲酰胺5 mL，密封，振搖使溶解，即得。

2.2.3 空白對照溶液 精密量取N，N-二甲基甲酰胺5 mL作為空白對照溶液，置于頂空瓶中，密封。

2.3 系統適用性試驗

精密量取“2.2”項下混合對照品溶液、供試品溶液和空白對照溶液各適量，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜，詳見圖1。由圖1可知，在該色譜條件下，各成分均能達到基線分離，分離度＞6；理論板數以乙醇峰計為58 688，保留時間為6.862 min。結果表明，其他成分對測定無干擾。

2.4 線性關系考察

精密量取“2.2.1”項下混合對照品貯備液1、2、5、10、25 mL，分別置于50 mL量瓶中，加N，N-二甲基甲酰胺稀釋至刻度，搖勻，即得系列混合對照品溶液。精密量取上述系列混合對照品溶液各5 mL，分別置于頂空瓶中，密封，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以待測成分質量濃度（x，μg/mL）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，回歸方程與線性范圍見表1。

圖1 氣相色譜圖Fig 1 GC chromatograms

表1 回歸方程與線性范圍Tab 1 Regression equations and linear ranges

2.5 定量限（LOQ）與檢測限（LOD）考察

取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，倍比稀釋，按“2.1”項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。當信噪比為10∶1時，得LOQ；當信噪比為3∶1時，得LOD。結果，乙醇、丙酮、乙酸乙酯、N，N-二異丙基乙胺、甲苯的LOQ分別為5.3、3.4、5.2、6.1、20.4 μg/mL，LOD分別為1.4、1.1、1.3、1.6、5.9 μg/mL。

2.6 精密度試驗

取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果，乙醇、丙酮、乙酸乙酯、N，N-二異丙基乙胺、甲苯峰面積的RSD分別為3.5%、2.6%、1.9%、3.4%、2.8%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩定性試驗

取“2.2.2”項下供試品溶液（批號：20151001）適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、8 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，只檢出丙酮，其峰面積的RSD＝2.4%（n＝5），表明供試品溶液在室溫下放置8 h內穩定性良好。

2.8 重復性試驗

取樣品（批號：20151001）適量，共6份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算待測有機溶液殘留量。結果，只檢出丙酮，其殘留量平均值為0.04%，RSD＝1.86%（n＝6），表明本方法重復性良好。

2.9 加樣回收率試驗

精密稱取樣品（批號：20151001）適量，共9份，各置于10 mL量瓶中，分別加入低、中、高質量的待測有機溶劑對照品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結果見表2。

2.10 樣品有機溶劑殘留量測定

取3批樣品（批號：20151001、20151002、20151003）各適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并以外標法計算待測有機溶劑的殘留量。結果，3批樣品中均只檢出丙酮，殘留量分別為0.04%、0.03%、0.05%（n＝3）。

3 討論

3.1 進樣方式的選擇

雖然直接進樣相比頂空進樣操作簡單，但是本研究的待測有機溶劑在高溫條件下可分解出揮發性產物，干擾溶劑的測定，故本研究采用頂空進樣[9-10]。

3.2 色譜柱的選擇

筆者考察了不同極性的毛細管柱（DB-1、DB-wax、HP-5、DB-624），結果采用HP-5毛細管柱進行測定時，乙醇和丙酮不能完全分離；采用DB-1、DB-wax毛細管柱進行測定時，N，N-二異丙基乙胺峰對稱性差；采用DB-624毛細管柱進行測定時，待測有機溶劑峰之間的分離度符合要求，峰對稱性良好[10]。因此，選擇DB-624毛細管柱為本試驗的色譜柱。

3.3 溶劑的選擇

法匹拉韋的水溶性較差，待測有機溶劑甲苯也不溶于水。頂空氣相色譜法常用溶劑為水、N，N-二甲基甲酰胺和二甲基亞砜，經考察法匹拉韋在N，N-二甲基甲酰胺中溶解性比在二甲基亞砜中好，且N，N-二甲基甲酰胺在待測有機溶劑之后出峰，對待測有機溶劑無干擾，故選用N，N-二甲基甲酰胺作為本試驗的溶劑。

3.4 頂空平衡溫度的考察

本研究比較了不同頂空平衡溫度（70、80、90℃），結果發現頂空平衡溫度為80℃時待測有機溶劑峰的靈敏度與重復性最佳，且樣品完全溶解，故選擇80℃作為本試驗的頂空平衡溫度。

3.5 LOD的確定

根據2015年版《中國藥典》（四部）“通則0861”的要求，乙醇、丙酮、乙酸乙酯和甲苯的檢測限分別為0.5%、0.5%、0.5%、0.089%，未規定N，N-二異丙基乙胺的LOD。《歐洲藥品質量管理局（EDQM）關于化學純度和微生物質量方面的文檔要求》規定了N，N-二異丙基乙胺的最大日用量為38.8 mg，且其LOD為0.388%，因此可將該原料藥中的N，N-二異丙基乙胺的LOD暫定為0.388%[11]。

表2 加樣回收率試驗結果（n＝9）Tab 2 Results of recovery tests（n＝9）

綜上所述，本方法簡單、準確、重復性好，可用于法匹拉韋原料藥中5種有機溶劑殘留量的同時測定。

[1] 劉翠艷，張園園，利超，等.HPLC法測定法匹拉韋片的含量[J].中國藥師，2005，18（7）：1231-1233.

[2] 魏娜，王彩霞，劉喜寶，等.抗病毒新藥法匹拉韋研究進展[J].醫藥導報，2016，35（2）：168-170.

[3] 趙旭，周辛波，鐘武，等.抗病毒藥物：法匹拉韋[J].臨床藥物治療雜志，2015，13（4）：16-20.

[4] 裴詩恩，黃穎琦，吳淑曼，等.基于靜電勢電荷的抗擊埃博拉病毒新藥物法匹拉韋及其衍生物水溶解度logS值預測[J].當代化工，2017，46（1）：33-34.

[5] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：四部[S].2015年版.北京：中國醫藥科技出版社，2015：105-110.

[6] 李眉，馬玉楠.簡介ICH關于藥品中溶劑殘留的指導原則[J].中國藥師，1998，1（3）：119-120.

[7] 陸燁，夏宇沁，昌軍，等.毛細管氣相色譜法測定13種有機溶劑殘留[J].復旦學報（醫學版），2013，40（2）：222-226.

[8] 王建，王紅波，王知堅.GC測定鹽酸克林霉素棕櫚酸酯中的9種溶劑殘留[J].中國現代應用藥學，2012，29（9）：829-833.

[9] 吳春麗，張俊霞，史云濤，等.頂空毛細管氣相色譜法測定來曲唑原料中有機溶劑殘留量[J].中國藥房，2010，21（17）：1601-1603.

[10] 章為，李文波，李曉燕，等.頂空氣相色譜法同時測定甲苯磺酸妥舒沙星原料藥中6種有機溶劑的殘留量[J].中國藥房，2017，28（6）：847-850.

[11] 張雅軍，孫會敏，李科，等.氣相色譜法測定阿德福韋酯中的10種殘留溶劑[J].藥物分析雜志，2005，25（6）：660-662.

Simultaneous Determination of 5 Organic Solvents in Favipiravir by Headspace GC

LIU Kuikui，DENG Yuxiao，XING Xuemin，WANG Ling（Key Laboratory for Chemical Drug Research，Shandong Academy of Pharmaceutical Science，Jinan 250101，China）

OBJECTIVE：To establish a method for simultaneous determination of 5 kinds residual ethanol，acetone，ethylacetate，N，N-diisopropylethylamine and toluene in favipiravir.METHODS：Headspace GC was adopted.The determination was performed on DB-624 capillary column，temperature programmed.The inlet temperature was 220℃，and detector was flame ionization detector with temperature of 250℃.Nitrogen was used as carrier gas at flow rate of2.0 mL/min，split ratio was 10∶1，headspace equilibrium temperature was 80℃，equilibrium time was 20 min and headspace sample size was 1 mL.RESULTS：The linear range was 10.0-501.4 μg/mL for ethanol（r＝0.999 9），10.0-501.4 μg/mL for acetone（r＝0.999 9），10.1-502.6 μg/mL for ethylacetate（r＝0.999 9），0.2-11.4 μg/mL for N，N-diisopropylethylamine（r＝0.999 9）and 1.8-89.4 μg/mL for acetone（r＝0.999 7）. The limits of quantification were 5.3，3.4，5.2，6.1 and 20.4μg/mL，and the limits of detection were 1.4，1.1，1.3，1.6，5.9μg/ mL.RSD of precision test was lower than 4.0%，and RSDs of acetone in stability and reproducibility tests were both lower than 4.0%.The recoveries were 96.61%-99.70%（RSD＝1.01%，n＝9），95.81%-99.50%（RSD＝1.29%，n＝9），96.42%-99.76%（RSD＝1.24%，n＝9），96.36%-99.30%（RSD＝1.19%，n＝9），97.00%-99.51%（RSD＝0.82%，n＝9）.CONCLUSIONS：The method is simple，accurate，reproducible and can be used for simultaneous determination of 5 organic solvents in favipiravir.

Gas chromatography；Favipiravir；Organic solvents；Residual；Ethanol；Acetone；Ethylacetate；N，N-diisopropylethylamine；Toluene

R927.2

A

1001-0408（2017）24-3415-04

2017-02-06

2017-04-29）

（編輯：劉 柳）

山東省自然科學基金資助項目（No.ZR2013HQ043）

＊工程師。研究方向：新藥研發。電話：0531-88562280。E-mail：Srhlksdu2008@sina.com

#通信作者：高級工程師，碩士。研究方向：新藥研發。電話：0531-88562280。E-mail：lw6624@126.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.24.30