HPLC法同時測定復方甲硝唑克林霉素乳膏中4種成分的含量Δ

范義鳳，王 欽（南通大學附屬醫院藥學部，江蘇南通 226001）

HPLC法同時測定復方甲硝唑克林霉素乳膏中4種成分的含量Δ

范義鳳＊，王 欽（南通大學附屬醫院藥學部，江蘇南通 226001）

目的：建立同時測定復方甲硝唑克林霉素乳膏中甲硝唑、鹽酸克林霉素、螺內酯、維生素B6含量的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Diamonsil C18，流動相為乙腈-[0.68%磷酸氫二鉀溶液（含1%三乙胺）]（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，檢測波長為210 nm，柱溫為25℃，進樣量為20 μL。結果：甲硝唑、鹽酸克林霉素、螺內酯、維生素B6檢測質量濃度線性范圍分別為20.0～120.0 μg/mL（r＝0.999 9）、10.0～60.0 μg/mL（r＝0.999 1）、4.0～24.0 μg/mL（r＝0.999 4）、10.0～60.0 μg/mL（r＝0.999 4）；定量限分別為13.06、7.36、2.43、6.42 μg/mL，檢測限分別為4.18、1.82、0.76、1.79 μg/mL；精密度、穩定性、重復性試驗的RSD＜2.0%；回收率分別為98.97%～100.91%（RSD＝0.79%，n＝9）、99.02%～101.80%（RSD＝1.03%，n＝9）、98.18%～101.05%（RSD＝1.01%，n＝9）、98.75%～101.36%（RSD＝0.87%，n＝9）。結論：該方法簡便、快速、結果準確，可用于復方甲硝唑克林霉素乳膏中甲硝唑、鹽酸克林霉素、螺內酯、維生素B6含量的同時測定。

甲硝唑；鹽酸克林霉素；螺內酯；維生素B6；高效液相色譜法；含量

1 材料

1.1 儀器

1100型HPLC儀，包括四元泵、紫外檢測器、手動進樣器、色譜工作站、在線真空脫氣機（美國Agilent公司）；Cary-300型紫外分光光度計（美國Varian公司）；BP211D型十萬分之一電子天平（德國Sartorius公司）；Milli-Q Advantage A10型超純水儀（美國Millipore公司）。

1.2 藥品與試劑

復方甲硝唑克林霉素乳膏（南通大學附屬醫院自制，批號：160407、160412、160510，規格：20 g/盒）；甲硝唑對照品（批號：0191-9804，純度：99.6%）、鹽酸克林霉素對照品（批號：130422-200702，純度：99.9%）、螺內酯對照品（批號：100193-14189，純度：99.8%）、維生素B6對照品（批號：100116-13470，純度：99.8%）均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純，磷酸氫二鉀、乙醇為分析純，水為純化水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-[0.68%磷酸氫二鉀溶液（含1%三乙胺，B）]，梯度洗脫（洗脫程序見表1）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：210 nm；柱溫：25℃；進樣量：20 μL。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Gradient elution process

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 精密稱取甲硝唑對照品100 mg、鹽酸克林霉素對照品50 mg、螺內酯對照品20 mg、維生素B6對照品50 mg，置于同一100 mL量瓶中，加50%乙醇溶液適量，于80℃水浴加熱20 min使溶解，放至室溫，再加50%乙醇溶液定容，搖勻，作為混合對照品貯備液。取上述混合對照品貯備液5 mL，置于25 mL量瓶中，加流動相定容，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液 精密稱取樣品5 g，置于100 mL燒杯中，加50%乙醇溶液于80℃水浴加熱20 min，回流提取3次，每次30 mL，提取液轉移至100 mL量瓶中，加50%乙醇溶液定容，搖勻，濾過，取續濾液5 mL，置于25 mL量瓶中（測定甲硝唑含量時取續濾液2 mL，置于25 mL量瓶中），加流動相定容，搖勻，即得。

2.2.3 陰性對照溶液 按樣品的制備工藝和處方比例，取空白輔料適量，按“2.2.2”項下方法制備陰性對照溶液。

2.3 系統適用性試驗

精密量取“2.2”項下混合對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各適量，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜，詳見圖1。由圖1可知，在該色譜條件下各成分均能達到基線分離，分離度＞1.5；理論板數以甲硝唑、鹽酸克林霉素、螺內酯、維生素B6峰計均＞3 360，保留時間分別為3.5、11.7、13.5、1.6 min。結果表明，其他成分對測定無干擾。

圖1 高效液相色譜法Fig 1 HPLC chromatograms

2.4 線性關系考察

精密量取“2.2.1”項下混合對照品貯備液2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、8.0、10.0、12.0 mL，分別置于100 mL量瓶中，加流動相定容，搖勻，即得系列混合對照品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以待測成分質量濃度（x，μg/mL）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，回歸方程與線性范圍見表2。

表2 回歸方程與線性范圍Tab 2 Regression equations and linear ranges

2.5 定量限（LOQ）與檢測限（LOD）考察

取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，倍比稀釋，按“2.1”項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。當信噪比為10∶1時，得LOQ；當信噪比為3∶1時，得LOD，結果見表3。

表3 LOQ與LOD測定結果（μg/mL）Tab 3 Results of LOQ and LOD（μg/mL）

2.6 精密度試驗

精密量取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，甲硝唑、鹽酸克林霉素、螺內酯、維生素B6峰面積的RSD分別為0.71%、0.59%、0.42%、0.87%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩定性試驗

精密量取“2.2.2”項下供試品溶液（批號：160412）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、12 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，甲硝唑、鹽酸克林霉素、螺內酯、維生素B6峰面積的RSD分別為0.91%、1.23%、0.87%、1.56%（n＝5），表明供試品溶液在室溫下放置12 h內穩定性良好。

2.8 重復性試驗

精密稱取同一批樣品（批號：160412）適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，甲硝唑、鹽酸克林霉素、螺內酯、維生素B6峰面積的RSD分別為0.65%、0.89%、0.77%、0.93%（n＝6），表明本方法重復性良好。

2.9 回收率試驗

按樣品的處方比例取空白輔料適量，共9份，分別置于100 mL燒杯中，各加入低、中、高質量的甲硝唑、鹽酸克林霉素、螺內酯、維生素B6對照品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算回收率，結果見表4。

2.10 樣品含量測定

取3批樣品各適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量，結果見表5。

表4 回收率試驗結果（n＝9）Tab 4 Results of recovery test（n＝9）

表5 樣品含量測定結果（n＝3，%）Tab 5 Results of contents determination of samples（n＝3，%）

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

在200～400 nm波長范圍內進行掃描，發現甲硝唑的最大吸收波長為310 nm，螺內酯的最大吸收波長為237 nm，維生素B6的最大吸收波長為290 nm，鹽酸克林霉素的最大吸收波長為210 nm，且4種成分均有末端吸收，因此綜合考慮選擇最靠近末端的210 nm作為本試驗的檢測波長。

3.2 流動相和洗脫方式的選擇

本課題組曾選擇乙腈-[0.68%磷酸氫二鉀溶液（含1%三乙胺）]（20∶80，V/V）為流動相進行等度洗脫，結果甲硝唑和維生素B6分離度較好，但鹽酸克林霉素和螺內酯分離度較差；而調整流動相比例為（60∶40，V/V）再進行等度洗脫，鹽酸克林霉素和螺內酯出峰時間比較合適且分離度符合要求，但甲硝唑和維生素B6出峰時間太快，從而無法將甲硝唑、維生素B6分離。最后改變洗脫方式，采用梯度洗脫，結果上述4種成分的色譜分離均較好。因此，本試驗以乙腈-[0.68%磷酸氫二鉀溶液（含1%三乙胺）]為流動相進行梯度洗脫。

3.3 提取溶劑和提取次數的選擇

本課題組曾考察了不同體積分數的提取溶劑（20%、30%、40%、50%、70%乙醇溶液），以及提取次數（1、2、3、4、5次），結果發現采用50%乙醇溶液提取3次、40%乙醇溶液提取5次能將4種待測成分提取完全。為了減少提取次數，方便試驗操作，本研究最終采用50%乙醇溶液于80℃水浴加熱20 min，回流提取3次的方式進行樣品的提取。

綜上所述，本方法簡便、快速、結果準確，可用于復方甲硝唑克林霉素乳膏中甲硝唑、鹽酸克林霉素、螺內酯、維生素B6含量的同時測定。

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Simultaneous Determination of 4 Components in Compound Metronidazole Clindamycin Cream by HPLC

FAN Yifeng，WANG Qin（Dept.of Pharmacy，the Affiliated Hospital of Nantong University，Jiangsu Nantong 226001，China）

OBJECTIVE：To establish the method for simultaneous determination of the content of metronidazole，clindamycin hydrochloride，spironolactone and vitamin B6in Compound metronidazole clindamycin cream.METHODS：HPLC method was adopted.The determination was performed on Diamonsil C18column with mobile phase consisted of acetonitrile-[0.68%dipotassium hydrogen phosphate solution（containing 1%triethylamine）]（gradient elution）at the flow rate of 1.0 mL/min.The detection wavelength was set at 210 nm，and column temperature was 25℃.The sample size was 20 μL.RESULTS：The linear ranges of metronidazole，clindamycin hydrochloride，spironolactone and vitamin B6were respectively 20.0-120.0 μg/mL（r＝0.999 9），10.0-60.0 μg/mL（r＝0.999 1），4.0-24.0 μg/mL（r＝0.999 4），10.0-60.0 μg/mL（r＝0.999 4）.The quantitative limits were respectively 13.06，7.36，2.43，6.42 μg/mL.The detection limits were 4.18，1.82，0.76，1.79 μg/mL.RSDs of the precision，stability，repeatability tests were all less than 2%.The recovery rates were respectively 98.97%-100.91%（RSD＝0.79%，n＝9），99.02%-101.80%（RSD＝1.03%，n＝9），98.18%-101.05%（RSD＝1.01%，n＝9）and 98.75%-101.36%（RSD＝0.87%，n＝9）.CONCLUSIONS：The method is simple，rapid，accurate and can be used for the determination of metronidazole，clindamycin hydrochloride，spironolactone and vitamin B6in Compound clindamycin metronidazole cream.

Metronidazole；Clindamycin hydrochloride；Spironolactone；Vitamin B6；HPLC；Content復方甲硝唑克林霉素乳膏為我院自行研制的院內制劑，其主要成分為甲硝唑、鹽酸克林霉素、螺內酯、維生素B6，主要用于青少年尋常型痤瘡的治療。尋常型痤瘡主要由體內雄性激素水平過高、皮脂腺功能亢進、痤瘡丙酸桿菌感染等引起[1]。甲硝唑和鹽酸克林霉素可有效抑制痤瘡桿菌的生長[2-4]，螺內酯可干擾皮膚雄激素受體使皮脂腺分泌明顯減少[5]，維生素B6在治療尋常型痤瘡方面也具有一定的療效[6-7]。且目前尚無同時測定該制劑中甲硝唑、鹽酸克林霉素、螺內酯、維生素B64種主要成分含量的報道。鑒于此，本課題組參考相關文獻[8-11]，采用高效液相色譜法（HPLC）建立了同時測定該制劑中上述4種成分含量的方法，以期為完善該制劑的質量控制提供參考。

R927.2

A

1001-0408（2017）24-3418-04

2017-01-02

2017-05-10）

（編輯：劉 柳）

江蘇省藥學會—奧賽康醫院藥學基金立項課題（No.A201616）

＊主任藥師。研究方向：醫院藥學。電話：0513-85052282。E-mail：fyfeng606@126.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.24.31